于景麗，希尼尼根，趙 吉

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；4.農(nóng)業(yè)部“動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，疾病的發(fā)生發(fā)展與菌群結(jié)構(gòu)變化密切相 關(guān)[1-4]。Aebi 等利用DNA 印跡雜交(Southern-blot hybridization)技術(shù)證明特定牛群支原體乳腺炎暴發(fā)和奶源介導(dǎo)的支原體群落感染有關(guān)[5]。發(fā)展不依賴于培養(yǎng)(Culture-independent)而且能夠準(zhǔn)確跟蹤疾病發(fā)生發(fā)展過程中全部菌群變化的宏基因組學(xué)(Metagenomics)鑒別技術(shù)對疾病的早期防控至關(guān)重要。宏基因組學(xué)為直接提取指定環(huán)境中微生物群落總基因組(宏基因組，Metagenome)DNA，利用宏基因組學(xué)研究策略跟蹤群落組成及豐度變化的新興學(xué)科[6-10]。

近年來，宏基因組技術(shù)的迅猛發(fā)展極大促進(jìn)了其在多種復(fù)雜環(huán)境中的廣泛滲透，包括水、氣、土等自然環(huán)境[11-13]和腸道、口腔、皮膚等高等生物體內(nèi)及體表環(huán)境[14-16]。本文就宏基因組技術(shù)在奶牛乳房炎中的應(yīng)用狀況進(jìn)行綜述。

1 常規(guī)宏基因組技術(shù)鑒別奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)菌群變化

常規(guī)宏基因組技術(shù)主要包括①基于雜交的宏基因組技術(shù)；②基于指紋圖譜及克隆測序相結(jié)合的宏基因組技術(shù)；③基于熒光定量PCR(qPCR)的宏基因組技術(shù)。qPCR 技術(shù)在奶牛乳房炎臨床診斷中應(yīng)用的實(shí)例很多[17-20]，但由于技術(shù)本身限制，qPCR 主要針對少數(shù)幾類已知病原菌群進(jìn)行檢測，不能分析微生物群落結(jié)構(gòu)。指紋圖譜技術(shù)在定性分析環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性方面發(fā)揮重要作用，但不具備定量功能。

1.1 基于DNA 雜交的宏基因組技術(shù) 宏基因組學(xué)技術(shù)的核心為不依賴于培養(yǎng)的微生物群落基因組分析技術(shù)。熒光原位雜交(Fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)[21]、DNA印跡雜交[5]和基因芯片(Genechip)[22]技術(shù)均基于已知病原菌設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，通過DNA 雜交技術(shù)檢測奶樣中病原菌群落數(shù)量的方法。Gey 等設(shè)計(jì)的FISH 寡核苷酸探針只能檢測乳房炎奶樣中高于106cfu/mL 的病原細(xì)菌群落數(shù)量[21]。因此，F(xiàn)ISH 等雜交技術(shù)雖比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法操作快捷，但存在靈敏度不高，而且不能夠鑒定新型病原菌等共性問題，在跟蹤疾病關(guān)聯(lián)菌群變化和疾病預(yù)防和診斷方面受到限制。

1.2 基于指紋圖譜和克隆測序相結(jié)合的宏基因組技術(shù)DNA 指紋圖譜技術(shù)包括末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP)[23]、變性梯度凝膠電泳(Denature gradient gel electrophoresis，DGGE)[24-26]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-strand conformation polymorphisms，SSCP)[27]等多種技術(shù)，但在奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)菌群分析中應(yīng)用較少。Kuang 等采用DGGE 和克隆測序相結(jié)合分析日本北海道地區(qū)乳房炎奶樣細(xì)菌群落組成及多樣性，證明肺炎克雷伯菌、乳酸乳球菌、金黃色葡萄球菌和埃希氏菌屬為北海道地區(qū)乳房炎奶樣最主要的細(xì)菌屬，而且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化具有宿主特異性[24]。比利時布魯塞爾地區(qū)未感染、亞臨床和臨床感染奶牛乳頭皮膚細(xì)菌群落的DGGE 分析證明棒狀桿菌屬和葡萄球菌屬為最優(yōu)勢的乳房炎致病菌[25]。由此表明，不同地區(qū)不同組織部位奶牛乳房炎病原菌群結(jié)構(gòu)組成存在差異。高潮等通過DGGE分析證實(shí)乳樣微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，奶牛乳房炎的治愈時間越長越容易復(fù)發(fā)[26]。與傳統(tǒng)培養(yǎng)分離鑒定和FISH 等核酸雜交技術(shù)相比，DGGE 技術(shù)揭示了奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)的較多微生物群落信息，涵蓋可培養(yǎng)和大多數(shù)不可培養(yǎng)菌群，可以有效區(qū)分不同組織部位和不同健康程度乳樣中菌群差異，為檢測奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)菌群變化的較有效工具。

2 高通量宏基因組技術(shù)鑒別奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)菌群變化

2.1 高通量宏基因組技術(shù)的含義及特征 高通量宏基因組技術(shù)主要包括高通量測序(High-throughput sequencing)[1]和升級版功能基因芯片(Geochip)技術(shù)[28]。高通量測序技術(shù)一次能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模樣品的平行測序，獲得幾十萬甚至幾百萬條DNA 序列信息和高達(dá)500 Mb～600 Mb 的數(shù)據(jù)量(一代測序56 kb)，比Sanger 法一代測序通量提高了成千上萬倍甚至上億倍，測序速度提高了上百倍，可分辨極低豐度菌群，為短時間內(nèi)準(zhǔn)確測定微生物群落變化成為可能。已知Geochip 包括70 000 個功能基因，超過400 個功能基因類別。Geochip 5.0 含有11 416 個探針，覆蓋26 000條序列。Geochip 在人類重特大疾病診療中發(fā)揮了重要的作用，雖未見應(yīng)用于奶牛乳房炎的研究報(bào)道，但隨致病基因的不斷開發(fā)，Geochip 有望應(yīng)用于奶牛乳房炎菌群變化研究。

高通量測序和Geochip 技術(shù)兼顧常規(guī)宏基因組技術(shù)菌群組成定性及定量分析雙重功能，可以對來自不同地點(diǎn)和不同時間的批量樣品進(jìn)行平行分析，具有操作簡單快速、效率和通量高、重復(fù)性好和精確度高等優(yōu)點(diǎn)，為目前宏基因組學(xué)的主流技術(shù)。但兩者稍有區(qū)別。Geochip 只能檢測“封閉系統(tǒng)”中功能已知的微生物群落特征[28]；而高通量測序能夠在“開放系統(tǒng)”中發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的新型微生物資源，因此應(yīng)用更為廣泛。基于測序平臺的差異，高通量測序主要包括：Roche 公司的454 pyrosequencing、Illumina公司的Solexa sequencing 和ABI 公司的Solid sequencing 等。

2.2 高通量測序技術(shù)鑒別奶牛乳房炎相關(guān)菌群變化 根據(jù)體細(xì)胞數(shù)量(SCC)將奶牛乳樣分為5 個健康等級，通過宏基因組焦磷酸測序發(fā)現(xiàn)健康與乳房炎病例奶樣均具有豐富的細(xì)菌群落組成，但群落組成存在明顯差異[1]。在已分類的60 種細(xì)菌中，金黃色葡萄球菌和糞腸球菌等10 種細(xì)菌為健康牛乳中特有菌群的客觀事實(shí)，顛覆了人們對常規(guī)致病菌的認(rèn)識[1]。健康型和臨床型乳房炎病例奶樣細(xì)菌群落組成的高通量測序表明，鞘氨醇單胞菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬為乳房炎病例奶樣中最優(yōu)勢的細(xì)菌屬，分別隸屬于變形菌門的α-和γ-變形菌綱；假單胞菌屬和勞爾氏菌屬為健康型奶牛乳樣中最優(yōu)勢的細(xì)菌屬，分別隸屬于變形菌門的γ-和β-變形菌綱[29]。亞臨床型乳房炎病例奶樣病原菌群的高通量測序共檢測到葡萄球菌屬、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬和埃希氏菌屬等23 個屬和28 個細(xì)菌種，隸屬于5 門、8 綱、15 目、19 科。其中，變形菌門和厚壁菌門為亞臨床型乳房炎病例乳樣中最豐富的細(xì)菌門[30]。奶樣細(xì)菌群落的高通量測序表明，微生物群落組成及豐度變化和奶牛的健康狀況密切相關(guān)[1,29-30]。

3 宏基因組技術(shù)在奶牛乳房炎診斷中的應(yīng)用前景分析

常規(guī)和高通量宏基因組技術(shù)共同點(diǎn)為樣品宏基因組DNA 的直接提取、目的基因的PCR、后續(xù)生物信息學(xué)分析等。不同點(diǎn)為常規(guī)宏基因組技術(shù)步驟相對復(fù)雜，需要構(gòu)建基因克隆文庫或運(yùn)行DGGE 等指紋圖譜切膠后再進(jìn)行Sanger 測序。另外，常規(guī)宏基因組學(xué)技術(shù)中構(gòu)建克隆文庫需要挑選大量陽性克隆菌株，存在工作量大和覆蓋度不高等問題。常規(guī)宏基因組技術(shù)中DGGE 受凝膠電泳條件限制，無法對罕見或稀有菌群進(jìn)行檢測，而且重復(fù)性和分辨率均不理想；qPCR 技術(shù)雖能定量但不能區(qū)分微生物的群落組成。高通量測序技術(shù)避免了常規(guī)宏基因組技術(shù)操作的復(fù)雜性和低分辨率及低通量等問題，可以直接對宏基因組進(jìn)行測序，能夠?qū)φ麄€菌群中不同豐度的組成進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析，信息量大而且能夠有效區(qū)分不同健康等級樣品的菌群組成，為檢測大量不可培養(yǎng)的菌群、發(fā)現(xiàn)罕見菌群和尋找奶牛乳房炎相關(guān)致病菌群提供了有效的技術(shù)手段。

高通量宏基因組測序技術(shù)在奶牛乳房炎相關(guān)菌群研究中雖處于起步階段，但在菌群組成多樣性和豐度識別方面有質(zhì)和量的飛躍。Oikonomou 等通過高通量測序一次性獲得多達(dá)60 個已知種和將近50 %的未分類細(xì)菌種[1]。由于通量高、信息量大、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，高通量宏基因組測序技術(shù)能夠準(zhǔn)確跟蹤奶牛乳房炎發(fā)生發(fā)展過程中菌群組成及豐度變化，并對不同健康等級乳樣中稀有菌群和菌群間微細(xì)變化進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，證明特征性致病菌群組成與奶牛乳房炎發(fā)病間存在關(guān)聯(lián)性[1,29-30]。因此，該技術(shù)將是未來鑒別奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)菌群的主流技術(shù)。國內(nèi)深圳華大基因和上海美籍等公司宏基因組高通量測序及生物信息學(xué)已商業(yè)化。隨著測序精確度的逐步提高和測序分析成本的不斷降低，高通量測序日漸普及已走進(jìn)國內(nèi)各大高校和研究院所。宏基因組高通量測序技術(shù)有望大步邁向獸醫(yī)微生物領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)奶牛乳房炎等畜病的準(zhǔn)確跟蹤、診斷和預(yù)防。

4 奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)菌群研究中存在的問題與展望

4.1 存在的問題 以非疾病為主要研究目的的牛體微生物宏基因組學(xué)幾乎都圍繞瘤胃或胃腸道等部位進(jìn)行研究，其他組織部位微生物的宏基因組學(xué)少有涉及。以奶牛乳房炎為研究目的的牛體微生物宏基因組學(xué)都圍繞病灶進(jìn)行研究，樣品多為牛乳，偶見乳頭管、乳頭皮膚。因奶牛乳房炎病原微生物大多為細(xì)菌，所以病原微生物宏基因組學(xué)主要為細(xì)菌宏基因組學(xué)、少有真菌或病毒宏基因組學(xué)。國內(nèi)外奶牛乳房炎相關(guān)菌群的宏基因組學(xué)鑒別技術(shù)應(yīng)用水平參差不齊，國內(nèi)偶見乳房炎牛體微生物宏基因組學(xué)DGGE指紋圖譜技術(shù)，國外已陸續(xù)使用高通量宏基因組學(xué)測序技術(shù)。雖然發(fā)達(dá)國家已開始啟用高通量宏基因組技術(shù)進(jìn)行測序分析，但后續(xù)生物信息學(xué)分析明顯滯后。影響奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)菌群結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)資料極度缺乏，導(dǎo)致高通量技術(shù)獲取的大量菌群信息不能真正服務(wù)于奶牛乳房炎的早期預(yù)防和精確診治。

國內(nèi)乳房炎關(guān)聯(lián)微生物的研究基本定勢在各類病原體的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，相對缺乏菌群失調(diào)和發(fā)病關(guān)系的認(rèn)識。目前，乳房炎微生物的研究思路多為“終端診斷的指標(biāo)體系”，即通過病牛乳汁發(fā)現(xiàn)致病菌、找相應(yīng)的藥物，尚未擺脫“病后看病”的不良局面，缺少“病前預(yù)防”的“微生物預(yù)警指標(biāo)體系”。乳房炎的發(fā)生與多種病原微生物有關(guān)，但乳房菌群間互生、共生、競爭、捕食、寄生關(guān)系對乳房炎發(fā)生的影響尚缺乏報(bào)道；尤其對臨床型乳房炎病例病原菌的來源尚無明確的定論，這樣我們無法采取有效的預(yù)防措施。

4.2 奶牛乳房炎宏基因組學(xué)研究展望 從理論上講，患病動物病原菌有兩種來源：外源性感染和內(nèi)源性感染。部分內(nèi)源性感染與寄生于腸道中的微生物有著直接的關(guān)系。研究證明腸道微生物具有體內(nèi)移位或基因水平轉(zhuǎn)移特性，理論上胃腸道菌群失調(diào)和乳房炎發(fā)病之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但國際上缺乏胃腸道菌群失調(diào)和乳房炎發(fā)病關(guān)系的研究證據(jù)。在國際刊物Nature 中大量刊載了人體腸道菌群變化和人體健康關(guān)系的報(bào)道，證明腸道菌群結(jié)構(gòu)受飲食結(jié)構(gòu)、生物鐘等因素影響。為此，在乳汁離體前就能預(yù)測到致病菌有進(jìn)入乳汁的傾向，并且通過宏基因組文庫篩選出易感性的致病基因，可以通過基因干預(yù)或阻斷方法達(dá)到疾病早期防控之目的。

本著“敏感預(yù)警”和“預(yù)防為主”的原則，權(quán)衡人力物力和經(jīng)費(fèi)狀況，倡導(dǎo)敏感部位多時段微生物群落的跟蹤式研究以篩選易感性生物標(biāo)志。反芻動物胃腸道為微生物最活躍代謝活性物質(zhì)最為集中的部位。牛腸道微生物群落不僅關(guān)系到牛體健康和生產(chǎn)力，還與食品安全和環(huán)境健康密切相關(guān)[31]，可能為機(jī)體健康狀況的敏感部位。建議借鑒人類腸道菌群宏基因組學(xué)在人類疾病研究的成功經(jīng)驗(yàn)，從群落全基因組水平研究奶牛腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與乳房炎發(fā)生發(fā)展關(guān)系，探索奶牛乳房炎發(fā)生的微生物群落致病機(jī)制，篩選新型致病菌或抗病基因等易感性生物標(biāo)志。初期研究以掌握微生物宏基因組學(xué)方法和策略為主，用宏觀生態(tài)學(xué)理念逐步開展多區(qū)域多時段的微生物群落的時空異質(zhì)性研究。后期研究則針對牛體不同部位進(jìn)行不同時間段的跟蹤研究，以期在奶牛乳房炎微生物群落致病機(jī)制探究、生物標(biāo)志挖掘、新型致病或抗病基因等方面有所突破，篩選重要的易感性生物標(biāo)志，為今后制定健康牛標(biāo)準(zhǔn)提供微生物指標(biāo)體系，最終達(dá)到奶牛乳房炎提早預(yù)防、精確診斷、對癥治療的目的。

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