洪建芬，陸月平，張翔珍

(浙江省樂清市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 樂清 325608)

iNKT細(xì)胞在自發(fā)性早產(chǎn)發(fā)動(dòng)機(jī)制中的作用研究

洪建芬，陸月平，張翔珍

(浙江省樂清市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 樂清 325608)

目的 探討恒定型自然殺傷T細(xì)胞(iNKT)在自發(fā)性早產(chǎn)發(fā)動(dòng)中的作用。方法 選擇自發(fā)性早產(chǎn)孕婦40例(早產(chǎn)組)和正常孕婦40例(對(duì)照組)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛻膜組織中iNKT細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞的表達(dá)；采用RT-PCR法檢測(cè)穿孔素(perforin)mRNA的表達(dá)。結(jié)果 早產(chǎn)組蛻膜組織中iNKT細(xì)胞和NK細(xì)胞的百分比分別為(1.05±0.29)%和(24.21±9.32)%，均顯著高于對(duì)照組iNKT細(xì)胞(0.48±0.17)%和NK細(xì)胞(14.97±6.05)%的百分比(t值分別為2.267和2.094，均P<0.05)；經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析顯示，早產(chǎn)組iNKT細(xì)胞和NK細(xì)胞呈明顯的正相關(guān)(r=0.634，P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示，早產(chǎn)組穿孔素mRNA的表達(dá)也顯著高于對(duì)照組(t=2.086，P<0.05)。結(jié)論 iNKT細(xì)胞可能通過產(chǎn)生穿孔素并促進(jìn)NK細(xì)胞活化，參與自發(fā)性早產(chǎn)的免疫發(fā)病機(jī)制。

恒定型自然殺傷T細(xì)胞；自發(fā)性早產(chǎn)；免疫；作用機(jī)制

早產(chǎn)是常見的孕中晚期并發(fā)癥，其發(fā)生率占妊娠的5%～15%[1]。早產(chǎn)的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，以往的研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染、子宮病理性擴(kuò)張、宮頸口松弛、蛻膜出血以及各種妊娠激素水平異常等因素均可參與早產(chǎn)的發(fā)生。近年來，越來越多的研究者認(rèn)識(shí)到免疫系統(tǒng)的激活，特別是固有免疫的活化在早產(chǎn)發(fā)生中占有重要地位[2-3]。恒定型自然殺傷T細(xì)胞(invariant natural killer T-cells，iNKT)是一類存在于人類與小鼠蛻膜組織中重要的固有免疫細(xì)胞，可通過活化自然殺傷(NK)細(xì)胞，產(chǎn)生穿孔素(perforin)及其他免疫因子，發(fā)揮清除母-胎界面病原體的功能。2006年Boyson研究小組發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞參與了早產(chǎn)的發(fā)病，但機(jī)理尚未明確。本研究主要通過檢測(cè)早產(chǎn)孕婦體內(nèi)iNKT細(xì)胞水平的變化，及下游免疫細(xì)胞NK細(xì)胞和穿孔素的變化，以探討iNKT細(xì)胞在早產(chǎn)發(fā)病中的免疫學(xué)作用，為臨床預(yù)防或早期診斷早產(chǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年6月至2014年6月在樂清市第二人民醫(yī)院產(chǎn)科經(jīng)陰道分娩的早產(chǎn)患者40例(胎膜早破23例，無胎膜早破17例)設(shè)為早產(chǎn)組，孕齡為30～36+6周，早產(chǎn)組孕婦入組標(biāo)準(zhǔn)：①無宮內(nèi)感染及合并絨毛膜羊膜炎；②無下生殖道或泌尿道感染；③未合并前置胎盤及胎盤早剝；④無其他明確可引致早產(chǎn)的因素。另隨機(jī)選擇同期在本院正常經(jīng)陰道分娩的足月孕婦40例設(shè)為對(duì)照組，孕齡為37～41周。兩組孕婦均為初產(chǎn)婦，均為單胎、頭位，孕期血糖、血壓正常，無妊娠合并癥及內(nèi)外科并發(fā)癥，無免疫性疾病，無免疫性藥物治療史。早產(chǎn)組和對(duì)照組孕婦的平均年齡分別為(26.3±4.1)歲和(25.8±3.5)歲，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.245，P=0.271)。

1.2 標(biāo)本的采集和單細(xì)胞懸液的制備

取兩組孕婦經(jīng)陰道娩出胎盤約1.0cm×1.0cm×1.0cm的蛻膜組織塊，冰生理鹽水洗凈血跡。剪取少部分組織予OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋，液氮速凍，置-80℃存放，用于后續(xù)RT-PCR檢測(cè)。其余組織剪碎并經(jīng)50μm孔徑的尼龍網(wǎng)過濾后，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，加磷酸鹽緩沖液(PBS)離心洗滌后，以1×106/mL的濃度重懸細(xì)胞，送流式細(xì)胞檢驗(yàn)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)

將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液置于流式管內(nèi)，將熒光抗體PerCP-CD3、FITC-NK1.1、APC-CD56和PE-CD16(BD，美國(guó))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色，4℃避光20min，洗去游離抗體后，100μL重懸，在流式細(xì)胞儀(LSR-Ⅱ，美國(guó)Beckman)下檢測(cè)并計(jì)數(shù)CD3+NK1.1+的NKT細(xì)胞和CD16+CD56+的NK細(xì)胞。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR

取50～75mg凍存的蛻膜組織置于研缽內(nèi)，以研棒將組織碾碎；嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒(GIAGEN，德國(guó))說明書的要求提取總RNA。一步法RT-PCR：反應(yīng)總體系為50μL，其中組織總RNA 2μL，10×PCR Buffer 5μL，50mmol/L MgSO41.5μL，10mmol/L dNTP 1μL，穿孔素和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上下游引物各0.5μL，莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水補(bǔ)足50μL。反應(yīng)條件：42℃ 30min，95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在1.0%瓊脂糖凝膠中于120V下進(jìn)行電泳檢測(cè)，并采用Biocapt凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。穿孔素上游引物：5'-ATC TCA CCT CAT GGG AAC C-3'；穿孔素下游引物：5'-CCA TTA ACG ACC TGC TGT TC-3'；GAPDH上游引物：5'-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT G-3'；GAPDH下游引物：5'-TCC TTG GAG GCC ATG TAG G-3'。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組恒定型自然殺傷T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，早產(chǎn)組孕婦蛻膜中iNKT細(xì)胞和NK細(xì)胞均顯著高于對(duì)照組的正常妊娠孕婦，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。對(duì)早產(chǎn)組iNKT細(xì)胞和NK細(xì)胞行Spearman秩相關(guān)分析顯示，iNKT細(xì)胞和NK細(xì)胞呈明顯的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r=0.634，P<0.05。

2.2 兩組穿孔素的比較

經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，早產(chǎn)組孕婦蛻膜中穿孔素mRNA的(穿孔素/GAPDH)表達(dá)為9.537，明顯高于對(duì)照組正常孕婦的5.989，t=2.086，P<0.05，見圖1。

圖1 兩組穿孔素mRNA表達(dá)比較結(jié)果

Fig.1 Comparison of perforin mRNA expression between two groups

3 討論

3.1 早產(chǎn)與免疫

胎兒在母體子宮內(nèi)作為一種半同種異體移植物存在，妊娠期間胎兒不被母體免疫系統(tǒng)排斥的重要原因是母體免疫耐受的作用。母胎免疫耐受的實(shí)質(zhì)是母體免疫細(xì)胞對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞呈低或無反應(yīng)性，這種耐受一旦被打破，則可能誘發(fā)早產(chǎn)的發(fā)動(dòng)。部分自發(fā)性早產(chǎn)與宮內(nèi)感染、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)，但也有部分自發(fā)性早產(chǎn)在臨床無明顯感染征象，在這些早產(chǎn)孕婦體內(nèi)，免疫系統(tǒng)的異常激活及功能紊亂在早產(chǎn)的發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用。固有免疫細(xì)胞對(duì)早產(chǎn)的影響是21世紀(jì)以來較新的發(fā)現(xiàn)，而關(guān)于iNKT細(xì)胞是目前多數(shù)研究的焦點(diǎn)。

3.2 恒定型自然殺傷T細(xì)胞與免疫

NKT細(xì)胞最早由Fowlker等于1987年在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，之后于20世紀(jì)90年代末在人類免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)[4]。NKT細(xì)胞來源于胸腺，在體內(nèi)多種器官、組織中均有分布，如：肝臟、骨髓、脾、臍血等。該細(xì)胞亞群同時(shí)具有傳統(tǒng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的某些表型特征，其細(xì)胞表面既表達(dá)T細(xì)胞抗原受體(TCR)又表達(dá)NK1.1[5]。iNKT細(xì)胞被認(rèn)為是經(jīng)典的NKT細(xì)胞，可識(shí)別由類似于I型主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)糖蛋白CDld提呈的鞘糖酯類抗原，發(fā)揮增強(qiáng)免疫反應(yīng)或抑制免疫反應(yīng)的雙向免疫調(diào)節(jié)功能，在抗腫瘤、抗感染、器官移植的抗排斥以及控制自身免疫性疾病的發(fā)展中起重要作用[6]。

3.3 恒定型自然殺傷T細(xì)胞與妊娠

iNKT細(xì)胞在妊娠的母體中也具有雙向免疫功能，其表現(xiàn)為iNKT細(xì)胞可以通過清除母-胎界面的病原體而起到維持妊娠的作用，但其在清除病原體時(shí)，活化的iNKT細(xì)胞又可通過直接產(chǎn)生穿孔素或間接活化NK細(xì)胞，影響內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)而導(dǎo)致流產(chǎn)或早產(chǎn)[7]。有研究顯示，妊娠早期的母體內(nèi)iNKT細(xì)胞比例升高，誘導(dǎo)Th細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)血栓素酶的活化并作用于胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞，導(dǎo)致凝血而阻斷母胎血供；同時(shí)還可活化和吸引中性粒細(xì)胞攻擊胚胎和胎盤組織，引發(fā)流產(chǎn)[8]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)，在小鼠動(dòng)物模型中去除iNKT細(xì)胞后，其早產(chǎn)現(xiàn)象顯著降低。另有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)孕婦較正常妊娠婦女蛻膜iNKT細(xì)胞和NK細(xì)胞明顯增多；子癇前期孕婦外周血中NKT細(xì)胞比例及穿孔素表達(dá)增加[10]。本研究則發(fā)現(xiàn)，在早產(chǎn)孕婦蛻膜組織中，iNKT細(xì)胞和NK細(xì)胞的百分比、穿孔素mRNA均較正常妊娠孕婦明顯增加；而前述已有研究[7]證實(shí)iNKT細(xì)胞可以通過表達(dá)穿孔素直接殺傷細(xì)胞，也可通過活化NK細(xì)胞影響妊娠婦女的內(nèi)分泌系統(tǒng)。因此認(rèn)為iNKT細(xì)胞是妊娠中的關(guān)鍵物質(zhì)，在早產(chǎn)孕婦體內(nèi)iNKT細(xì)胞數(shù)量的異常增加可能是導(dǎo)致早產(chǎn)發(fā)病的重要免疫因素；而iNKT細(xì)胞參與早產(chǎn)的發(fā)生是通過產(chǎn)生穿孔素和活化下游NK細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。

總之，iNKT細(xì)胞是維持妊娠的一把雙刃劍，這類細(xì)胞在引起自發(fā)性早產(chǎn)的免疫機(jī)制中占有重要的地位，值得引起研究者及臨床醫(yī)生高度重視。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：韓 蓁]

Role of iNKT cells in the launch of spontaneous preterm labor

HONG Jian-fen, LU Yue-ping, ZHANG Xiang-zhen

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,SecondPeople’sHospitalofLeqing,ZhejiangLeqing325608,China)

Objective To investigate the role of invariant natural killer T-cells (iNKT) cells in the launch of spontaneous preterm labor. Methods Totally 40 preterm pregnant women (preterm group) and 40 normal pregnant women (control group) were selected. Flow cytometry was used to detect iNKT cells and NK cells in decidual tissue, and RT-PCR was used to detect the expression of perforin mRNA. Results The percentages of iNKT cells and NK cells in decidual tissue in the preterm group were (1.05±0.29)% and (24.21±9.32)%, respectively, which were significantly higher than those of iNKT cells (0.48±0.17)% and NK cells (14.97±6.05)% in the control group (tvalue was 2.267 and 2.094, respectively, bothP<0.05). Spearman rank correlation analysis showed that iNKT cells was positively related with NK cells in the preterm group (r=0.634,P<0.05). RT-PCR results revealed that the expression of perforin mRNA in the preterm group was significantly higher than that in the control group (t=2.086,P<0.05). Conclusion INKT cells may take part in the immune pathogenesis of spontaneous preterm labor through the production of perforin and the promotion of NK cell activation.

invariant natural killer T-cells (iNKT)；spontaneous preterm；immune；action mechanism

2015-01-06

洪建芬(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

張翔珍，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.004

R714.21

A

1673-5293(2015)05-0920-02