劉 燦，蔡天宇，趙曉萌，馬蘭青，竇德泉，孫媛霞

［1．北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京 102206；2．中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）］

羅漢果提取物誘導(dǎo)肺癌細胞A549凋亡的研究

劉 燦1，2，蔡天宇1，趙曉萌1，馬蘭青1，竇德泉1，孫媛霞2

［1．北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京 102206；2．中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）］

中國圖書分類號：R284．1；R329．25；R734.202；R979.1

摘要：目的 探討羅漢果醇誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的作用及可能的分子機制。方法 通過分離、純化得到羅漢果醇單體，以肺癌細胞A549為對象，采用MTT法檢測羅漢果醇對肺癌細胞的抑制作用；利用熒光染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡、細胞周期；以蛋白印跡法檢測羅漢果醇對p21、Bcl-2蛋白表達的影響。結(jié)果 羅漢果醇能抑制肺癌細胞的增殖，具有促進細胞凋亡、阻滯細胞周期的作用；蛋白印跡檢測表明，羅漢果醇可以促進p21表達升高，Bcl-2表達下降。結(jié)論 羅漢果醇通過調(diào)節(jié)p21、Bcl-2的表達來誘導(dǎo)細胞凋亡和周期阻滯，從而促進肺癌細胞A549的凋亡。

關(guān)鍵詞：羅漢果；肺癌細胞A549；藥食兩用；細胞凋亡；p21；蛋白免疫雜交

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．025．html

肺癌作為高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤，對人們生命健康構(gòu)成巨大威脅。天然植物是藥物開發(fā)的重要來源，植物代謝產(chǎn)物具有天然的抗癌、抑癌效果，從植物代謝產(chǎn)物中篩選和發(fā)掘新的化合物是開發(fā)低毒高效抗癌藥物的重要途徑。

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為衛(wèi)生部首批公布的“藥食兩用”中藥材，《中國藥典》記載羅漢果具有清熱潤肺功效。羅漢果為葫蘆科植物，主要種植于我國廣西地區(qū)［1］。文獻報道，甜苷是羅漢果中的主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)羅漢果甜苷具有止咳、抗氧化、降糖、祛痰等作用［2－5］，說明羅漢果對肺部疾病具有明確的藥用效果。

我們對羅漢果中單體成分進行分離和活性篩選，發(fā)現(xiàn)羅漢果醇具有誘導(dǎo)肺癌細胞A549凋亡的作用。目前，針對羅漢果醇活性的研究較少，其抑制癌癥機制不詳。實驗首次探討了羅漢果醇對肺癌細胞的作用效果和機制，為羅漢果的“潤肺”功效提供了新線索，同時為羅漢果的藥物開發(fā)提供了參考和依據(jù)。

1　材料與方法

1．1試劑 羅漢果干果購自北京同仁堂藥店。常規(guī)化學(xué)試劑購自中國國藥公司。Annexin V-FITC／PI雙染試劑盒（BD公司）；p21、Bcl-2、β-actin蛋白抗體購自Sigma公司。XAD-16樹脂購自Rohm＆Haas公司；Diaion PA樹脂購自三菱公司。人肺癌細胞株A549購于上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，細胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640（Gibco公司）完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2羅漢果醇的制備 羅漢果醇的制備方法如下：①將羅漢果粉碎，按羅漢果與水質(zhì)量比為1∶6～8的比例加入水，在80～95℃條件下提取2次，每次2 h，合并提取液；②向提取液中加入絮凝劑，除去提取液中的鞣質(zhì)和可溶性蛋白，得到澄清的水溶液；③將所述水溶液采用XAD-16樹脂進行吸附，用30%～50%乙醇進行洗脫，得到富集羅漢果甜苷的水－乙醇混合溶液；④將所述混合溶液減壓濃縮，并回收乙醇，濃縮至浸膏狀，向浸膏中加入4～5倍質(zhì)量的去離子水，稀釋浸膏，得到粗品甜苷的水溶液；⑤將粗品甜苷的水溶液采用Diaion PA樹脂進行脫色處理，收集下柱液，得到富集液；⑥向所述富集液中加入鹽酸至終濃度0.5 mol·L－1，在80～90℃，反應(yīng)時間為6～8 h；⑦利用半制備液相色譜分離制得羅漢果醇。其HPLC圖如Fig 1所示（色譜條件：反相C18柱；紫外檢測波長為214 nm；流動相為乙腈／水，0～20 min，25%乙腈；20～40 min，25% ～50%乙腈；40～60 min，50%乙腈等度洗脫。流速為1.0 mL·min－1；柱溫25℃），得到純度＞98%的羅漢果醇。

Fig 1 HPLC of mogrol

1．3細胞活力檢測 胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的肺癌細胞A549，調(diào)整細胞濃度至1×106·L－1，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。加入100 μL含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，使藥物終濃度分別為0.1、1、10、100、200、250 μmol·L－1，培養(yǎng)24 h后，進行MTT比色分析：向板孔中加入濃度為5 g ·L－1MTT液15 μL，37℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加DMSO 150 μL，搖床震蕩10 min，置于酶標儀490 nm檢測吸光度（A），按以下公式計算抑制率：細胞生長抑制率／%＝（對照組A490－試驗組A490）／對照組A490× 100%。

1．4細胞形態(tài)觀察 將經(jīng)嚴格消毒的蓋玻片置于6孔板中，選取對數(shù)生長期的肺癌細胞A549，將細胞調(diào)至濃度1×107·L－1，轉(zhuǎn)移至6孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后加入藥物，使藥物的終濃度分別為0、10、100 和250 μmol·L－1，培養(yǎng)24 h后，吸出廢液，每孔加入0.5 mL固定液，固定25 min，PBS洗2次，每次洗3 min，加入Hoechst 33258染液，室溫避光染色20 min。使用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1．5細胞凋亡檢測 選取對數(shù)生長期的肺癌細胞A549，用藥物培養(yǎng)24 h后，收集細胞，用200 μL冷PBS洗滌細胞2次，收集細胞；加入50 μL的結(jié)合液（binding buffer）重懸細胞，加入2 μL的Annexin V-FITC混勻，加入5 μL PI混勻，避光、室溫作用10 min，進行流式細胞儀檢測。

1．6細胞周期檢測 選取對數(shù)生長期的肺癌細胞A549，分別用不同濃度羅漢果醇培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶消化，收集用藥組和對照組細胞，用PBS洗滌細胞2次，70%冷乙醇（－20℃）固定，4℃過夜，離心去乙醇，用1 mL的PBS洗細胞1次，加入含RNase A的PBS 500 μL，再加入碘化丙啶（PI）染色混勻（RNase A終濃度為50 mg·L－1，PI終濃度為25 mg·L－1），37℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測。

1．7p21、Bcl-2蛋白表達的分析 肺癌細胞A549藥物培養(yǎng)24 h。終止細胞培養(yǎng)后，吸除培養(yǎng)液，PBS （0.01 mol·L－1，pH 7.4）洗滌，加入含PMSF裂解液50 μL每孔，置冰浴裂解30 min，14 000 r·min－1離心10 min，獲得總蛋白。BCA比色法測蛋白濃度，取50 μg總蛋白，經(jīng)12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶（含0.1%Tween 20）封閉1 h，加抗體p21、Bcl-2以及β-actin，一抗4℃孵育過夜（β-actin作為上樣量對照）；TBS-T洗膜3次，每次5 min；加辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h，用漂洗液（TBS-T）洗膜3次，每次10 min，加入ECL避光孵育5 min，熒光影像分析儀顯影、掃描、分析。

1．8統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用±s表示。采用t檢驗。

2　結(jié)果

2．1羅漢果醇對肺癌細胞增殖的抑制作用 MTT

實驗結(jié)果如Fig 2所示，羅漢果醇具有抑制肺癌細胞A549增殖的作用，隨著藥物濃度的增加，其抑制率也隨之增加（P＜0.05），顯示羅漢果醇對A549細胞具有抑制作用。

Fig 2 Inhibitory effects of mogrol on proliferation of A549 cells with different doses

2．2羅漢果醇對肺癌細胞形態(tài)的影響 熒光染色結(jié)果如Fig 3所示，對照組細胞核完整，著色均勻，熒光成彌散狀，未出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象；藥物組中，隨藥物濃度的升高，細胞染色質(zhì)呈顆粒熒光狀，細胞出現(xiàn)皺縮，細胞核發(fā)生裂解，出現(xiàn)細胞凋亡的典型特征，說明羅漢果醇具有誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的作用。

2．3羅漢果醇對細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果表明，羅漢果醇可誘發(fā)肺癌細胞A549凋亡，隨著羅漢果醇濃度的升高，凋亡細胞比

例逐步增加（Fig 4），與“2．2”結(jié)果一致，進一步說明羅漢果具有誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的作用。

Fig 3 Fluorescence photomicrograph of A549 cells stained with Hoechst 33258（×400）

Fig 4 Effect of mogrol on apoptosis of A549 cells

2．4羅漢果醇對細胞周期的調(diào)控 誘發(fā)細胞周期阻滯是藥物抑制癌細胞增殖的重要途徑。如Fig 5所示，經(jīng)羅漢果醇處理后，A549細胞細胞周期分布發(fā)生明顯變化，隨著羅漢果醇濃度的增加，處于G0／G1期細胞的比例逐漸升高，S期、G2期細胞數(shù)量則與藥物濃度呈負相關(guān)，說明羅漢果醇能阻斷A549細胞周期進程，誘導(dǎo)A549細胞G0／G1期阻滯。

Fig 5 Effect of mogrol on cell-cycle distribution in A549 cells

2．5羅漢果對p21、Bcl-2蛋白的影響 Bcl-2為抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞的程序性凋亡。如Fig 6B所示，經(jīng)過羅漢果醇處理的A549細胞，其Bcl-2蛋白的表達明顯下降，Bcl-2蛋白的表達量與羅漢果醇劑量呈現(xiàn)負相關(guān)，這也是羅漢果醇促進癌細胞凋亡的重要原因。p21作為重要的細胞周期調(diào)控蛋白，對細胞周期的進程發(fā)揮重要作用，過量的p21表達能干預(yù)細胞周期由G1期向S期發(fā)展進程。蛋白免疫實驗表明，藥物能上調(diào)p21蛋白的表達（Fig 6A），而p21的過表達可誘發(fā)細胞阻滯于G0／G1期，與細胞周期檢測的結(jié)果一致。

3　討論

羅漢果收錄于我國衛(wèi)生部發(fā)布的“藥食同源”藥物名單之中。此外，羅漢果提取物通過了美國FDA認證，從自身的藥用價值和安全性而言，羅漢果提取物具有被開發(fā)成為低副作用藥物的潛力。

本研究從羅漢果中分離得到羅漢果醇單體，MTT法檢測顯示，羅漢果醇對A549細胞具有抑制作用。Hoechst 33258染色觀察、Annexin V-FITC／PI流式分析證實了羅漢果醇具有促進肺癌細胞A549凋亡的作用。流式細胞檢測同時發(fā)現(xiàn)，羅漢果醇具有誘發(fā)細胞周期阻滯的效果，經(jīng)藥物處理，A549細胞周期分布發(fā)生改變，G1期細胞比例升高，S期和G2期細胞比例降低，藥物誘導(dǎo)細胞發(fā)生G0／G1期阻滯。從以上結(jié)果分析，羅漢果醇可能通過促進細胞凋亡、誘導(dǎo)細胞周期阻滯實現(xiàn)對腫瘤細胞生長的抑制作用。

Fig 6 Effects of mogrol on expression of p21 and Bcl-2 in A549 cells

針對羅漢果醇誘導(dǎo)細胞凋亡、細胞周期阻滯的現(xiàn)象，本研究對A549中周期蛋白、抗凋亡蛋白的表達情況進行了檢測。文獻報道，周期蛋白p21在細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6－7］，p21的上調(diào)可阻斷細胞周期進程［7－8］。Western blot結(jié)果顯示，藥物上調(diào)了A549細胞中p21蛋白的表達，藥物可能通過上調(diào)p21從而導(dǎo)致細胞發(fā)生G1期阻滯。Bcl-2蛋白具有抑制細胞凋亡的作用［9－11］，羅漢果醇能明顯下調(diào)A549細胞中Bcl-2蛋白的表達（P＜0.01），通過下調(diào)細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而促進了A549的凋亡。本研究表明，羅漢果提取物具有抑制肺癌細胞增殖的作用，其分子機制還有待進一步研究分析。

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Apoptosis effect of Siraitia grosvenorii extracts on lung cancer cells A549 and its mechanisms

LIU Can1，2，CAI Tian-yu1，ZHAO Xiao-meng1，MA Lan-qing1，DOU De-quan1，SUN Yuan-xia2
［1．Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2．Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China］

Abstract：Aim To study the apoptosis effect of Sir-aitia grosvenorii extract on human lung cancer cells A549 and its mechanisms．Methods MTT assay was applied to determine A549 cell proliferation．Hoechst 33258 staining was applied to investigate morphological changes in A549 cells．To find out the cause of cell growth inhibition，several experiments on cell cycle distribution and apoptosis were performed by flow cy-tometry analysis．The expression of p21 and Bcl-2 was determined by Western blot．Results Flow cytometry analysis showed that treatment with mogrol arrested A549 cells in the G0／G1phase and induced apoptosis．After treatment with Siraitia grosvenorii extract，West-ern blot experiment showed cell cycle regulator p21 was up-regulaed，while the apoptosis inhibitor Bcl-2 was down-regulated．Conclusion Treatment with Siraitia grosvenorii extract arrests the A549 cells at G0／G1phase and induces apoptosis that may contribute to the anti-proliferation activity of mogrol through the regula-tion of p21 and Bcl-2 expression．

Key words：Siraitia grosvenorii；lung cancer cells A549；medicinal and edible；apoptosis；p21；Western blot

作者簡介：劉 燦（1983－），男，博士，講師，研究方向：天然藥物，E-mail：liucan808＠163．com；竇德泉（1962－），男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物、植物資源開發(fā)，通訊作者，Tel：010-80799163，E-mail：doud-equan＠126．com；馬蘭青（1971－），男，博士，教授，研究方向：植物次生代謝產(chǎn)物生物合成分子調(diào)控與代謝，通訊作者，Tel：010-80797305，E-mail：lqma＠bac．edu．cn

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）資助項目（No 2012AA021403）；天津市企業(yè)博士后創(chuàng)新項目擇優(yōu)資助計劃項目（一等資助項目）

收稿日期：2015－04－09，修回日期：2015－05－29

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1310－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．025