于 曦，劉海亮，王 燕，王曉鈺，陶 羽，包凱帆，季 律，王 璨，洪 敏

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023）

小鼠變應性接觸性皮炎模型各時期IL-33水平探索

于 曦，劉海亮，王 燕，王曉鈺，陶 羽，包凱帆，季 律，王 璨，洪 敏

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023）

Expression of IL-33 in different phases of allergic contact dermatitis mouse model

YU Xi，LIU Hai-liang，WANG Yan，WANG Xiao-yu，TAO Yu，BAO Kai-fan，JI Lyu，WANG Can，HONG Min

（School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，National Standard Laboratory of Pharmacology for Chinese Mate-ria Medica，Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica，Nanjing 210023，Chi-na）

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．031．html

IL-33通過與二型固有淋巴細胞（group 2 innate lymphoid

cells，ILC2s）［1－2］上的ST2和IL-1受體輔助蛋白（IL-1RAcP）結合［3］，參與多種過敏性疾病發(fā)病機制，是引發(fā)過敏性疾病的關鍵因素［4］。上皮細胞可經刺激產生IL-33，作用于ILC2s并使其產生Th2型細胞因子，促進Th2型過敏性疾病的發(fā)生，如過敏性皮炎［5］、哮喘［6］、過敏性鼻炎［7］等。利用小鼠變應性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）模型探索其在過敏性疾病不同時期表達水平，有助于了解變態(tài)反應的發(fā)病機制，同時為準確評價藥物對IL-33的影響選擇合適時期。

1　材料與方法

1．1動物 BALB／c♂小鼠，SPF級，18～22 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，SCXK（京）2012－0001。

1．2試劑 異硫氰酸熒光素（FITC，Sigma），溶于丙酮／鄰苯二甲酸二丁酯（1∶1）中；Mouse IL-4、IL-5、IL-13、IL-33 Kit （eBioscience）；TRIzol（Invitrogen）；ReverAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit（Thermo Fisher scientific）；Quanti Fast SYBR Green PCR kit（Qiagen）；Lineage Cocktail with Isotype Ctrl-FITC抗體（BioLegend），ST2／IL33R-APC和CD25-PE抗體（eBioscience）。

1．3ACD模型的建立 小鼠于d 0腹部剔毛，d 1、d 2腹部涂抹80 μL 15 g·L－1FITC致敏，d 6右耳涂20 μL 6 g· L－1FITC激發(fā)，對照組涂等體積的溶劑。于d 3、d 5和激發(fā)后24 h（d 7）測量耳厚，計算耳腫脹度（右耳厚度－左耳厚度），對激發(fā)后24 h的耳進行病理組織學檢查。

1．4耳組織細胞因子檢測 小鼠耳片制備25 g·L－1組織勻漿，用ELISA法測定IL-4、IL-5、IL-13及IL-33，并通過樣本總蛋白定量來進行校正。

1．5IL-33 mRNA的表達 耳組織采用實時定量PCR方法檢測。利用Primer Premier 5．0軟件設計小鼠IL-33引物，以GAPDH為內參。

1．6ILC2s的檢測 收集引流淋巴結，制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×1010～2×1010cells·L－1。取100 μL細胞懸液，加入lineage cocktail antibody（20 μL／well）、0.2 μg CD25抗體和0.2 μg IL-33R／ST2抗體，避光孵育15 min，經生理鹽水洗滌2次后，重懸，過濾，上流式細胞儀檢測。

2　結果

2．1小鼠ACD模型不同時期耳部炎癥表現(xiàn) 小鼠在誘導初期［對照（5.8±9.1）μm，模型（－4.2±11.1）μm］及誘導相［對照（－1.7±6.1）μm，模型（0±5.5）μm］右耳未出現(xiàn)腫脹，經FITC激發(fā)，右耳腫脹度明顯增加［對照（11.7 ±11.7）μm，模型（176.7±39.3）μm，P＜0.01］，且病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，耳組織內有大量以淋巴細胞為主的單個核細胞和少許多形核細胞浸潤，同時IL-4［對照（60.6±18.4）ng ·g－1，模型（110.9±27.6）ng·g－1，P＜0.01］、IL-5［對照（157.2±64.4）ng·g－1，模型（269.1±36.1）ng·g－1，P＜0.01］、IL-13［對照（36.3±10.9）ng·g－1，模型（151.4± 18.1）ng·g－1，P＜0.01］水平明顯升高，提示FITC可誘導小鼠形成Th2型ACD。

2．2小鼠ACD模型各時期IL-33的表達 誘導初期小鼠耳組織內IL-33水平較對照組明顯升高［對照（457.4± 323.3）ng·g－1，模型（1554.6±359.5）ng·g－1，P＜0.01］，提示在致敏初期即已產生大量IL-33。誘導相和激發(fā)期IL-33水平［對照（554.0±104.3）ng·g－1，模型（787.9± 189.1）ng·g－1；對照（546.5±90.4）ng·g－1，模型（722.2 ±90.4）ng·g－1］雖仍較高，但較誘導初期有所降低。

2．3誘導初期耳組織中IL-33 mRNA的表達 與對照組相比（1.72±0.73），模型組小鼠IL-33 mRNA表達升高（2.96 ±1.69），該結果與IL-33在此時期表達增多相一致。

2．4誘導初期ILC2s百分含量 與對照組相比（0.32± 0.053），模型組小鼠引流淋巴結內ILC2s百分含量明顯升高（0.43±0.050，P＜0.05），提示在誘導初期IL-33表達升高，并作用于ILC2s，繼而發(fā)揮生物學效應。

3　討論

IL-33是重要的促過敏細胞因子。過敏性疾病患者及模型動物上皮組織均表達高水平的IL-33［8］，其關鍵作用是誘導或激活2型免疫反應的效應細胞ILC2。FITC可誘導形成以Th2型細胞因子占優(yōu)勢的小鼠ACD模型［9］，在該模型誘導初期，IL-33水平明顯升高，且ILC2s數量增加，表明IL-33高表達于ACD的誘導初期，并激活下游反應，促使過敏性炎癥發(fā)生。

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中國圖書分類號：R-332；R363-332；R392．12；R758.2

關鍵詞：變應性接觸性皮炎；IL-33；誘導初期；異硫氰酸熒光素；ILC2s；小鼠

Key words：allergic contact dermatitis；IL-33；the initial stage；fluorescein isothiocyanate；group 2 innate lymphoid cells；mouse

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1331－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．031

作者簡介：于 曦（1990－），女，碩士生，研究方向：免疫藥理學，E-mail：yuxi1990yaoli＠126．com；洪 敏（1972－），女，博士，教授，研究員，博士生導師，研究方向：中藥免疫藥理學，通訊作者，E-mail：hongmin72＠126．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81473395，81373549，81073121）；江蘇省自然科學基金資助項目（No BK20141466）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；江蘇省‘青藍工程’資助項目

收稿日期：2015－04－13，修回日期：2015－05－30