張紅凱，陳 杰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京100730

RAS-GTPase活化蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展

張紅凱，陳 杰

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京100730

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程涉及多種分子的活化與參與，其中RAS途徑相關(guān)分子是腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的關(guān)鍵因子。在人體所有腫瘤中，約30%的腫瘤存在RAS基因突變，而某些腫瘤如胰腺癌，RAS基因突變率可高達(dá)75%～95%。即使在不伴有RAS突變的腫瘤中，RAS途徑相關(guān)分子仍可高度活化，但相關(guān)機(jī)制目前尚不清楚。RAS-GTPase活化蛋白(RASGAPs)是一類腫瘤抑制性基因，可通過與活化的RAS-GTPase結(jié)合，水解GTP，使活化的Ras蛋白轉(zhuǎn)化為非活化狀態(tài)，從而抑制下游分子通路激活，抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。當(dāng)基因突變、啟動(dòng)子甲基化等原因使其功能失活后可致Ras蛋白處于持續(xù)活化狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本文總結(jié)了近年來RASGAPs在腫瘤中的研究進(jìn)展。

RAS-GTPase活化蛋白;腫瘤

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):364-369

RAS家族蛋白是一類小分子GTP酶，也是在人類腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)癌基因，可廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Ras蛋白為膜結(jié)合型的GTP/GDP結(jié)合蛋白，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，與GTP結(jié)合時(shí)處于活化狀態(tài);反之，與GDP結(jié)合時(shí)則為非活化狀態(tài)。迄今發(fā)現(xiàn)RAS家族有H-RAS、N-RAS和KRAS 3個(gè)成員。在不同類型的腫瘤中，RAS突變類型也不同，例如:胰腺癌組織中以K-RAS突變?yōu)橹鳎蛔兟始s為75%;黑色素瘤中以N-RAS突變?yōu)橹?，突變率約為18%;膀胱癌中以H-RAS突變?yōu)橹?，突變率約為10%。RAS基因突變可使RAS通路持續(xù)活化，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展。在不伴有RAS基因突變的腫瘤中，RAS通路的其他分子也可處于活化狀態(tài)。然而，盡管RAS基因已被發(fā)現(xiàn)了近50年，但迄今仍缺乏有效針對(duì)該通路的靶向藥物。RAS基因突變腫瘤是迄今最難治療的腫瘤［1］。近來研究發(fā)現(xiàn)，GTPase活化蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)與一類被稱為鳥苷酸交換因子 (guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的蛋白可共同調(diào)節(jié) RAS通路的 “開”與“關(guān)”。GAPs通常行使腫瘤抑制基因的功能，促進(jìn)Ras活化蛋白水解，抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)RASGAPs基因突變、缺失或啟動(dòng)子甲基化等原因使其功能失活后，將導(dǎo)致RAS通路的持續(xù)活化。不僅如此，RASGAPs在腫瘤中的表達(dá)改變還可影響腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。

RASGAPs概述

迄今已發(fā)現(xiàn)14種RASGAPs基因，主要成員包括神經(jīng)纖維素1(neurofibromin 1，NF1)、DAB2相互作用蛋白(DAB2-interacting protein，DAB2IP)、Ras蛋白活化因子2(Ras protein activator like 2，RASAL2)、GTPase活化蛋白1(GTPase-activating protein 1，RASA1)、IQ 樣GTPase活化蛋白同源體1(IQ motif containing GTPase-activating protein homologue 1，IQGAP1)、IQGAP2等，其共同特點(diǎn)是都含有1個(gè)與Ras蛋白結(jié)合區(qū)域——RasGAP區(qū)，行使與Ras蛋白結(jié)合后的催化功能，發(fā)揮調(diào)節(jié)RAS通路的作用。而在RasGAP區(qū)域之外的結(jié)構(gòu)則與蛋白-蛋白之間相互作用、蛋白與脂類物質(zhì)相互結(jié)合等有關(guān)。但研究也發(fā)現(xiàn)，不同RasGAPs蛋白的分布、功能均有差異，有些蛋白不僅可以調(diào)節(jié)RAS通路，也可參與其他非RAS依賴途徑的調(diào)節(jié)。

RASGAPs主要成員作用及功能

NF1 NF1是目前研究最多的 RASGAPs成員。NF1基因位于17q11．2，包含有64個(gè)外顯子，產(chǎn)生3個(gè)可變剪接體，分別編碼含2839、2818、593個(gè)氨基酸殘基蛋白質(zhì)(最短者缺乏RASGAP區(qū))。蛋白名為神經(jīng)纖維素。NF1是Ballester等［2］在1990年最先通過定位克隆發(fā)現(xiàn)的。神經(jīng)纖維素蛋白在人體內(nèi)廣泛存在，但在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最高。除了所有RasGAPs蛋白均有的RAS蛋白結(jié)合區(qū)外，它還包含有1個(gè)與脂質(zhì)結(jié)合的SEC14-PH區(qū)。

有研究發(fā)現(xiàn)，NF1是參與家族性神經(jīng)纖維瘤病發(fā)生的主要原因。NF1在胚系細(xì)胞中的突變與缺失與Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的發(fā)生密切相關(guān)［3］。神經(jīng)纖維瘤病是一種家族遺傳綜合征，發(fā)病率約為1/3500，主要臨床特征是患者患有多發(fā)性外周神經(jīng)神經(jīng)纖維瘤并可伴/不伴有內(nèi)臟器官的多發(fā)良性或惡性腫瘤，如膠質(zhì)瘤、髓系白血病、嗜鉻細(xì)胞瘤等。NF1患者可有嚴(yán)重的智力損害、骨發(fā)育不良、虹膜病變、疼痛等多種癥狀與體征［4］。

NF1在體內(nèi)行使的是腫瘤抑制基因的功能，有88%的Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病患者體內(nèi)有NF1突變［5］。有研究者甚至認(rèn)為，NF1的重要性堪比經(jīng)典的腫瘤抑制基因如P53、PTEN等［1］。NF1的雜合性缺失或二次突變?cè)趧?dòng)物體內(nèi)可引發(fā)與人類類似的神經(jīng)纖維瘤病、惡性外周神經(jīng)鞘瘤、髓系白血病、嗜鉻細(xì)胞瘤等疾病。在NF1突變或缺失的腫瘤中，活化的Ras蛋白(RASGTP)及其絲裂原活化激酶蛋白(mitogen activated kinase-like protein，MAPK)、磷酯酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phosphoinositide-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT)下游通路分子的表達(dá)水平均有所升高［6-7］。

除了在家族性NF1發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用，近年研究還發(fā)現(xiàn)，NF1在散發(fā)性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用，其在肺腺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中也普遍缺失［8-9］。但NF1缺失引發(fā)的后果還需體內(nèi)其他因子的協(xié)助與參與:在NF1發(fā)生的過程中，如果P53基因未缺失，NF1的缺失尚不足以引發(fā)疾病，而一旦P53缺失即可引發(fā)腫瘤;NF1缺失后，由BRAF突變引起的RAS通路負(fù)反饋將會(huì)消失，RAS通路持續(xù)活化可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在人黑色素瘤中，NF1突變與BRAF突變同時(shí)存在，而重新導(dǎo)入NF1基因可抑制人黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，NF1突變還可與NRAS突變同時(shí)存在［10-11］。因此，NF1與其他因子相互作用在體內(nèi)處于重要地位。但它們之間作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

NF1除了在腫瘤發(fā)生過程中起著重要作用外，還與腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向藥物的耐藥有關(guān)。靶向藥物的出現(xiàn)曾令人歡欣鼓舞，但隨著進(jìn)入臨床用藥時(shí)間延長(zhǎng)，其逐漸出現(xiàn)的耐藥問題成了治療中的難題，查明其中的耐藥機(jī)制是臨床藥物研發(fā)的必然之路。NF1在腫瘤組織中的低表達(dá)是肺癌、黑色素瘤、乳腺癌患者耐藥的主要原因之一。研究顯示，NF1低表達(dá)的患者伴有RAS下游途徑的活化，與其對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)、他莫昔芬的反應(yīng)不佳有關(guān)［12-15］。

在體內(nèi)，泛素化的蛋白酶體作用可使NF1降解，抑制泛素化蛋白酶可使NF1表達(dá)升高，RAS通路活性降低［16］。因此，針對(duì)泛素化蛋白酶體的藥物有望給膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤的靶向治療帶來希望。

DAB2IP DAB2IP是第2種研究較多的RASGAP，位于9q33．1-33．3，有23個(gè)外顯子，產(chǎn)生2個(gè)可變剪接體，編碼含1132及1065個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。研究表明，DAB2IP參與多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)(RAS依賴或非依賴途徑)，發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用。

在膀胱尿路上皮癌中，DAB2IP低表達(dá)與腫瘤的高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者術(shù)后存活時(shí)間較短有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，敲低DAB2IP的表達(dá)可使細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶活化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)、增殖能力，腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子vimentin表達(dá)增強(qiáng)［17］;在前列腺癌中，由于其表達(dá)降低，對(duì)RAS活性抑制作用減弱，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生;同時(shí)它對(duì)NF-κB(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1)信號(hào)抑制作用減弱使NF-κB途徑激活，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［18］。

新近研究還表明，DAB2IP也與腫瘤細(xì)胞的放療耐受及耐藥有關(guān)。DAB2IP在前列腺癌組織中的低表達(dá)可預(yù)示患者對(duì)放療敏感性差，生存期短［19］; DAB2IP在前列腺癌細(xì)胞中的低表達(dá)可影響 Egr-1/ Clusterin途徑，使癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物耐藥;增加DAB2IP或降低Clusterin的表達(dá)可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［20］。

而DAB2IP在細(xì)胞中的表達(dá)主要受組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH2的調(diào)節(jié)，但Akt1以及泛素化蛋白酶體途徑中的SCFFbw7也參與DAB2IP的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，最終影響RAS通路活性及TRAF2介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［21］。

RASAL1/2/3 RASAL1位于12q23-q24，共23個(gè)外顯子，產(chǎn)生4個(gè)剪接可變體，編碼的蛋白質(zhì)分別包含有806、804、776、805個(gè)氨基酸殘基;RASAL2位于1q24，有22個(gè)外顯子，產(chǎn)生2個(gè)可變剪接體(二者差別主要在5-UTR及編碼區(qū))，編碼的蛋白長(zhǎng)度分別含有1139及1280個(gè)氨基酸殘基;RASAL3位于19p13．12，共18個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)含有1005個(gè)氨基酸殘基。有關(guān)RASAL3的功能研究較少?，F(xiàn)有研究表明，RASAL1/2也是RASGAPs家族中的腫瘤抑制基因。

RASAL1在甲狀腺癌中的突變及甲基化率為10%并同時(shí)伴有MAPK及PI3K的活性增強(qiáng)，與其他經(jīng)典基因(RAS、BRAF、PTEN、PIK3CA)突變相互排斥［22］;胃癌中RASAL1表達(dá)降低與腫瘤分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中敲低RASAL1或表達(dá)RASAL1突變產(chǎn)物都可造成 RAS及其下游通路 MAPK、PI3K/ AKT的活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞及移植瘤的生長(zhǎng);而促進(jìn)表達(dá)RASAL1則可抑制腫瘤的生長(zhǎng)［23］。在乳腺癌中的研究同樣發(fā)現(xiàn)，RAS基因突變現(xiàn)象并不常見，但其下游RAS效應(yīng)分子常常高表達(dá)。McLaughlin等［24］研究顯示，RASAL2在其中起了重要作用:抑制RASAL2的表達(dá)可以活化K-RAS及H-RAS，促進(jìn)乳腺癌發(fā)生; RASAL2突變促進(jìn)了乳腺癌轉(zhuǎn)移，其低表達(dá)還與乳腺癌管腔B型患者的復(fù)發(fā)及存活密切相關(guān)。

RASAL1的失活機(jī)制與NF1及DAB2IP一樣，可以是基因突變的結(jié)果，但更多的是表觀遺傳修飾的后果。Seto等［25］在胃癌細(xì)胞系及胃癌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)，RASAL1表達(dá)降低可見于大多數(shù)細(xì)胞系及胃癌組織，并且均可見其啟動(dòng)子的甲基化，部分還伴有雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。Qiao等［26］采用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，5’-AZA)以及組蛋白去乙?；敢种苿┣琶顾谹(trichostatin A，TSA)處理胃癌細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASAL1表達(dá)增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)化受到抑制，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。

除了甲基化及突變可影響RASAL1表達(dá)外，Kolfschoten等［27］發(fā)現(xiàn)抑癌基因配對(duì)同源結(jié)構(gòu)域1(paired-like homeodomain 1，PITX1)也可調(diào)節(jié)RASAL1在前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌細(xì)胞的表達(dá)。此外，他們還觀察到PITX1對(duì)NF1的表達(dá)沒有明顯影響，并因此認(rèn)為RasGAPs的表達(dá)與調(diào)控可能具有組織的特異性。這也從另方面說明RasGAPs在體內(nèi)調(diào)控-被調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜。

IQGAP1/2/3 IQGAP1位于15q26．1，共有39個(gè)外顯子，編碼長(zhǎng)度為1657個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì); IQGAP2位于5q13．3，產(chǎn)生4可變剪接體，編碼長(zhǎng)度為1071～1525個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì);IQGAP3位于1q21．3，有38個(gè)外顯子，編碼長(zhǎng)度為1631個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。IQGAPs蛋白又被稱為支架蛋白，包含多個(gè)可與多種蛋白(包括Raf、Calmodulin、Mek、Erk、actin等)相互作用的區(qū)域，在細(xì)胞信號(hào)精確傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用［28］。

盡管IQGAP1/2二者有類似的結(jié)構(gòu)，但卻有著截然相反的作用。研究顯示，IQGAP1在肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、骨髓瘤、胰腺癌等腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，通過與calmodulin、b-catenin及 E-cadherin相互作用，激活MAPK及PI3K/AKT途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、分化并與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，起癌基因的作用［29-31］。而IQGAP2與IQGAP1明顯的促癌作用不同，其在腫瘤中起抑癌基因的作用。研究顯示，IQGAP2在高級(jí)別前列腺癌中表達(dá)顯著下降，IQGAP2的高表達(dá)與E-Cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，與AKT的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［32］;在小鼠體內(nèi)，Iqgap2的缺失可使小鼠發(fā)生肝細(xì)胞性肝癌，但I(xiàn)qgap1的缺失可使Iqgap2_/_小鼠的腫瘤生長(zhǎng)得到抑制，在肝癌細(xì)胞中IQGAP1與IQGAP2的表達(dá)也呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)［33］。IQGAP3能提高肺癌細(xì)胞中ERK1的磷酸化水平，參與EGFR-ERK途徑的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及浸潤(rùn)［34］。

IQGAP2在腫瘤細(xì)胞中同樣受啟動(dòng)子甲基化的調(diào)節(jié)。在胃癌細(xì)胞中，啟動(dòng)子甲基化使IQGAP2的蛋白表達(dá)下降，并可使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)能力增強(qiáng)，使用去甲基化藥物可使IQGAP2表達(dá)升高［35］。采用中藥厚樸提取物Honokiol可使HepG2肝癌細(xì)胞的IQGAP1表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞的遷移能力降低［36］。而此采用人工合成的IQGAP1 WW區(qū)多肽可以成功干擾IQGAP1-ERK1/2的結(jié)合，抑制RAS及RAF突變所致的腫瘤形成，并可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞)對(duì)靶向藥物BRAF抑制劑vemurafenib(PLX-4032)的敏感性，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活時(shí)間［37］。

RASA1/2/3/4 RASA1又稱p120RASGAP，位于5q13．3，共25個(gè)外顯子，產(chǎn)生2個(gè)剪接可變體，編碼的蛋白質(zhì)分別包含有1047及870個(gè)氨基酸殘基;RASA2位于3q22-q23，有25個(gè)外顯子，編碼長(zhǎng)約849個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì);RASA3位于13q34，有26個(gè)外顯子，編碼長(zhǎng)約834個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì);RASA4位于7q22，有23個(gè)外顯子，有2個(gè)可變剪接體，分別編碼長(zhǎng)757及803個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。

有關(guān)RASAs在惡性腫瘤中的研究較少。而已有的研究發(fā)現(xiàn)，RASA1的突變與血管畸形有關(guān)［38］。少數(shù)在惡性腫瘤細(xì)胞中(結(jié)腸癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞)的研究顯示，RASA1的SH3區(qū)可競(jìng)爭(zhēng)性抑制DLC1的Rho-GAP活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［39］。RASA2/3/4可能均可調(diào)節(jié)RAS通路活性，但迄今尚缺乏其在腫瘤中作用的報(bào)道［40］。

關(guān)于RASAs在腫瘤中的調(diào)節(jié)，目前僅少數(shù)研究顯示RASA1可受Hsa-mir-31、182的調(diào)節(jié)［41-42］，相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步豐富加強(qiáng)。

其他 其他RASGAPs成員還有位于6p21．3，編碼1343個(gè)氨基酸殘基，參與智力發(fā)育、與神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)的突觸 RAS-GTPase活化蛋白1(synaptic RASGTPase activating protein 1，SYNGAP1)［43］; 位 于9q33．3，有4個(gè)可變剪接體，編碼1478、1460、1439、1487個(gè)氨基酸殘基，參與細(xì)胞內(nèi)吞功能、EGFR的組裝、降解的GTPase活化蛋白VPS9域1(GTPase activating protein and VPS9 domains 1，GAPVD1)［44］。但其在腫瘤中的功能仍待進(jìn)一步研究。

展望

RASGAPs作為腫瘤抑制基因，對(duì)多種腫瘤在體內(nèi)、外均發(fā)揮抑制，但遺憾的是，它們?cè)诙喾N腫瘤中的表達(dá)均降低。通過去甲基化、有效中藥成分、小分子RNA干擾、人工合成多肽等手段提高其在腫瘤中的表達(dá)將可能成為對(duì)腫瘤，尤其是對(duì)RAS通路過度激活的腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)。此外，RASGAPs種類眾多，關(guān)于它們?cè)诟鞣N腫瘤中的表達(dá)情況如何以及它們?cè)谀[瘤中具體作用和相應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制迄今仍不甚清楚。因此，有關(guān)RASGAPs的研究值得深入進(jìn)行。

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Research Advances in the Role of RAS-GTPase-activating Proteins in Tumors

ZHANG Hong-kai，CHEN Jie

Department of Pathology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

A variety of molecules are involved in tumorigenesis，during which the RAS pathway-related molecules play key roles．RAS gene mutations exist in about 30%of human tumors;in some tumors(e．g．pancreatic adenocarcinomas)，the mutation rates may rise to 75%-95%．Even in tumors without RAS mutations，the RAS pathway-related molecules can also be highly activated．RAS-GTPase-activating proteins(RASGAPs) are a group of tumor suppressors．They normally turn off RAS pathway by catalyzing the hydrolysis of RAS-GTP．However，the mutation or hypermethylation of their promoters will inactivate their roles and thus provide an alternative mechanism of activating Ras．This article reviews the research advances in the role of RASGAPs in the development of tumors．

RAS GTPase-activating proteins;tumor

CHEN Jie Tel:010-69159356，E-mail:xhblk@163．com

R-1

A

1000-503X(2015)03-0364-06

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．024

2014-09-01)

陳 杰 電話:010-69159356，電子郵件:xhblk@163．com

國(guó)家自然科學(xué)基金(81472326)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81472326)