黃 勇，胡 杰，陸 苑，鄭 林，蘭燕宇，李勇軍

（貴陽醫(yī)學(xué)院1．貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2．民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3．藥學(xué)院，貴州貴陽 550004）

UPLC-MS法測(cè)定大鼠血漿中葒草花的3個(gè)指標(biāo)成分及其藥動(dòng)學(xué)研究

黃 勇1，3，胡 杰1，陸 苑1，3，鄭 林1，3，蘭燕宇2，3，李勇軍2，3

（貴陽醫(yī)學(xué)院1．貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2．民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3．藥學(xué)院，貴州貴陽 550004）

中國圖書分類號(hào)：R-332；R282.71；R284.1；R969.1

摘要：目的 建立UPLC-MS法測(cè)定大鼠口服葒草花提取物后血漿中原兒茶酸、山柰素－葡萄糖、槲皮苷的分析方法，并用該方法研究原兒茶酸等3個(gè)指標(biāo)成分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。方法 血漿樣品選擇酸化后甲醇沉淀蛋白，Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）柱，流速：0.30 mL·min－1，流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈－0.1%甲酸水梯度洗脫，采用電噴霧電離源（ESI），掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（SIR）。結(jié)果 3種成分分別在2.74～677、0.69～186、0.82～200 μg·L－1呈良好線性關(guān)系。提取回收率、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均良好達(dá)到測(cè)定要求。原兒茶酸、山柰素－葡萄糖和槲皮苷3個(gè)指標(biāo)成分的Tmax（h）分別為0.46±0.1、0.79±0.33和2.63± 4.6，Cmax（μg·L－1）分別為463.8±207.81、18.53±7.82和137.38±71.09。結(jié)論 建立的UPLC-MS檢測(cè)方法具有特異、快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，能夠同時(shí)測(cè)定生物樣品中原兒茶酸等3種成分的血藥濃度，并成功應(yīng)用于葒草花在正常大鼠體內(nèi)這3個(gè)指標(biāo)成分的藥動(dòng)學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：葒草花；大鼠；UPLC-MS；原兒茶酸；山柰素－葡萄糖；槲皮苷；藥代動(dòng)力學(xué)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．026．html

葒草花為蓼科植物葒蓼（Polygonum orientale L．）的花序，又名水葒花；葒草花具有行氣活血，消積，止痛的功效，用于治療頭痛、心胃氣痛、腹中痞積等。課題組在對(duì)葒草各部位藥理篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，葒草花水煮醇沉后的正丁醇萃取部位有較強(qiáng)的抗心肌缺血，減少心肌梗死面積作用?；瘜W(xué)成分研究表明，主要含有酚酸類的原兒茶酸及黃酮類的山柰素

－葡萄糖苷、槲皮苷等成分，文獻(xiàn)報(bào)道該類化合物為主要活性成分［1］。

為此，課題組以原兒茶酸、山柰素－葡萄糖苷和槲皮苷為指標(biāo)性成分，研究大鼠灌胃葒草提取物后體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，考察3個(gè)指標(biāo)成份在大鼠體內(nèi)的經(jīng)時(shí)過程，獲得其動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為進(jìn)一步研究開發(fā)葒草及其制劑奠定基礎(chǔ)［2－3］。

1　材料與方法

1．1藥品與試劑 原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)809－200102，純度≥0.98，中國藥品生物制品鑒定所）；葛根素（批號(hào)0752－9605，純度≥0．98，中國藥品生物制品鑒定所）；槲皮苷對(duì)照品、山柰素－葡萄糖對(duì)照品對(duì)照品（均自制，純度≥0.98）；甲醇、乙腈和甲酸等試劑均為色譜純。

1．2儀器 WATERS ACQUITY UPLC超高壓液相三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（二元梯度泵，真空脫氣機(jī)，柱溫箱，Masslynx 4．1質(zhì)譜工作站，自動(dòng)進(jìn)樣器）；Al-legra 64R低溫高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；AE240十萬分之一電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；MTN-2800D氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；CQ 250A-TS超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；ZH-2渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1．3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠♀♂兼用，體質(zhì)量為（230±20）g，由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供［批號(hào)SCXK（黔）2002－0001］。

1．4藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理 采用DAS2．0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算和數(shù)據(jù)擬合，選取最小AIC值擬合房室模型，AUC0－t，MRT等參數(shù)選用統(tǒng)計(jì)矩方法計(jì)算。并對(duì)AUC0－t，MRT進(jìn)行方差分析確定其動(dòng)力學(xué)模型。

1．5標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1．5．1原兒茶酸等3種物質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取原兒茶酸、槲皮苷和山柰素－葡萄糖適量，用甲醇定容至10 mL。獲得原兒茶酸（1.202 g ·L－1）、槲皮苷（1.200 g·L－1）和山柰素－葡萄糖（1.216 g·L－1）的儲(chǔ)備液。分別精密量取原兒茶酸等3種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。置冰箱（－20℃）保存，備用。

1．5．2內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取葛根素（10.33 mg），用甲醇定容至25 mL。獲得葛根素（0.4 132 g ·L－1）的儲(chǔ)備液。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成2 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)溶液，置冰箱（－20℃）保存，備用。

1．6色譜條件 色譜柱Waters BEH C18（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）柱，保護(hù)柱：Waters Van Guard BEH C18（2.1 mm×5 mm，1.7 μm），柱溫：45℃，流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈－0．1%甲酸水梯度洗脫。進(jìn)樣體積為1 μL。液相梯度見Tab 1。

Tab 1 Four components chromatographic conditions

1．7質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI），毛細(xì)管電離電壓：3 kV，離子源溫度：120℃；噴霧氣與反吹氣：氮?dú)?，去溶劑氣流速?50 L·h－1，掃描方式為選擇性離子監(jiān)測(cè)（SIR），原兒茶酸等3種成分及內(nèi)標(biāo)用于定量分析的監(jiān)測(cè)離子，見Tab 2。

Tab 2 Three components mass spectrometric conditions

1．8血漿樣品處理方法 取大鼠血漿100 μL，置1.5 mL塑料離心管中，補(bǔ)加50 μL甲醇，依次加入2 mg·L－1內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，50 μL 1%甲酸，400 μL甲醇，渦混1 min，超聲5 min，離心10 min（4℃、15 000r·min－1），取上清液置離心管中，48℃下氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑锛?00 μL甲醇復(fù)溶，超聲10 min，渦混1 min，離心10 min（4℃、15 000 r·min－1），取上清液48℃下氮?dú)獯蹈?，殘留?00 μL初始流動(dòng)相溶解，取上清液進(jìn)樣UPLC-MS分析。

1．9實(shí)驗(yàn)方案與樣品檢測(cè) 健康Wistar大鼠6只，♀♂兼用，體質(zhì)量為（230±20）g，給藥劑量分別為2．5 g·kg－1，給藥前12 h禁食，自由飲水。口服灌胃葒草花提取物溶液。于給藥后5、10、15、30、60 min，2 h、3 h、5 h、7 h、9 h、12 h、24 h、36 h經(jīng)尾靜脈取血約0.4 mL置涂有肝素的塑料離心管中，4 500 r ·min－1離心8 min，分離血漿于－20℃冰箱中保存，直至分析。

2　結(jié)果

2．1UPLC-MS分析方法的確證

2．1．1專屬性 在其選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下原兒茶酸、山柰素－葡萄糖苷、槲皮苷3種物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)葛根素監(jiān)測(cè)離子反應(yīng)分別為m／z 153.0、m／z 449.3、m／z 449.2、m／z 417.2?？瞻籽獫{、空白血漿外加原兒茶酸等3種物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)以及大鼠給藥后血漿樣品色譜圖，原兒茶酸等3種物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為（1.25、2.70、2.78和1.73 min），各成分間分離良好，未見血漿中雜質(zhì)干擾。

Fig 1 Typical UPLC-MS chromatograms of rat blank plasma（A）；blank plasma spiked with three components and IS（B）；the rat plasma sample collected at 30 min after i．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Poly-gonumorientale L．extract to rat（C）；1．protocatechuie acid；2．puerarin （IS）；3．kaempferol-3-O-β-D-glucoside；4．quercitrin

2．1．2線性范圍和靈敏度 取大鼠空白血漿100 μL，依次加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，配制成相當(dāng)于大鼠血漿藥物濃度為見Tab 3，按“1.8血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（A／Ai）為縱坐標(biāo)Y，各物質(zhì)濃度（C）為橫坐標(biāo)X進(jìn)行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1／X，求的直線方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。大鼠血漿中原兒茶酸等3種成分在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。典型大鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍見Tab 4。

Tab 3 Concentrations of the four standard calibration samples（μg·L－1）

Tab 4 Mean values of regression equation of the analytes in rat plasma

2．1．3準(zhǔn)確度和精密度按 “2．1．2標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下分別配制3種成分大鼠血漿高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），按“1.8血漿樣品處理方法”項(xiàng)下平行操作，每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。每個(gè)系列濃度做6份，計(jì)算日內(nèi)精密度；3種濃度連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果表明原兒茶酸等3種成分日內(nèi)和日間精密度RSD（%）均小于20%，準(zhǔn)確度范圍為88.28%～109.51%，提示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

2．1．4提取回收率 取大鼠空白血漿100 μL，按“2．1．2標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下分別配制3種成分的大鼠血漿低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，以200 μL初始流動(dòng)相溶解，記錄其峰面積。另取空白血漿，按“1．8血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作。離心后獲得上清液，加入與上述相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析），于48℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL初始流動(dòng)相溶解，獲得相應(yīng)峰面積值。以每一濃度的兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率，對(duì)原兒茶酸等3種成分線性范圍內(nèi)高、中、低3個(gè)濃度的血漿樣品提取回收率進(jìn)行了考察。結(jié)果表明原兒茶酸等3種成分的回收率分別為：104.55%～107.45%、92.45%～100.82%、93.36%～97.39%，提示該方法可行。

2．1．5穩(wěn)定性考察 按“2．1．2標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下分別配制原兒茶酸等3種成分的大鼠血漿低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），樣品處理后至自動(dòng)進(jìn)樣器中，在6 h分別進(jìn)樣，以每一濃度3樣本分析。結(jié)果表明原兒茶酸等3種成分的處理后血漿樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中6 h均穩(wěn)定。同法配制低、中、高3個(gè)濃度血漿樣品（QC），分別在室溫（約20℃）下放置6 h，4℃下冷藏8 h，凍融3次，經(jīng)處理后進(jìn)樣測(cè)定濃度，以每一濃度3樣本分析。結(jié)果表明，3種成分血漿樣品在室溫下放置6 h，4℃下冷藏8 h和經(jīng)3次凍融循環(huán)均很穩(wěn)定。

2．2大鼠給藥后血漿濃度及藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) 大鼠口服葒草花提取物后，原兒茶酸等3種物質(zhì)的濃度測(cè)定結(jié)果見Tab 5，平均血藥濃度－時(shí)間曲線（Fig 2）。采用DAS2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并對(duì)藥物在大鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行房室模型擬合并計(jì)算其相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見Tab 6。

Tab 5 Mean plasma concentrations（μg·L－1）of three components after i．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（±s，n＝6）

Tab 5 Mean plasma concentrations（μg·L－1）of three components after i．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（±s，n＝6）

Time／h　Protocatechuie acid Kaempferol-3-O-β-D-glucoside Quercitrin 0．083　154．12±132．75　6．30±1．69　45．23±18．38 0．17　257．70±190．98　8．61±4．53　48．19±22．58 0．25　361．04±259．28　13．15±9．87　90．64±68．22 0．5　386．29±114．37　13．73±6．43　98．02±46．88 1 263．71±45．90　10．31±3．80　73．22±31．43 2 193．35±47．23　5．35±2．17　39．96±4．82 3 126．57±69．20　5．20±0．71　42．82±10．66 5 39．04±20．73　4．24±2．14　39．61±9．08 7 15．97±10．86　2．23±1．47　33．66±22．21 9 5．82±7．49　3．07±3．31　35．92±27．74 12　2．15±1．08　3．38±2．88　38．47±20．80 24　3．90±1．77　1．66±1．48　19．70±8．02 36　5．11±2．36　2．30±2．83　16．80±15．29

Tab 6 Pharmacokinetic parameters of three components afteri．g of 2．5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（n＝6）

3　討論

生物樣品檢測(cè)方法的建立和驗(yàn)證是整個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)，由于進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究的生物樣品存在濃度較低，基質(zhì)環(huán)境復(fù)雜等難題，因此，如何建立快速有效、靈敏可靠的生物樣品分析方法將是本課題擬解決的關(guān)鍵問題之一，以實(shí)現(xiàn)高通量生物樣品分析過程，滿足藥代動(dòng)力學(xué)研究大樣本量的要求［4］。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)使用乙腈比甲醇各物質(zhì)的峰形較好。待測(cè)成分基本大多是黃酮類的成分，在實(shí)驗(yàn)中有機(jī)相和水相均加入了0．1%的甲酸，甲酸的加入可以有利于它們以游離狀態(tài)存在。同時(shí)實(shí)驗(yàn)最開始用的是Waters C18（2.1 mm× 50 mm）的色譜柱，分離效果不理想，山奈素－葡萄糖苷與槲皮苷的分離難度較大，后用2.1 mm×100 mm的色譜柱進(jìn)行替換，兩者能得到較好的分離。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用負(fù)離子檢測(cè)模式線性不理想，可能是管道中存留的磷酸的影響，最后3種黃酮類成分選擇正離子檢測(cè)模式，酚酸類的原兒茶酸選擇負(fù)離子檢測(cè)模式，結(jié)果良好。

Fig 2 Concentration-time profiles of three components after i．g of 2.5 g·kg－1of the flower of Polygonumorientale L．extract to rat（n ＝6）

被測(cè)成分原兒茶酸、山奈素－葡萄糖苷和槲皮苷均為極性較大的弱酸性化合物，在酸性條件下處于非解離狀態(tài)，有利于被測(cè)成分的提取。因此我們對(duì)在血漿樣品處理中是否加酸及加酸的種類進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加酸后明顯有利于被測(cè)成分的提?。煌瑫r(shí)不同的酸（甲酸、鹽酸、磷酸）對(duì)其提取效

率也不同，其中甲酸的效果最好，因此我們?cè)跇悠诽幚頃r(shí)加入了50 μL 1%甲酸［5－7］。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心聯(lián)合完成。真誠感謝貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心為本實(shí)驗(yàn)開展提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)耗材與儀器設(shè)備。真誠感謝實(shí)驗(yàn)室各位同事、老師在實(shí)驗(yàn)中給予我的指導(dǎo)與幫助。）

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Pharmacokinetics of three index components in flower of Polygonumorientale L．in rat plasma by UPLC-MS

HUANG Yong1，3，HU Jie1，LU Yuan1，3，ZHENG Lin1，3，LAN Yan-yu2，3，LI Yong-jun2，3
（1．Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，School of Pharmacy，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China；2．Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM（Ministry of Education），Guiyang Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China；3．School of Pharmacy，
Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China）

Abstract：Aims To establish a UPLC-MS method for quantifying protocatechuie acid，kaempferol-3-O-β-D-glucoside and quercitrin and to investigate the pharma-cokinetics of three indix components in flower of Poly-gonumorientale L．in rat plasma．Methods The anal-ysis was achieved by BEH C18column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with a mobile phase composed of 0.1% formic acid using step gradient elution．A TQD tandem mass spectrometry equipped with electrospray ionization source was used as detector and operated by selected ion recording（SIR）mode．Results In the selected linear range，calibration curves of the three markers components showed good linearity．Extraction recovery rate，precision，accuracy and stability reached the de-termination request．The parameters of Tmax（h）in three index components were 0.46±0.1，0.79±0.33 and 2.63±4.6，respectively；Cmax（μg·L－1）in three index components were 463.8±207.81，18.53±7.82 and 137.38±71.09，respectively．Conclusion The fully validated UPLC-MS method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of the three index components in flower of Polygonumorientale L．in rat plasma．

Key words：flower of Polygonumorientale L．；rat；UP-LC-MS；protocatechuie acid；kaempferol-3-O-β-D-glu-coside；quercitrin；pharmacokinetics

作者簡(jiǎn)介：黃 勇（1976－），男，教授，研究方向：中藥活性成分及新藥開發(fā)，Tel：0851-6908899，E-mail：hujie51619＠sina．cn；李勇軍（1973－），男，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及新藥開發(fā)，通訊作者，Tel：0851-6908899，E-mail：759843 553＠qq．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81360664）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（黔科合重G字［2013］4001）；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（黔教合協(xié)同創(chuàng)新字［2013］04）

收稿日期：2015－04－29，修回日期：2015－06－20

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1314－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．026