劉端勇，黃敏芳，徐 榮，王 馨，鄒 勇，岳海洋，黃小英，趙海梅

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西南昌 330025；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室，江西南昌 330004）

黃芪多糖對(duì)結(jié)腸炎大鼠小腸PP結(jié)中T淋巴細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用

劉端勇1，黃敏芳2，徐 榮2，王 馨2，鄒 勇2，岳海洋2，黃小英3，趙海梅4

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西南昌 330025；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室，江西南昌 330004）

Effect of Astragalus polysaccharides in regulating the T lymphocyte subgroup in intestinal PPs of rat with colitis

LIU Duan-yong1，HUANG Min-fang2，XU Rong2，WANG Xin2，ZOU Yong2，YUE Hai-yang2，HUANG Xiao-ying3，

ZHAO Hai-mei4
（1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine Science and Technology，Nanchang 330025，China；2.Jiangxi Universi-ty of Traditional Chinese Medcine in Postgraduate，Nanchang 330004，China；3.University of Tranditional Chinese Medicine of the Key Laboratory of Modern Preparation of TCM，Ministry of Education，Nanchang 330004，China；4.Scholl of Basic Medi-cal Sciences in Jiangxi University of Traditional Chinese Medi-cine，Nanchang 330004，China）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．029．html

黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是黃芪的主要活性成分之一，可有效治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎［1］，但其能否調(diào)節(jié)結(jié)腸炎大鼠小腸派爾集合淋巴結(jié)（peyer’s patch，PP結(jié)）中T淋巴細(xì)胞亞群水平尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，觀察小腸PP結(jié)中T淋巴細(xì)胞、CD25＋T淋巴細(xì)胞與Th17細(xì)胞的表達(dá)，以明確APS的可能作用機(jī)制。

1　材料

1．1動(dòng)物及分組 健康SD大鼠60只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，♂，體質(zhì)量（210±10）g，將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、APS（低、中、高劑量）組、美沙拉嗪對(duì)照組6組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后使用。

1．2藥物及試劑 APS購自于陜西森弗生物技術(shù)有限公司、美沙拉嗪購自佳木斯鹿靈制藥有限公司，2，4，6-trinitro-benzenesulfonic acid（TNBS）來自于Sigma公司。FITC Anti-Rat CD4 mAb、APC Anti-Rat CD3 mAb、PE Anti-Rat CD8a mAb、APC Anti-Rat CD4 mAb、PE Anti-Rat CD25 mAb、FITC Anti-Mouse／Rat Foxp3 mAb和FITC Anti-Rat IL-17 mAb購于ebioscience公司。DMSO、佛波酯、離子霉素、多聚甲醛等均購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)液和Hank′s液等均購自美國Gibco公司。

1．3儀器 低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf）；流式細(xì)胞儀（美國BD FACSC Canto II）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（力新儀器）。

2　方法

2．1造模［2］造模前禁食12 h，除正常組外，大鼠麻醉后，按100 mg·kg－1TNBS計(jì)算，將TNBS溶入0.3mL 50%乙醇配制TNBS乙醇復(fù)合溶液，將TNBS乙醇復(fù)合液注入距肛門約8 cm處，倒置大鼠15 min，放回原籠自然蘇醒，正常組注入等容積的50%乙醇。

2．2給藥方法 自造模后d 1起，按體重?fù)Q算，APS低、中、高劑量組分別為200、400、800 mg·kg－1APS，美沙拉嗪對(duì)照組給予150 mg·kg－1美沙拉嗪灌胃給藥，每日1次，共7 d。

2．3流式細(xì)胞術(shù)測T淋巴細(xì)胞水平 剖腹剪取小腸PP結(jié)，置于5%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，300目不繡鋼網(wǎng)碾磨濾過洗滌，離心后棄其上清。取100μL細(xì)胞溶液，分別加入CD4 mAb、CD3 mAb、CD8a mAb各0.3 μL，室溫下孵育30 min后，離心后棄上清，1%多聚甲醛的PBS固定上機(jī)檢測。

2．4流式細(xì)胞術(shù)測CD4＋CD25＋Foxp3＋T細(xì)胞的表達(dá)取上述細(xì)胞懸液，用1μL CD4 mAb、1μL CD25 mAb孵育30min，洗滌后，透膜固化液孵育1 h，加1 μL Foxp3 mAb孵育1h后，1%多聚甲醛PBS溶液固定后上機(jī)待測。

2．5流式細(xì)胞術(shù)測Th17細(xì)胞水平 PP結(jié)淋巴細(xì)胞懸液用50 μg·L－1PMA和1 g·L－1離子霉素刺激，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制酶布雷菲德菌素A繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用1 μL CD4、1 μL CD25 mAb孵育30 min，再經(jīng)洗滌后，透膜固化液孵育1 h，加1 μL IL-17 mAb孵育30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測。

2．6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SSPS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測結(jié)果均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3　結(jié)果

3．1流式細(xì)胞術(shù)測定小腸pp結(jié)CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞水平 APS高、中劑量組組CD4＋T淋巴細(xì)胞水平與模型組比較均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；CD8＋T淋巴細(xì)胞水平和CD4／CD8比值，則除低劑量組外，其他各組較模型組明顯降低（P＜0．05或P＜0．01）。

3．2流式細(xì)胞術(shù)測CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細(xì)胞及Th17細(xì)胞水平 Th17淋巴細(xì)胞水平僅見中劑量組較模型組明顯降低（P＜0.05）；而CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細(xì)胞水平和CD25／Th17比值，則可見APS高、中劑量組比模型組明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。

4　討論

PP結(jié)是腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在結(jié)腸炎癥發(fā)生后，PP結(jié)中CD4＋和CD8＋T淋巴細(xì)胞平衡被打破，腸道黏膜免疫平衡遭到破壞，腸黏膜屏障破壞，炎細(xì)胞浸潤，粘膜損傷發(fā)生［3］。CD25＋T淋巴細(xì)胞和Th17細(xì)胞都是CD4＋T細(xì)胞亞群，其二者功能恰恰相反，Treg細(xì)胞維持免疫耐受和抑制炎癥反應(yīng)，而Th17細(xì)胞則多產(chǎn)生致炎因子而促進(jìn)炎癥發(fā)生，二者失衡是炎癥性腸病的重要發(fā)病機(jī)制之一，因此調(diào)節(jié)二者之間的平衡是治療IBD的主要策略之一［4］。本實(shí)驗(yàn)中模型組小腸PP結(jié)中CD4／CD8升高、CD25／Th17降低，說明結(jié)腸炎大鼠腸黏膜免疫失衡。APS高、中劑量組均可降低CD4＋T淋巴細(xì)胞數(shù)量、調(diào)高CD8＋T淋巴細(xì)胞水平，同時(shí)明顯降低CD4／CD8比值，升高CD25＋T細(xì)胞水平和CD25／Th17比值，且APS中劑量還可降低Th17細(xì)胞水平，說明APS在一定劑量下可能降低CD4T及Th17細(xì)胞淋巴細(xì)胞，調(diào)高CD8＋、CD25＋T淋巴細(xì)胞，降低CD4／CD8及升高CD25／Th17來調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，從而降低異常免疫反應(yīng)的程度，減輕炎癥損傷，從而有效治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Yang M，Lin H B，Gong S，et al．Effect of Astragalus polysaccha-rides on expression of TNF-α，IL-1β and NFATc4 in a rat model of experimentalcolitis［J］．Cytokine，2014，70（2）：81－6．

［2］ 于海食，陳 浩，洪 纓，等．腸安康新組方抗?jié)冃越Y(jié)腸炎大鼠的機(jī)制研究［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（2）：282－5．

［2］ Yu H S，Chen H，Hong Y，et al．Mechanisms of new Chang-an-kang on ulcerative colitis in rat［J］．Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：282－5．

［3］ Yu X Y，Zou C L，Zhou Z L，et al．Phasic study of intestinal ho-meostasis disruption in experimental intestinal obstruction［J］．World J Gastroenterol，2014，20（25）：8130－8．

［4］ Sakaguchi S，Ono M，Setoguchi R，et al．Foxp3＋CD25＋CD4＋natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoim-mune disease［J］．Immunol Rev，2006，212（6）：8－27．

中國圖書分類號(hào)：R-332；R284．1；R322．45；R392．12

關(guān)鍵詞：黃芪多糖；結(jié)腸炎；CD4；CD8；CD25；Th17

Key words：Astragalus polysaccharide；colitis；CD4；CD8；CD25；Th17

作者簡介：劉端勇（1975－），男，博士，副教授，E-mail：liuduanyong＠163．com；黃小英（1975－），女，碩士，助理研究員，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床基礎(chǔ)，通訊作者，E-mail：8842100＠qq．com；趙海梅（1979－），女，博士，副教授，研究方向：潰瘍性結(jié)腸炎與中藥免疫藥理學(xué)，通訊作者，Tel：0791-86588407，E-mail：haimei79＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81460679，81260595）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No 20122BAB215046）；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃（No 2012A017）

收稿日期：2015－05－12，修回日期：2015－06－23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1328－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．029