劉玉玲，汪煜華，張秀芹，李冬花，黃紅林

（1．湖南省高等學(xué)校藥物蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽(yáng) 421001；2．婁底市衛(wèi)生學(xué)校，湖南婁底 417000）

染料木素拮抗對(duì)氧磷誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈組織p22phox表達(dá)上調(diào)

劉玉玲1，2，汪煜華1，張秀芹1，李冬花1，黃紅林1

（1．湖南省高等學(xué)校藥物蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽(yáng) 421001；2．婁底市衛(wèi)生學(xué)校，湖南婁底 417000）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-322；R322．121；R595．4；R543.5；R977.6

摘要：目的 探討染料木素是否通過(guò)下調(diào)p22phox、Nox4的表達(dá)，抑制活性氧的生成而拮抗對(duì)氧磷損傷的血管內(nèi)皮功能。方法 取♂SD大鼠胸主動(dòng)脈。①溶媒對(duì)照組：用0.1%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理大鼠胸主動(dòng)脈30 min；②染料木素（genistein，GST）處理組：GST （100 μmol·L－1）處理大鼠胸主動(dòng)脈30 min；③對(duì)氧磷（paraoxon，PO）處理組：PO（40.5 μmol·L－1）處理大鼠胸主動(dòng)脈30 min；④PO＋GST處理組：PO（40.5 μmol·L－1）＋GST（100 μmol·L－1）處理大鼠胸主動(dòng)脈30 min。RT-PCR法檢測(cè)各組p22phox、Nox4 mRNA表達(dá)的變化；Western blot觀察p22phox和Nox4蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 較之溶媒對(duì)照組，PO處理可使p22phox、Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加；GST處理則使p22phox、Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯減少；PO＋GST共同處理組，Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)增加。與PO單獨(dú)處理組比較，PO＋GST共同處理組p22phox mRNA及蛋白表達(dá)明顯減少。結(jié)論 對(duì)氧磷可通過(guò)上調(diào)血管組織p22phox、Nox4 mRNA和蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮氧化損傷；染料木素可下調(diào)二者的表達(dá)，保護(hù)血管內(nèi)皮。

關(guān)鍵詞：染料木素；對(duì)氧磷；氧化性損傷；NADPH氧化酶；p22phox；Nox4

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．022．html

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS是誘發(fā)心血管疾病的潛在危險(xiǎn)因素。ROS可降解一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），并直接滅活NO；ROS還能通過(guò)與底物的相互作用，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)；通過(guò)激活核因子-κB（NF-κB）及轉(zhuǎn)錄活化因子（AP-1）而引發(fā)細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步促進(jìn)損傷的血管內(nèi)皮處的炎性反應(yīng)；同時(shí)ROS還能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖。所有這些都可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。

體內(nèi)有多種酶參與了ROS的生成，目前研究表明［1］，NADPH氧化酶在多種因素刺激內(nèi)皮細(xì)胞生成ROS的過(guò)程中起主要作用。NADPH氧化酶在體內(nèi)主要分布于吞噬細(xì)胞，另外也分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等非吞噬細(xì)胞。近來(lái)的研究表明，NADPH氧化酶由6種亞基構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞上有其主要功能亞基Nox4及p22phox亞基的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，異位表達(dá)的Nox4可與p22phox結(jié)合形成復(fù)合物，增加Nox4的穩(wěn)定性；同時(shí)Nox4也能促進(jìn)p22phox的表達(dá)，促進(jìn)依賴Nox4 的ROS產(chǎn)生［2－3］。

對(duì)氧磷（paraoxon，PO）是有機(jī)磷酸酯類在體內(nèi)的活性代謝形式。PO可引起機(jī)體產(chǎn)生大量過(guò)氧化物及氧自由基，抑制對(duì)氧磷酶-1（PON1）的過(guò)氧化物酶樣作用，抑制SOD活性，誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。我們?cè)缙谕ㄟ^(guò)離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了PO可導(dǎo)致大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能（EDR）損傷，引起血管舒縮功能異常［4］。

染料木素（genistein，GST）為一種植物雌激素，廣泛存在于豆科植物中。很多研究都證實(shí)，GST具有抗氧化活性，可對(duì)抗DNA氧化損傷［5－6］。GST具有多羥基酚結(jié)構(gòu)，可直接與超氧陰離子等自由基結(jié)合，抑制氧自由基反應(yīng)及脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)；GST可升高SOD的活性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平，并上調(diào)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的水平和活性，加快氧自由基的清除［7－8］；抑制NADPH氧化酶p22phox亞基的表達(dá)，抑制ROS的產(chǎn)生［9］。GST的抗氧化作用可避免或減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，維持血管內(nèi)皮的正常功能。本實(shí)驗(yàn)室早期研究發(fā)現(xiàn)，GST可明顯改善PO誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能異常，維持血管正常舒縮功能［4］。

綜上所述，PO引起機(jī)體氧化應(yīng)激，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，血管正常結(jié)構(gòu)和功能受損。GST則具有抗氧化作用，減低氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮造成的損傷。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室早期大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴

性舒張功能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者推測(cè)GST通過(guò)其抗氧化作用對(duì)抗PO對(duì)血管功能的損傷。本實(shí)驗(yàn)旨在于探討PO氧化損傷血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能失調(diào)及GST抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮功能，是否均與NADPH氧化酶分布在血管內(nèi)皮上的p22phox與Nox4亞基的表達(dá)水平相關(guān)。本課題的研究將為有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥誘發(fā)心血管疾病的發(fā)生機(jī)制及GST對(duì)此類疾病可能的防治提供理論參考及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動(dòng)物與試劑 ♂SD大鼠20只，體質(zhì)量220 ～280 g，南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。對(duì)氧磷（Dr．Ehrenstorfer GmbH）；染料木素（杭州浙大泛科化工有限公司）；Nox4、p22phox引物［生工生物工程（上海）有限公司］；β-actin（235bp）引物［英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司］；β-actin（394bp）引物（上海捷倍思基因技術(shù)有限公司）；抗p22phox鼠單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）；抗Nox4兔單克隆抗體（Abcam）；抗β-actin鼠單克隆抗體（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)生物試劑。對(duì)氧磷、染料木素均用0．1%的DMSO溶解后，再用去離子水稀釋至所需濃度。

1．1．2儀器 pH計(jì)（MP220型，METTLER TOLE-DO）；高速低溫離心機(jī)（5810R型，Eppendorf）；紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2450型，SHIMADZU）；PCR儀、Mini-Protean垂直板電泳槽、濕轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）；瓊脂糖水平電泳槽（北京六一儀器廠）；酶標(biāo)儀（ELX 800，Bio-TEK INSTRU-MENTS．INC）。

1．2方法

1．2．1模型建立 ♂SD大鼠，頸椎脫臼處死，取出胸主動(dòng)脈，置于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天配制的充氧（95%O2／5%CO2）的冰Kreb’s液中［4℃，Kerb′s液用高壓處理后的0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制，調(diào)pH 7.2～7.4，于超凈工作臺(tái)濾過(guò)除菌］，剝離周圍結(jié)締組織，將胸主動(dòng)脈移置含10 mL Kerb′s液的安瓿瓶?jī)?nèi)，37℃恒溫，同時(shí)通入95%O2／5%CO2混合氣體。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組：①溶媒對(duì)照組：加入終濃度0.1% DMSO；②GST處理組：加入終濃度100 μmol·L－1的GST；③PO處理組：加入終濃度40.5 μmol·L－1的PO；④PO＋GST處理組：加入終濃度40.5 μmol ·L－1的PO＋終濃度100 μmol·L－1的GST。各組均于37℃下孵育血管30 min，取出，用冰PBS沖洗（0.1%DEPC水配制并高壓），置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2RT-PCR檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈p22phox和Nox4 mRNA的表達(dá) 各組標(biāo)本分置于各研缽中，加入液氮，于冰上研磨勻漿后，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取組織總RNA。取適量總RNA與6×load-ing buffer按5∶1的比例混勻后，于110 V恒壓下在2．0%的瓊脂糖凝膠中電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，若可見(jiàn)28S、18S、5S（此條帶也有可能降解）條帶，且28S條帶亮度是18S條帶亮度2倍左右，提取的總RNA合格，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將提取的總RNA稀釋，分別于260 nm、280 nm處測(cè)定其吸光度（A），計(jì)算A260／A280，比值在2左右時(shí)，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量合格；根據(jù)A260計(jì)算各組RNA濃度。根據(jù)計(jì)算所得各組RNA濃度，取等質(zhì)量1.5 μg RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)程序完成各組RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA），并以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。各引物序列及PCR反應(yīng)條件見(jiàn)Tab 1，各組擴(kuò)增目的基因的同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參照β-actin。PCR產(chǎn)物在2．0%的瓊脂糖凝膠中電泳，恒壓110 V，上樣量為10 μL，于凝膠成像系統(tǒng)中掃描分析產(chǎn)物條帶。將各組目的基因（p22phox、Nox4）與其內(nèi)參照（β-actin）擴(kuò)增條帶的吸光度比值作為目的基因mRNA表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。

Tab 1 p22phox，Nox4 and β-actin primer sequences and PCR reaction conditions

1．2．3Western blot檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈p22phox和Nox4蛋白的表達(dá) 各組標(biāo)本分置于各研缽中，加入液氮，研磨勻漿后，按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取組織總蛋白。

1．2．3．1蛋白濃度測(cè)定 按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)步驟，使用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定并計(jì)算各組蛋白濃度。

1．2．3．2SDS-PAGE凝膠電泳 根據(jù)相關(guān)抗體說(shuō)明書，目的基因p22phox蛋白條帶位于26 ku位置處，Nox4蛋白條帶位于63 ku位置處，β-actin蛋白條帶位于43 ku位置處，10%分離膠可較好分離20

～80 ku大小的蛋白質(zhì)，滿足上述3種蛋白質(zhì)分離要求。照凝膠配制試劑盒規(guī)定步驟制備10%分離膠，37℃恒溫放置30 min，制備濃縮膠，并于37℃恒溫放置40 min，待膠凝固，即可上樣。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，將各組不同濃度蛋白均稀釋至同一濃度，取等質(zhì)量等體積蛋白（70 μg，22 μL）按4∶1比例與5×蛋白上樣緩沖液（溴酚藍(lán)染料預(yù)染）混勻（總體積約27.5 μL），100℃煮沸5 min，即可上樣、電泳。濃縮膠的電泳條件為80 V恒壓，觀察蛋白條帶進(jìn)入分離膠后即調(diào)節(jié)電壓至120 V，待蛋白Marker各條帶跑開(kāi)，蛋白條帶接近凝膠底部時(shí)，即可停止電泳。

1．2．3．3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜 剪下比膠略小的PVDF膜，置甲醇中活化2 min。盤內(nèi)倒入適量轉(zhuǎn)膜液，按轉(zhuǎn)膜裝置從陰極到陽(yáng)極的順序，依次放上濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙，每一步均需去除氣泡。接通電源，恒流350 mA，3 h。

1．2．3．4免疫雜交 剪下p22phox、Nox4、β-actin所處位置PVDF膜，用TBST洗滌2次，5%封閉液封閉，置搖床上振搖1 h，TBST洗滌，分別加入用1%脫脂奶粉稀釋的1∶100 p22phox一抗，1∶200 Nox4一抗，1∶500 β-actin一抗，密封，與膜共振搖1 h，置4℃冰箱過(guò)夜。取出PVDF膜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶1 500的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，密封，于37℃放置30 min，室溫振搖1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。按照超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明滴加化學(xué)發(fā)光底物到PVDF膜上，觀察熒光現(xiàn)象，壓片、顯影、定影。定影后的X膠片掃描至計(jì)算機(jī)，圖像分析系統(tǒng)AlphaIm-ager 2200計(jì)算目的條帶的灰度值與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值的比值，作為目的蛋白表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，組間差異比較采用ANOVA及Dunnett-t、S-N-K多重比較。

2　結(jié)果

2．1染料木素、對(duì)氧磷對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈p22phox 和Nox4 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示（Fig 1），較之溶媒對(duì)照組，PO處理引起p22phox mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；GST處理導(dǎo)致p22phox mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；PO＋GST共同處理對(duì)p22phox mRNA表達(dá)的影響不大，差異無(wú)顯著性。但相對(duì)于PO處理組，PO＋GST共同處理可下調(diào)p22phox mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。

RT-PCR結(jié)果顯示（Fig 2），相對(duì)于溶媒對(duì)照組，PO處理引起Nox4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜ 0.01）；GST處理導(dǎo)致Nox4 mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；PO＋GST共同處理導(dǎo)致Nox4 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。但相對(duì)于PO處理組，PO＋GST共同處理對(duì)Nox4 mRNA表達(dá)的影響不大，差異無(wú)顯著性。

Fig 1 RT-PCR results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of p22phox mRNA in rat thoracic aorta tissues（n＝3）

2．2染料木素、對(duì)氧磷對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈p22phox 和Nox4蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示（Fig 3），較之溶媒對(duì)照組，PO處理引起p22phox蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；GST處理導(dǎo)致p22phox蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；PO＋GST共同處理后，較溶媒對(duì)照組，p22phox蛋白表達(dá)有所增加，但差異無(wú)顯著性。但相對(duì)于PO處理組，PO＋GST共同處理使p22phox蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。

Western blot結(jié)果顯示（Fig 4），與溶媒對(duì)照組比較，PO處理引起Nox4蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；GST處理導(dǎo)致Nox4蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；PO＋GST共同處理導(dǎo)致Nox4蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；相對(duì)于PO處理組，PO＋GST共同處理組Nox4蛋白表達(dá)有所降低，但差異無(wú)顯著性。

Fig 2 RT-PCR results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of Nox4 mRNA in rat thoracic aorta tissues（±s，n＝3）

Fig 3 Western blot results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of p22phox protein in rat thoracic aorta rings（±s，n＝3）

Fig 4 Western blot results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of Nox4 protein in rat thoracic aorta rings（±s，n＝3）

3　討論

心血管疾病目前已成為影響人類健康的頭號(hào)疾病，其發(fā)病機(jī)制和病理過(guò)程各異，已經(jīng)證實(shí)血管內(nèi)皮損傷與心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞可合成、分泌多種生物活性物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)血管緊張度、維持血管正常的舒縮功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、血管正常舒縮功能受損，誘發(fā)一系列病理性應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生。很多心血管疾病的早期誘因均牽涉到血管內(nèi)皮損傷、血管舒縮功能異常。

有機(jī)磷酸酯類（OPs）化合物是目前廣泛使用的一類農(nóng)藥，OPs侵入機(jī)體后，在體內(nèi)經(jīng)肝臟P450系統(tǒng)代謝為具有生物活性的PO。少量的PO可進(jìn)一步被PON1水解失活，隨尿液排出體外。但長(zhǎng)期或大量接觸OPs，可導(dǎo)致機(jī)體PON1濃度及活性降低［10］，PO水解排出減少。PON1具有抗氧化作用，可抑制血漿氧化物形成并清除血漿氧化物。體內(nèi)PO的蓄積可誘發(fā)氧化應(yīng)激，損傷血管內(nèi)皮，誘發(fā)心血管疾病。已有研究表明［11］，給兔長(zhǎng)期灌胃敵百蟲，可降低兔血清及肝PON1的活性，加速兔動(dòng)脈粥樣硬化的形成；Prozorovskiǐ等［12］研究也發(fā)現(xiàn)OPs可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞變形，并損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能；李鵬等［13］實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)氧磷（0.036 3～36.3 μmol·

L－1）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）及血管組織共孵30 min，濃度和時(shí)間依賴性地增加了單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，細(xì)胞萎縮；大鼠血管組織及細(xì)胞培養(yǎng)液中丙二醛（MDA）的含量增高、SOD活性降低、一氧化氮（NO）含量減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；且PO可濃度依賴性及時(shí)間依賴性抑制血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。

本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PO可濃度依賴性（0.004 05～40.5 μmol·L－1）抑制大鼠胸主動(dòng)脈EDR功能［4］。但PO損傷內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生除了與其直接毒性刺激作用及抑制機(jī)體抗氧化酶活性有關(guān)外，是否還涉及到內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的主要酶體——NADPH氧化酶，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠胸主動(dòng)脈PO損傷模型，檢測(cè)NADPH氧化酶在血管組織中的2個(gè)主要亞基p22phox、Nox4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PO能夠上調(diào)p22phox、Nox4 mRNA及蛋白的表達(dá)。從機(jī)體ROS的產(chǎn)生途徑初步探討了PO造成血管內(nèi)皮損傷的另一可能機(jī)制。

目前，實(shí)驗(yàn)室研究、臨床試驗(yàn)、流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)均表明攝入GST可降低心血管疾病發(fā)病率。大量研究資料表明GST具有確切的抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮、維持血管正常的舒縮功能的作用［14］。GST可直接作用于血管平滑肌，濃度依賴性地降低氯化鉀（KCl）誘導(dǎo)的血管收縮［15－16］。文獻(xiàn)報(bào)道［17］，連續(xù)給予♂糖尿病大鼠GST 31 d，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮完整的血管環(huán)，GST組對(duì)KCl、PE誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)明顯低于糖尿病組；對(duì)ACh誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)明顯高于糖尿病組。本實(shí)驗(yàn)室早期的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)GST可明顯抑制PO導(dǎo)致的血管EDR功能損傷［4］。所有這些證據(jù)均表明GST調(diào)節(jié)血管緊張度，保護(hù)血管內(nèi)皮，進(jìn)而改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能。

關(guān)于GST保護(hù)心血管系統(tǒng)的相關(guān)機(jī)制眾多。GST可降低鼠血漿中TC、LDL-C、TC／HDL-C［10，18］，減輕血管結(jié)構(gòu)與功能的損傷；同時(shí)，GST也可抑制TNF-α的下游因子NF-κB表達(dá)［19］，快速激活p38β絲裂原蛋白激酶［20］，進(jìn)而對(duì)抗TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及編程性細(xì)胞死亡。然而，GST的抗氧化作用是其保護(hù)心血管系統(tǒng)的主要作用機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，GST可升高機(jī)體SOD的活性、GSH水平，并上調(diào)GSH-Px的水平和活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化水平［8］；Vera等［21］發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期給予自發(fā)性高血壓大鼠GST，可抑制NADPH氧化酶活性，降低ROS的產(chǎn)生，改善血管內(nèi)皮功能紊亂；Xu等［9］也發(fā)現(xiàn)GST可下調(diào)大鼠p22phox亞基的表達(dá)，抑制ROS的產(chǎn)生。但GST對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞上NADPH氧化酶另一重要的亞基Nox4表達(dá)的影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)用100 μmol·L－1GST處理大鼠胸主動(dòng)脈后，觀察血管組織中p22phox、Nox4表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn)GST可下調(diào)p22phox、Nox4的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)，GST與PO共同預(yù)處理血管環(huán)后，血管環(huán)EDR功能較PO單獨(dú)處理血管環(huán)有了明顯改善［4］，GST與PO對(duì)p22phox、Nox4表達(dá)的相反的調(diào)節(jié)作用是否可以解釋這一現(xiàn)象？GST是否可通過(guò)下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上NADPH氧化酶相關(guān)亞基p22phox、Nox4的表達(dá)這一途徑來(lái)拮抗PO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷？本課題從離體組織器官水平就這些問(wèn)題展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GST可拮抗PO誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈組織p22phox表達(dá)上調(diào)。對(duì)于PO誘導(dǎo)的Nox4表達(dá)的上調(diào)，GST具有一定拮抗效應(yīng)，但該效應(yīng)并不明顯。這可能涉及p22phox、Nox4亞基對(duì)PO、GST的敏感性不同，Nox4對(duì)PO更為敏感；也可能涉及離體模型（大鼠胸主動(dòng)脈）的建模時(shí)間及建模條件等多方面的原因。

綜上所述，通過(guò)對(duì)PO與GST對(duì)血管內(nèi)皮的作用及其可能機(jī)制的初探性研究，為有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥誘發(fā)心血管疾病發(fā)生的機(jī)制及GST對(duì)此類疾病可能的防治提供理論參考及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)部分在南華大學(xué)藥物藥理研究所完成。在此衷心感謝導(dǎo)師黃紅林教授及藥物藥理研究所全體老師、同學(xué)對(duì)本實(shí)驗(yàn)工作的關(guān)心、支持和幫助?。?/p>

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Genistein antagonizes paraoxon-induced high expressions of NADPH oxidase p22phox and Nox4 in rat thoracic aorta tissues

LIU Yu-ling1，2，WANG Yu-hua1，ZHANG Xiu-qin1，LI Dong-hua1，HUANG Hong-lin1
（1．Learning Key Laboratory for Pharmacoproteomics of Hunan Province，Institute of Pharmacy and Pharmacology，University of South China，Hengyang Hunan 421001，China；2．Loudi Health School，Loudi Hunan 417000，China）

Abstract：Aim To investigate whether genistein pro-tects paraoxon-induced vascular endothelial dysfunction through down-regulating p22phox and Nox4 expressions as well as inhibiting the generation of ROS．Methods

In this study，thoracic aortas were isolated from the male Sprague-Dawley（SD）rats and were divided into the following groups：①control group，the thoracic a-ortas were incubated with dimethyl sulfoxide（DMSO，0.1%）for 30 min；②genistein group，the thoracic a- ortas were incubated with genistein（100 μmol·L－1）for 30 min；③paraoxon group，the thoracic aortas were incubated with paraoxon at the concentration of 40．5 μmol·L－1for 30 min；④paraoxon plus genistein groups，the thoracic aortas were incubated with paraoxon（40．5 μmol·L－1）plus genistein（100 μmol·L－1）for 30 min．The expressions of p22phox and Nox4 mRNA were detected by RT-PCR and the protein expressions of p22 phox and Nox4 were detected

by Western blot．Results Compared with the control group，the expressions of p22phox and Nox4 were markedly increased in the paraoxon group．In the genistein group，the expressions of p22phox and Nox4 were significantly repressed．When treated with genistein plus paraoxon，there was a marked increase in the expression of Nox4（P＜0.05），but no signifi-cant difference in the expression of p22phox．The ex-pression of p22phox in the paraoxon plus genistein group was significantly decreased（P＜0.05）as com-pared with paraoxin group，but there was no significant difference in the expression of Nox4．Conclusion Paraoxon may result in oxidative damage of vascular endothelium through up-regulating p22phox and Nox4 expressions，genistein may down-regulate the expres-sions of both and protect vascular endothelium．

Key words：genistein；paraoxon；oxidative damage；NADPH oxidase；p22phox；Nox4

作者簡(jiǎn)介：劉玉玲（1978－），女，碩士，主管藥師，講師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：18373822991＠163．com；黃紅林（1963－），女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：huanghonglinhui＠aliyun．com

基金項(xiàng)目：湖南省十二五重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項(xiàng)目資助（No 201314）

收稿日期：2015－05－02，修回日期：2015－06－10

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1292－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．022