劉圓月

(益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 益陽 413000)

siRNA干擾沉默HIF-1α基因在舌癌Tca8113細(xì)胞侵襲和遷移中的作用機制

劉圓月

(益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 益陽 413000)

目的 探討利用siRNA技術(shù)特異性阻斷缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α基因表達(dá)對舌癌Tca8113細(xì)胞侵襲和遷移的影響。方法 取指數(shù)生長期細(xì)胞消化計數(shù)后按2×105個/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合至40%～50%時，將針對HIF-1α的siRNA序列應(yīng)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入Tca8113細(xì)胞(siRNA HIF-1α組，干擾組)。半定量RT-PCR及Western印跡法檢測HIF-1α的mRNA及蛋白，四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞侵襲實驗和劃痕實驗檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果 siRNA可以有效沉默Tca8113細(xì)胞HIF-1α基因；干擾組細(xì)胞增殖較對照組明顯受到抑制，且與細(xì)胞凋亡有關(guān)，凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)；，siRNA HIF-1α基因轉(zhuǎn)染后的Tca8113細(xì)胞黏附能力降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；侵襲能力也下降。結(jié)論 siRNA能夠有效沉默HIF-1α基因，抑制舌癌Tca8113細(xì)胞侵襲和遷移，在某種程度上可以改善舌癌細(xì)胞的惡性表型，為舌癌的治療提供思路。

siRNA干擾；HIF-1α基因；Tca8113細(xì)胞；舌癌；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

舌癌惡性程度較高，發(fā)病早期易發(fā)生隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為20%～50%，患者生存率較低，治療效果不理想〔1〕。因此，有關(guān)舌癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機制研究成為熱點〔2〕。乏氧普遍存在于人類腫瘤中，對乏氧的適應(yīng)是腫瘤形成和發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵步驟。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是腫瘤缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，HIF-1α在舌癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用研究甚少，且其調(diào)控機制尚不清楚〔3〕。本文利用siRNA技術(shù)特異性阻斷HIF-1α基因表達(dá)，探討沉默HIF-1α基因?qū)ι喟㏕ca8113細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細(xì)胞系：人舌癌細(xì)胞Tca8113購自美國模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞庫。②主要試劑：細(xì)胞培養(yǎng)試劑，HyClone公司的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%滅活胎牛血清，用時添加，4℃保存，胰蛋白酶；化學(xué)試劑及試劑盒，二甲基亞砜(Sigma)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自上海生工生物工程公司，黏附試驗試劑盒和侵襲試驗試劑盒購自美國Chemicon公司；siRNA轉(zhuǎn)染材料：針對HIF-1α基因的siRNA和錯配mRNA均購自Ambion公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，總RNA提取材料(異丙醇，75%乙醇，雙蒸水，氯仿，DEPC)，PCR材料，電泳材料，轉(zhuǎn)移與印跡材料。

1.2 實驗方法

1.2.1 舌癌細(xì)胞Tca8113的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前日，取對數(shù)生長期Tca8113細(xì)胞，消化計數(shù)后按2×105個/孔接種于6孔板中，37℃，5%CO2孵箱中孵育過夜(轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合率大約40%～50%)；將配置好的脂質(zhì)體-siRNA混懸液加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的6孔板中，輕輕前后混勻，置孵箱內(nèi)孵育，轉(zhuǎn)染后換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞HIF-1α mRNA及蛋白檢測 采用半定量RT-PCR和Western印跡法檢測干擾組和對照組細(xì)胞HIF-1α mRNA及蛋白。兩組舌癌細(xì)胞在低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)液(加入化學(xué)缺氧劑CoCl2)中培養(yǎng)，或進行常氧培養(yǎng)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化計數(shù)后，按6×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞融合40%～50%后將針對HIF-1α的siRNA轉(zhuǎn)染入舌癌細(xì)胞Tca8113，并在乏氧或常氧下培養(yǎng)24 h，每孔加入1 mg/ml的MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸出，加入二甲基亞砜(DMSO)液置于微孔板振蕩器振蕩15 min，然后用酶標(biāo)儀檢測各孔OD值，減去完全培養(yǎng)基加MTT無細(xì)胞的本底OD值，各平行孔的OD值取平均值，重復(fù)測量幾次；將培養(yǎng)好的兩組Tca8113細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕吹打成單細(xì)胞液，最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 舌癌細(xì)胞Tca8113遷移能力和侵襲能力的檢測 應(yīng)用CytomatrixTM細(xì)胞黏附試劑盒和細(xì)胞侵襲分析試劑盒檢測siRNA HIF-1α對干擾組Tca8113細(xì)胞的黏附和侵襲能力的作用。將細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次繼續(xù)乏氧培養(yǎng)1 h后，按試劑盒操作，PBS輕洗去未黏附細(xì)胞，使用570 nm波長測定OD值，以常氧對照組為100%。按細(xì)胞侵襲試劑盒說明操作后200倍光鏡下隨機選取5個視野，計算侵襲到濾膜背面的穿膜細(xì)胞數(shù)，評價細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果以常氧對照組的穿膜數(shù)為100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA對Tca8113細(xì)胞HIF-1α基因的影響 siRNA轉(zhuǎn)染后的Tca8113細(xì)胞(干擾組)HIF-1α mRNA的表達(dá)顯著下降，且蛋白質(zhì)含量也顯著下調(diào)。說明siRNA可以有效沉默Tca8113細(xì)胞HIF-1α基因。

2.2 siRNA HIF-1α基因?qū)ca8113細(xì)胞增殖和凋亡的影響 干擾組的Tca8113細(xì)胞乏氧培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀檢測各孔的光密度值(檢測波長570 nm,OD 570)，然后減去完全培養(yǎng)基加MTT無細(xì)胞的本底OD值，各平行孔的OD值取平均值，重復(fù)測量幾次；用同樣的方法測量無siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞(對照組)。發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞增殖與對照組比較〔OD值(0.218±0.012)vs(0.410±0.028)〕明顯受到抑制(P<0.05)。為了驗證干擾RNA介導(dǎo)下的HIF-1α沉默所致的增殖抑制是否同細(xì)胞凋亡有關(guān)，將干擾組和對照組細(xì)胞再乏氧條件下培養(yǎng)24 h，使用AnnexinV-PI雙染后流式細(xì)胞儀測出細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，干擾組凋亡率〔(17.98±1.32)%〕顯著高于對照組〔(6.65±0.58)%〕(P<0.05)。

2.3 siRNA HIF-1α基因?qū)ca8113細(xì)胞黏附和侵襲能力的影響 將常氧對照組細(xì)胞的平均OD值和侵襲到濾膜背面的穿膜數(shù)計為100%，分別表示細(xì)胞黏附能力和侵襲能力。發(fā)現(xiàn)常氧條件下培養(yǎng)24 h后siRNA HIF-1α基因轉(zhuǎn)染后的Tca8113細(xì)胞黏附能力降低〔(70.4±8.0)%〕，且與對照組〔(100.0±10.2)%〕比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；侵襲能力〔(65.0±5.3)%〕也顯著下降，對照組為(100.0±9.7)%。

3 討 論

RNA干擾(RNAi)是近年來發(fā)展起來的生物技術(shù)，作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象〔4〕。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)(長度超過30的dsRNA會引起干擾素毒性)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。并且，低氧是所有實體腫瘤的特征，HIF-1α是介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)最關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子。

研究發(fā)現(xiàn)，針對性的siRNA確實可以有效沉默Tca8113細(xì)胞HIF-1α基因的表達(dá)，且siRNA介導(dǎo)的HIF-1α沉默引起Tca8113細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞凋亡。進一步探討HIF-1α基因與Tca8113細(xì)胞增殖的關(guān)系，MTT法〔5〕檢測發(fā)現(xiàn)，干擾組在乏氧的條件下培養(yǎng)細(xì)胞增殖明顯受到抑制。有研究表明〔6〕，雖然HIF-1α通過一定方式如調(diào)節(jié)自身代謝和促進血管的生成，在一定程度下可以緩解腫瘤細(xì)胞對乏氧的耐受，但腫瘤細(xì)胞還是會趨向于對自己有利的部位，以獲取養(yǎng)料和氧，滿足自身的增殖需要。本研究證實了siRNA介導(dǎo)的HIF-1α沉默引起的增殖抑制與細(xì)胞凋亡有關(guān)。其他研究同樣也發(fā)現(xiàn)〔7,8〕HIF-1α促凋亡的機制與其調(diào)控促凋亡的分子表達(dá)有關(guān)，在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HePG2中，乏氧誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)能減少叔丁基過氧化氫引發(fā)的細(xì)胞凋亡，HIF-1α還通過功能性的抑制myc表達(dá),解除對p21的抑制，從而抑制細(xì)胞凋亡。沉默HIF-1α基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)表型，抑制上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，從而抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。而腫瘤細(xì)胞進行EMT是腫瘤實現(xiàn)侵襲的必要條件。

綜上所述，siRNA能夠有效沉默HIF-1α基因，抑制舌癌Tca8113細(xì)胞侵襲和遷移，具有明顯降低舌癌細(xì)胞惡性表型的作用。因此，抑制HIF-1α基因的表達(dá)可能為抗舌癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供一個新的靶位。

1 黃俊輝,李奉華,張 凱,等.HPV感染與口腔癌——口腔癌診療思路的變革〔J〕.口腔醫(yī)學(xué)研究,2012;28(6):609-11.

2 何海波,王 喆,孔 銳.RKIP在舌癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)及意義〔J〕.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013;29(9):535-7.

3 徐香蘭,韓 冰,燕 杰,等.靶向抑制HIF-1α基因?qū)ι喟┘?xì)胞增殖活性的影響〔J〕.天津醫(yī)藥,2013；41(9);894-7.

4 農(nóng)曉琳,李 昊,夏 勇,等.短發(fā)夾RNA干擾血管內(nèi)皮生長因子對舌癌耐藥細(xì)胞移植瘤的影響〔J〕.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011;46(1):15-9.

5 於 飛,薛 澄,唐 丹,等.SiRNA沉默Notch2表達(dá)對Lewis肺癌細(xì)胞增殖和周期的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2013;13(18):3424-7.

6 景紹武,王雅棣,鄭明民,等.HIF-1α對食管癌Eca109細(xì)胞體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012;28(1);67-71.

7 郭曉東,楊永平,孫 婷,等.HIF-1 α、HSP90α在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2010;10(24);4679-82.

8 張聚良,姚 青,陳江浩,等.CD147 siRNA對乳腺癌細(xì)胞HIF-1α、MMP-2與VEGF表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013;21(2);247-9.

〔2014-09-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

劉圓月(1966-)，女，副教授，主要從事口腔癌方面的研究。

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1005-9202(2015)12-3211-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.011