趙天生，方 舒，黃孝天，夏燕華

·綜 述·

腸道病毒2A蛋白酶與細胞蛋白相互作用的研究進展

趙天生1，方 舒2，黃孝天1，夏燕華1

腸道病毒感染可導致多種重要的人類疾病，給人類健康和生命帶來極大的威脅。腸道病毒進入宿主細胞后會影響細胞的蛋白質(zhì)合成、大分子轉(zhuǎn)運、抗病毒反應等過程，據(jù)研究這與腸道病毒2A蛋白酶作用于細胞蛋白有關。在此，我們對腸道病毒2A蛋白酶與宿主細胞蛋白間的相互作用進行綜述，以便全面而深入的了解2A蛋白酶在腸道病毒致病過程中的重要作用，有助于更好的理解腸道病毒的致病機理，為防治腸道病毒感染提供新的思路。

腸道病毒；2A蛋白酶；蛋白相互作用

腸道病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus, PV)、柯薩奇病毒(coxsackievirus, CV)、?？刹《?ECHO virus)和新腸道病毒(enterovirus, EV)等。這些病毒感染可導致多種重要的人類疾病，如脊髓灰質(zhì)炎、手足口病、病毒性腦膜炎、病毒性心肌病等。許多動物病毒編碼蛋白酶，這些蛋白酶通常具有兩方面的功能，一方面裂解病毒多肽前體產(chǎn)生成熟蛋白，構(gòu)成病毒體或參與病毒復制；另一方面作用于細胞蛋白，細胞蛋白通常作為蛋白酶的作用底物，經(jīng)蛋白酶裂解后影響細胞的生命過程。腸道病毒編碼一種2A蛋白酶(2Apro)，該酶不僅參與病毒的生命周期，而且作用于多種細胞蛋白，影響宿主細胞的多種重要的生物學功能。

1 腸道病毒及其基因組結(jié)構(gòu)

腸道病毒具有相似的基因組結(jié)構(gòu)和組成?；蚪M為約7.4 kb的單股正鏈RNA，僅含一個開放閱讀框(open reading frame, ORF)，編碼約2 000個氨基酸組成的多聚蛋白。在基因組的5′ 端和3′ 端為保守的非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)。3′UTR末端有一個長度可變的多聚腺苷酸尾poly(A)，而5′ UTR共價結(jié)合一個小分子量蛋白質(zhì)VPg。多聚蛋白被病毒和細胞的蛋白酶水解成4個結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4和7 個非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。

2 2Apro在腸道病毒生命周期中的重要功能

2Apro屬于半胱氨酸蛋白酶家族[1]，約由150個氨基酸組成。突變分析表明，His20，Asp38和Cys109構(gòu)成了PV 2Apro的催化中心[2]。2AproC-端含有一個酸性結(jié)構(gòu)域，據(jù)研究EV71和 CVB3 2Apro在酵母細胞中表現(xiàn)出強烈的轉(zhuǎn)錄活性，而該酸性結(jié)構(gòu)域則是轉(zhuǎn)錄活性所必需的[3]。

2Apro的首要功能是參與病毒的多肽切割和蛋白成熟。腸道病毒的11個成熟蛋白是在2Apro和3Cpro的作用下分三步完成的：首先通過2Apro的自我切割使P1前體蛋白從腸道病毒多聚蛋白中釋放出來，進而在3Cpro的作用下使多聚蛋白P2(2ABC) 和P3(3ABCD)分離，最后在2Apro和3Cpro的共同作用下形成單個成熟的病毒蛋白。除此之外，2Apro可穩(wěn)定病毒RNA、促進負鏈RNA的合成和病毒蛋白的翻譯[4]。

3 腸道病毒2Apro對宿主細胞的重要作用

3.1 2Apro對細胞的毒性作用 研究發(fā)現(xiàn)，2Apro對多種細胞具有毒性作用。PV 2Apro在HeLa細胞中的瞬時表達可誘導CPE(如細胞變圓，脫落等)，PV 2Apro缺失突變株對HeLa細胞毒性明顯減弱[5]。CVB3 2Apro的長期穩(wěn)定表達則可激活caspases，誘導細胞凋亡[6]。PV 2Apro的表達對酵母細胞具有強烈的毒性作用，表達5h后酵母細胞生長受抑，細胞存活率急劇下降[7]。利用RNA干擾作用使2A表達沉默可明顯增強感染細胞的活力。該現(xiàn)象在動物實驗中尤為突出，CVB3 2A的沉默表達使小鼠組織中病毒的滴度顯著下降，組織損傷減輕并極大延長了小鼠的存活時間[8]。

3.2 2Apro對細胞毒性作用的分子機制 腸道病毒 2Apro對宿主細胞的毒性作用與其作用于多種細胞蛋白有關。歸納起來，與2Apro相互作用的細胞蛋白有翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF)4G、多聚腺嘌呤結(jié)合蛋白(poly(A)-binding protein, PABP)、核孔蛋白、細胞骨架蛋白等。2Apro與細胞蛋白的相互作用導致細胞的多種功能，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、大分子轉(zhuǎn)運和抗病毒反應等受到影響。

3.2.1 2Apro切割eIF4G和PABP影響宿主細胞的蛋白質(zhì)合成 對于多數(shù)真核mRNAs，翻譯起始是從異源三聚體復合物eIF4F識別帽結(jié)構(gòu)(7mGpppN)和PABP開始的。eIF4F由帽結(jié)合蛋白(cap-binding protein) eIF4E、DEAD-box 解旋酶eIF4A和翻譯起始因子eIF4G所構(gòu)成。其中，eIF4G是起始蛋白質(zhì)翻譯最重要的調(diào)節(jié)分子。腸道病毒感染可致宿主細胞蛋白合成快速終止和病毒mRNA翻譯的有效起始[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在PV和CV感染細胞中，eIF4G的切割同步于細胞蛋白合成的終止，這種終止與eIF4F復合物中eIF4G的水解有關[10]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，eIF4G的水解是由2Apro所介導的[11-12]。早期研究者并未從PV感染細胞抽提物中共純化2Apro和eIF4G，猜測可能還要其他的翻譯因子被活化并參與2Apro對eIF4G的蛋白裂解。直到近年來，體內(nèi)體外實驗均證明，PV、CV、EV 2Apro可直接切割eIF4G[13]。2A突變病毒株感染COS-1細胞后，eIF4G未發(fā)生水解[14]，至此證明腸道病毒可通過2Apro切割eIF4G影響宿主細胞的蛋白質(zhì)合成。

大多數(shù)真核mRNAs包含一個39nt的poly(A)尾。關于poly(A)尾，目前已知的功能是參與mRNA的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運，穩(wěn)定細胞質(zhì)mRNA，以及增強mRNA翻譯。poly(A)尾在翻譯中的作用被認為是由PABP所介導的。PABP是真核RNA結(jié)合蛋白家族中的代表，在連接40S核糖體亞單位和mRNA以及招募60S核糖體亞單位中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，只有通過poly(A)尾與PABP相連的mRNAs才能被翻譯[15]。向兔網(wǎng)織紅細胞裂解物(rabbit reticulocyte lysate，RRL)翻譯系統(tǒng)中加入poly(A)，具有帽和poly(A)尾結(jié)構(gòu)的mRNAs的翻譯受到抑制。這種抑制效應可因加入過量PABP得到緩解，表明加入的poly(A)隔絕了內(nèi)源性PABP[16]。深入研究發(fā)現(xiàn)，CV感染細胞中，PABP同樣被2Apro切割，使宿主細胞蛋白翻譯受阻，這可能是腸道病毒感染影響宿主細胞翻譯的另一種機制[17]。

3.2.2 2Apro作用于核孔蛋白影響大分子的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運 由30多種核孔素(nucleoporins, Nups)構(gòu)成的核孔復合物(nuclear pore complex, NPC)是細胞內(nèi)大分子物質(zhì)(包括RNAs和蛋白質(zhì))運輸?shù)闹饕ǖ溃彩遣《咀饔玫闹饕繕?。研究發(fā)現(xiàn)，PV感染可改變大分子的細胞定位，如使核蛋白定位于細胞質(zhì)[18]。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PV 2Apro可誘導NPC嚴重的結(jié)構(gòu)性損傷，其構(gòu)成成分Nup98、Nup153和Nup62先后不同程度的被2Apro降解，在蛋白質(zhì)核運輸受阻的同時RNA的定位也發(fā)生紊亂[19-20]。影響核-質(zhì)轉(zhuǎn)運對于腸道病毒的意義可能有兩點：細胞質(zhì)中核蛋白的增加可促進病毒的復制，同時阻止轉(zhuǎn)錄因子入核可防止一系列抗病毒反應基因的轉(zhuǎn)錄。

3.2.3 2Apro影響宿主細胞的抗病毒反應 盡管細胞的翻譯過程、大分子運輸受阻必然影響抗病毒基因的表達，但研究發(fā)現(xiàn)2Apro可直接作用于細胞免疫系統(tǒng)，影響細胞的抗病毒反應。PV1-3型和EV71均能在IFN-а預處理的細胞中復制，而2Apro的突變可使PV對IFN-а敏感[21]。RIG-I和RIG-I樣受體MDA5是天然抗病毒反應中的關鍵分子，一旦識別到病毒RNA就會與線粒體抗病毒信號 (mitochondrial anti-viral signaling, MAVS)相互作用，最終誘導Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，腸道病毒感染時，MDA5以不同方式降解，如PV感染時MDA5的降解是由caspase和蛋白酶體所介導的，而CVB3感染時MDA5和 MAVS的切割都是由2Apro介導的[22-23]，說明腸道病毒可直接作用于干擾素系統(tǒng)來拮抗細胞的抗病毒反應。

3.2.4 2Apro作用于細胞骨架蛋白dystrophin導致心肌病 人類擴張型心肌病有兩種，一種是家族遺傳型，主要原因是細胞骨架蛋白dystrophin基因發(fā)生突變；另一種是獲得型，是由多因素造成的，其中約30%是由腸道病毒感染導致。研究發(fā)現(xiàn)，無論哪一種心肌病實際上都是細胞骨架性疾病，如細胞骨架蛋白dystrophin的移碼突變或錯義突變都可導致心肌病的發(fā)生[24]。腸道病毒感染可致細胞骨架蛋白dystrophin降解，其作用主要是由2Apro所介導的[25]。體內(nèi)外實驗表明，CVB3 2Apro的確能切割人類和大鼠dystrophin，導致心肌細胞形態(tài)和功能的破壞，被認為是形成擴張型心肌病的主要原因[26]。CVB感染的小鼠模型中，過量表達2A蛋白可導致嚴重的心肌功能障礙和擴張型心肌病[27]。

4 討 論

細胞蛋白網(wǎng)絡是一個復雜而又高度有序的整體，蛋白質(zhì)相互之間是相互關聯(lián)的，既有促進也有制約作用，它們共同維護細胞的生命進程。細胞被病毒感染后，某一種或幾種細胞蛋白受到病毒蛋白酶的水解作用，不僅影響該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，同時會打破細胞蛋白網(wǎng)路的有序性，進而影響整個細胞的生命進程。為了給病毒生命周期創(chuàng)造一個積極的細胞內(nèi)環(huán)境，單個病毒蛋白能夠調(diào)節(jié)基因表達的多個步驟，如腸道病毒2Apro作用的細胞蛋白涉及到轉(zhuǎn)錄、翻譯和核-質(zhì)轉(zhuǎn)運等。

病毒作為一種嚴格的細胞內(nèi)寄生微生物，其目的顯然不是為了殺死宿主細胞而使自身失去寄居的場所，其終極目標是復制自我產(chǎn)生子代，而復制除了需要各種資源和能量外，還會受到來自細胞免疫系統(tǒng)的抗病毒作用。由于腸道病毒的翻譯起始過程不同于真核細胞，因此2Apro裂解eIF4G僅會關閉細胞蛋白合成而不會影響病毒的蛋白合成，因此可直接接管宿主細胞的蛋白合成機器，解決了復制所需要資源和能量的問題。蛋白酶對宿主蛋白水解的同時會影響其他的細胞功能，如抗病毒反應?？共《痉磻懈鞣N蛋白質(zhì)的合成由于eIF4G的水解而受到影響。天然免疫途徑的活化和抗病毒反應的建立依賴于信號從核孔復合體轉(zhuǎn)運到核膜。PV 2Apro水解核孔素破壞核孔復合體結(jié)構(gòu)，從而阻止大分子物質(zhì)的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運。轉(zhuǎn)運受阻可抑制抗病毒信號的核輸出或阻止對病毒有害的細胞mRNA的輸出。因此，腸道病毒利用自身編碼的蛋白酶從不同水平阻止細胞基因表達，如翻譯，轉(zhuǎn)錄或蛋白和RNA在細胞核與細胞質(zhì)間的轉(zhuǎn)運。除此之外，腸道病毒還可直接作用于干擾素產(chǎn)生過程中涉及到的重要分子如MDA5和 MAVS，直接影響細胞的抗病毒反應。由此可見，病毒蛋白酶在病毒的生命周期中起著極為重要的作用。

對病毒蛋白酶的研究有助于從分子水平理解病毒復制和轉(zhuǎn)錄的機制。更為重要的是，病毒蛋白酶可作為揭示其靶蛋白確切功能的一種工具。從這點來說，腸道病毒2Apro不僅在處理腸道病毒多聚蛋白而且在與宿主細胞的相互作用中都起到了關鍵性作用。通過揭示腸道病毒2Apro靶蛋白，我們能夠制定與2Apro相互作用的細胞網(wǎng)絡，從而有助于我們從分子水平深入理解病毒蛋白酶的功能及揭示腸道病毒的分子致病機制。

[1]Konig H, Rosenwirth B. Purification and partial characterization of poliovirus protease 2A by means of a functional assay[J]. J Virol, 1988, 62(4): 1243-1250.

[2]Yu SF, Lloyd RE. Identification of essential amino acid residues in the functional activity of poliovirus 2A protease[J]. Virology, 1991, 182(2): 615-625.

[3]Yang CH, Li HC, Jiang JG, et al. Enterovirus type 71 2A protease functions as a transcriptional activator in yeast[J]. J Biomed Sci, 2010, 17: 65. DOI: 10.1186/1423-0127-17-65

[4]Jurgens CK, Barton DJ, Sharma N, et al. 2Apro is a multifunctional protein that regulates the stability, translation and replication of poliovirus RNA[J]. Virology, 2006, 345(2): 346-357.

[5]Igarashi H, Yoshino Y, Miyazawa M, et al. 2A protease is not a prerequisite for poliovirus replication[J]. J Virol, 2010, 84(12): 5947-5957. DOI: 10.1128/JVI.02575-09

[6]Chau DH, Yuan J, Zhang H, et al. Coxsackievirus B3 proteases 2A and 3C induce apoptotic cell death through mitochondrial injury and cleavage of eIF4GI but not DAP5/p97/NAT1[J]. Apoptosis, 2007, 12(3): 513-524.

[7]Barco A, Carrasco L. Poliovirus 2Aproexpression inhibits growth of yeast cells[J]. FEBS Letters, 1995, 371(1): 4-8.

[8]Morrison JM, Racaniello VR. Proteinase 2Aprois essential for enterovirus replication in typeⅠinterferon-treated cells[J]. J Virol, 2009, 83(9): 4412-4422. DOI: 10.1128/JVI.02177-08

[9]Leibowitz R, Penman S. Regulation of protein synthesis in HeLa cells. 3. Inhibition during poliovirus infection[J]. J Virol, 1971, 8(5): 661-668.

[10]Etchison D, Milburn SC, Edery I, et al. Inhibition of HeLa cell protein synthesis following poliovirus infection correlates with the proteolysis of a 220,000-dalton polypeptide associated with eucaryotic initiation factor 3 and a cap binding protein complex[J]. J Biol Chem, 1982, 257(24): 14806-14810.

[11]Haghighat A, Svitkin Y, Novoa I, et al. The eIF4G-eIF4E complex is the target for direct cleavage by the rhinovirus 2A proteinase[J].J Virol, 1996, 70(12): 8444-8450.

[12]Krausslich HG, Nicklin MJ, Toyoda H, et al. Poliovirus proteinase 2A induces cleavage of eucaryotic initiation factor 4f polypeptide p220[J]. J Virol, 1987, 61(9): 2711-2718.

[13]Ventoso I, MacMillan SE, Hershey JW, et al. Poliovirus 2A proteinase cleaves directly the eIF-4G subunit of eIF-4F complex[J]. FEBS Lett, 1998, 435(1): 79-83.

[14]Merl S, Michaelis C, Jaschke B, et al. Targeting 2A protease by RNA interference attenuates coxsackieviral cytopathogenicity and promotes survival in highly susceptible mice[J]. Circulation, 2005, 111(13): 1583-1592.

[15]Hensold JO, Barth-Baus D, Stratton CA. Inducers of eryth-roleukemic differentiation cause messenger RNAs that lack poly(A)-binding protein to accumulate in translationally inactive, salt-stable 80S ribosomal complexes[J]. J Biol Chem, 1996, 271(38): 23246-23254.

[16]Grossi de Sa MF, Standart N, Martins de Sa C, et al. The poly(A)-binding protein facilitatesinvitrotranslation of poly(A)-rich mRNA[J]. Eur J Biochem, 1988, 176(3): 521-526.

[17]Kerekatte V, Keiper BD, Badorff C, et al. Cleavage of poly(A)-binding protein by coxsackievirus 2A proteaseinvitroandinvivo: another mechanism for host protein synthesis shutoff?[J]. J Virol, 1999, 73(1): 709-717.

[18]Waggoner S, Sarnow P. Viral ribonucleoprotein complex formation and nucleolar-cytoplasmic relocalization of nucleolin in poliovirus-infected cells[J]. J Virol, 1998, 72(8): 6699-6709.

[19]A lvarez E, Castello A, Carrasco L, et al. Poliovirus 2A protease triggers a selective nucleo-cytoplasmic redistribution of splicing factors to regulate alternative pre-mRNA splicing[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e73723. DOI: 10.1371/journal.pone.0073723

[20]Castello A, Izquierdo JM, Welnowska E, et al. RNA nuclear export is blocked by poliovirus 2A protease and is concomitant with nucleoporin cleavage[J]. J Cell Sci, 2009, 122(Pt 20): 3799-3809. DOI: 10.1242/jcs.055988

[21]Morrison JM, Racaniello VR. Proteinase 2Aprois essential for enterovirus replication in type Ⅰinterferon-treated cells[J]. J Virol, 2009, 83(9): 4412-4422. DOI: 10.1128/JVI.02177-08

[22]Wang B, Xi X, Lei X, et al. Enterovirus 71 protease 2Aprotargets MAVS to inhibit anti-viral type I interferon responses[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(3): e1003231. DOI: 10.1371/journal.ppat.1003231

[23]Feng Q, Langereis MA, Lork M, et al. Enterovirus 2Apro targets MDA5 and MAVS in infected cells[J]. J Virol, 2014, 88(6): 3369-3378. DOI: 10.1128/JVI.02712-13

[24]Malhotra SB, Hart KA, Klamut HJ, et al. Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy[J]. Science, 1988, 242(4879): 755-759.

[25]Blom N, Hansen J, Blaas D, et al. Cleavage site analysis in picornaviral polyproteins: discovering cellular targets by neural networks[J]. Protein Sci, 1996, 5(11): 2203-2216.

[26]Badorff C, Lee GH, Lamphear BJ, et al. Enteroviral protease 2A cleaves dystrophin: Evidence of cytoskeletal disruption in an acquired cardiomyopathy[J]. Nat Med, 1999, 5(3): 320-326.

[27]Koenig M, Kunkel LM. Detailed analysis of the repeat domain of dystrophin reveals four potential hinge segments that may confer flexibility[J]. J Biol Chem, 1990, 265(8): 4560-4566.

Xia Yan-hua, Email: xiayanhua@ncu.edu.cn

Research progress on interaction between enterovirus 2A protease and cellular proteins

ZHAO Tian-sheng1,FANG Shu2,HUANG Xiao-tian1,XIA Yan-hua1

(1.MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China; 2.UndergraduateofClinicalMedicine,Grade2011,MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330031,China)

Enterovirus infection can lead to a variety of important human diseases and bring great threat to human health and life. When enterovirus infects host cells, some cellular processes including protein synthesis, macromolecular transport and antiviral response will change, which is attributed to the role of viral 2A protease on cellular proteins. Here we summarized the interactions between viral 2A protease and cellular proteins, which is helpful to better understand the important function of 2A protease and the pathogenic mechanism of enterovirus and provide a new way for prevention and treatment of enterovirus infection.

enterovirus; 2A protease; protein interaction

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.014

江西省自然科學基金(20142BAB205070)和國家自然科學基金(81160196)聯(lián)合資助

夏燕華，Email: xiayanhua@ncu.edu.cn

1.南昌大學醫(yī)學院，南昌 330006; 2.南昌大學醫(yī)學院2011級臨床醫(yī)學系，南昌 330031

Funded by the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (No. 20142BAB205070) and the National Natural Science Foundation of China (No. 81160196)

R373.2

A

1002-2694(2015)09-0850-04

2014-12-11；

2015-04-22