劉 薇，陳 燕，岳 敏，袁 進(jìn)，邱添武，肖 東，顧為望

(南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515)

小型豬因其體型大小、解剖結(jié)構(gòu)、代謝特點(diǎn)、生理生化等方面與人有較大的相似性，近年來越來越廣泛地被用于生物醫(yī)學(xué)研究，而各種轉(zhuǎn)基因豬更大大擴(kuò)展了小型豬在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用范圍。西藏小型豬是本單位2004年由西藏自治區(qū)引種至廣州培育而成的實(shí)驗(yàn)小型豬品種，近年來，應(yīng)用其建立了數(shù)種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型［1－2］。

制備轉(zhuǎn)基因克隆豬常用的豬胚胎成纖維細(xì)胞(porcine embryonic fibroblasts，PEFs)是取自豬35日齡胚胎的原代成纖維細(xì)胞，將外源基因?qū)隤EFs是制備轉(zhuǎn)基因克隆豬的第一步［3］。目前常用的將外源基因?qū)隤EFs的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與慢病毒介導(dǎo)的方法。但是脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PEFs的轉(zhuǎn)染效率很低，通過較長時(shí)間的藥物篩選才能獲得少量的穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞用于后期的核移植;而慢病毒法能解決轉(zhuǎn)染效率低的問題，但是慢病毒生產(chǎn)存在一定的技術(shù)難度且操作較直接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染要復(fù)雜，而且對(duì)于片段較大的質(zhì)粒，慢病毒感染的效率會(huì)下降。

Nucleofection核轉(zhuǎn)染技術(shù)是一種可以針對(duì)不同細(xì)胞類型，選擇最佳的轉(zhuǎn)染程序與轉(zhuǎn)染試劑的電轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用這種方法可以高效轉(zhuǎn)染難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和原代細(xì)胞(如神經(jīng)元、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等)［4］，且轉(zhuǎn)染效率較高，因其操作便利性與較高的轉(zhuǎn)染效率，目前已經(jīng)有一些實(shí)驗(yàn)室將此技術(shù)應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因克隆豬制備的上游工作(將目的基因轉(zhuǎn)入PEFs)。本實(shí)驗(yàn)室參照已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)條件，將此技術(shù)用于轉(zhuǎn)染西藏小型豬PEFs，并比較其與傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法在轉(zhuǎn)染效率上的差別。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 核轉(zhuǎn)染用試劑與儀器

核轉(zhuǎn)染試劑:HumanDermalFibroblasts Nucleofector Kit(VPD-1001)(包含pmaxGFP質(zhì)粒)(德國Lonza公司);Nucleofector II核轉(zhuǎn)染儀(德國Lonza公司)。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清、高糖DMEM、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺購自 Hyclone公司、LipofectamineTM2000、Opti-MEM、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶和DMSO等購自Invitrogen公司，培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等購自Corning公司。其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 借助Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀將pmaxGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PEFs

實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室凍存的西藏小型豬PEFs，將冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇后傳代2次，胰酶消化收集細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，用VPI-1001試劑盒中的核轉(zhuǎn)染液重懸細(xì)胞(Basic Nucleofector Solution+Supplement 4.5:1)，按106細(xì)胞加5 μg的量加入pmaxGFP質(zhì)粒，將混合液加入電轉(zhuǎn)杯，使用U020程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，完成電轉(zhuǎn)染后，盡快用吸管向電轉(zhuǎn)杯中加入500 μL預(yù)熱的培養(yǎng)基，用吸管將細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移到含足量預(yù)熱培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察細(xì)胞的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況。

1.2.2 借助脂質(zhì)體將pmaxGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PEFs

同期培養(yǎng)的PEFs，按照Invitrogen推薦的實(shí)驗(yàn)方法，按每六孔板一個(gè)孔加 2.1 μg質(zhì)粒，5.4 μL脂質(zhì)體的量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2 結(jié)果

核轉(zhuǎn)染5 h后，倒置熒光顯微鏡下可見GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率在80%以上，轉(zhuǎn)染3 d后可見綠色熒光強(qiáng)度明顯升高，轉(zhuǎn)染效率也保持在80%以上(彩插11圖1)，細(xì)胞生長迅速，活力良好。經(jīng)過傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染6 d后，GFP陽性的細(xì)胞明顯減少(50%以下)，伴隨熒光亮度減弱。轉(zhuǎn)染11 d與21 d后，GFP陽性的細(xì)胞進(jìn)一步減少，但直到第21天，可以看到P5代細(xì)胞仍有少量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光(彩插11圖1)。說明通過核轉(zhuǎn)染可以獲得少量穩(wěn)定整合外源基因的細(xì)胞;而用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的PEFs，在12 h才可看到GFP表達(dá)，且轉(zhuǎn)染效率很低(彩插11圖2)，在傳代培養(yǎng)至第7天時(shí)，已經(jīng)不可見綠色熒光。使用本實(shí)驗(yàn)中的核轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染PEFs，所獲得的轉(zhuǎn)染效率明顯高于脂質(zhì)體法。

3 討論

脂質(zhì)體法只能介導(dǎo)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)，僅有非常少量的細(xì)胞穩(wěn)定整合了外源基因，需要通過新霉素(NEO)、潮霉素(HYG)等抗性基因來篩選穩(wěn)定整合的細(xì)胞，而對(duì)于PEFs這種原代細(xì)胞來說，本身脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率就很低(10%以下)，再加上長達(dá)一周的抗生素篩選，使細(xì)胞活力大大下降，用這種方法篩選穩(wěn)定整合目的基因的細(xì)胞株耗時(shí)很長，且獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的成功率低。

Lonza公司研發(fā)的核轉(zhuǎn)染技術(shù)是一種非病毒介導(dǎo)的新型轉(zhuǎn)染技術(shù)，該技術(shù)在傳統(tǒng)電穿孔技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，設(shè)計(jì)出包含針對(duì)不同類型細(xì)胞的優(yōu)化轉(zhuǎn)染程序和細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)染試劑。核轉(zhuǎn)染法就是采用對(duì)特定類型細(xì)胞配套的核轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染程序，直接把外源基因?qū)爰?xì)胞核中，以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效率。與脂質(zhì)體法相比，Nucleofection核轉(zhuǎn)染的方法可以將質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而大大增加了質(zhì)粒DNA整合到宿主基因組的幾率，因此能大大提高穩(wěn)定整合的效率。

Nucleofector核轉(zhuǎn)染儀需要針對(duì)不同細(xì)胞制定最佳的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染程序，從生產(chǎn)廠家Lonza的網(wǎng)站上可以查到不斷更新的用戶更新的數(shù)據(jù)，包含近1000種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染程序、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活性等信息。但是對(duì)于PEFs我們?cè)谄渚W(wǎng)站沒有查到相關(guān)信息。而國內(nèi)崔茂盛［5］、李松［6］等分別對(duì)羊和牛的胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行了核轉(zhuǎn)染，他們通過篩選多種轉(zhuǎn)染程序發(fā)現(xiàn)針對(duì)羊胚胎成纖維細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染程序是T016，獲得的轉(zhuǎn)染效率為86%;針對(duì)牛胚胎成纖維細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染程序是V013，獲得的轉(zhuǎn)染效率為96%。國外Maurisse等［7］發(fā)現(xiàn)，針對(duì) PEFs的最優(yōu)轉(zhuǎn)染程序?yàn)?U020(豬種未提及)，獲得的轉(zhuǎn)染效率是90%，他們使用的轉(zhuǎn)染試劑是Human Dermal Fibroblasts Nucleofector Kit(VPD-1001)。Nakayama 等［8］轉(zhuǎn)染 Clawn 小型豬PEFs時(shí)對(duì)推薦的10個(gè)轉(zhuǎn)染程序進(jìn)行篩選得出最優(yōu)程序U023，獲得了79%的轉(zhuǎn)染效率，使用的轉(zhuǎn)染試劑是Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(VPI-1002)。本實(shí)驗(yàn)我們采用 Maurisse的經(jīng)驗(yàn)，使用VPD-1001轉(zhuǎn)染試劑和U020程序，參考成纖維細(xì)胞的推薦實(shí)驗(yàn)方法對(duì)西藏小型豬PEFs進(jìn)行核轉(zhuǎn)染。

利用Nucleofection核轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染西藏小型豬PEFs后，目的基因GFP能在PEFs中表達(dá)，獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率明顯高于脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PEFs，且傳代21 d后，仍有部分細(xì)胞表達(dá)GFP，說明通過Nucleofection核轉(zhuǎn)染能獲得一定比例的穩(wěn)定整合外源基因的細(xì)胞，預(yù)示可以通過此方法，再進(jìn)行抗性篩選，獲得穩(wěn)定整合目的基因的細(xì)胞株，進(jìn)而為制備轉(zhuǎn)基因克隆豬提供核供體。

Nucleofection核轉(zhuǎn)染技術(shù)操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染時(shí)無需更換無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞在進(jìn)行轉(zhuǎn)染5 h后即可看到熒光表達(dá);而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染時(shí)需要更換無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4～8 h需要換液，以去除其對(duì)細(xì)胞的毒性，且一般于12 h后才能看到熒光表達(dá)，可見，用核轉(zhuǎn)染的方法，能大大減少實(shí)驗(yàn)操作，縮短實(shí)驗(yàn)周期，適合高通量的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，Nucleofection核轉(zhuǎn)染的方法具有很多脂質(zhì)體法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，是一種高效轉(zhuǎn)染豬PEFs的方法，值得推廣應(yīng)用。

［1］ Deng W，Yang D，Zhao B，et al．Use of the 2A peptide for generation of multi-transgenic pigs through a single round of nuclear transfer［J］．PLoS One，2011，6(5):e19986．

［2］ Yang D，Wang CE，Zhao B，et al．Expression of Huntington’s disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs［J］．Hum Mol Genet，2010，19(20):3983－3994．

［3］ 劉薇，賈俊雙，唐華，等．慢病毒載體法制備遺傳工程猴和小型豬的現(xiàn)狀及應(yīng)用前景展望［J］．中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，05:84－89．

［4］ Martinet W，Schrijvers D，Kockx M．Nucleofection as an efficient nonviral transfection method for human monocyti c cells［J］．Bi otechrol Lett，2003，25(13):1025 － 1029．

［5］ 崔茂盛，馮沖，張金龍，等．不同體細(xì)胞類型和基因轉(zhuǎn)染方式對(duì)綿羊克隆胚胎體外發(fā)育的影響［J］．畜牧與獸醫(yī)，2012，44(1):57－60．

［6］ 李松，丁方榮，戴蘊(yùn)平，等．不同轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染牛體細(xì)胞效率的比較［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19(6):1027－1033．

［7］ Maurisse R．，De Semir D．，Emamekhoo H．，et al．Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages［J］．BMC Biotechnology，2010，10(1):9．

［8］ Nakayama A．，Sato M．，Shinohara M．，Matsubara S．，et al．Efficienttransfection of primarily cultured porcine embryonicfibroblasts using the amaxa nucleofection system TM［J］．Cloning and Stem Cells，2007，9(4):523 －534．