中醫(yī)藥調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子保護(hù)腦缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展

任非非劉敬霞1

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川750004)

關(guān)鍵詞〔〕腦缺血再灌注；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)；中醫(yī)藥

中圖分類號〔〕R743〔

基金項目：國家自然科學(xué)

通訊作者：劉敬霞(1970-)，女，博士，教授，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

1寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院

第一作者：任非非(1987-)，男，在讀碩士，主要從事中醫(yī)藥防治腦病研究。

缺血性腦血管病(ICVD)是目前威脅人類健康的主要疾病之一，約占全部腦血管病的59.2%～85%〔1〕。缺血性腦損傷包括缺血期原發(fā)性損傷和再灌注期繼發(fā)性損傷。腦缺血再灌注損傷(CIRI)可發(fā)生于多種腦血管疾病中，其病理生理過程是多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑損傷的酶促級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜〔2〕。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是一種作用廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、生長、成熟及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。有研究〔3〕顯示，CIRI本身可誘導(dǎo)缺血周邊區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GDNF，參與內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)過程，而GDNF也可促進(jìn)CIRI后腦組織內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)CIRI后GDNF的表達(dá)發(fā)揮抗CIRI、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。

1GDNF來源及其作用

GDNF是1993年由Lin等〔4〕最先從培養(yǎng)的大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系B49的無血清培養(yǎng)基中經(jīng)濃縮、分離純化出來的一種能激活鼠胚腹側(cè)中腦多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子〔5〕，與neurturin、persephin、ARTNemin共同組成膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族。因其一級結(jié)構(gòu)中均含有7個保守的、位置相同的半胱氨酸殘基并具有相同結(jié)構(gòu)，與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)結(jié)構(gòu)相似，也被認(rèn)為是TGF-β超家族的一個亞族〔5〕。成熟的GDNF是一種小分子二聚體蛋白質(zhì)，分子單體由134個氨基酸殘基組成，分子量為15 kD，有兩個N-糖基化位點(diǎn)，有7個保守的半胱氨酸殘基，參與二聚體間二硫鍵的形成。GDNF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過與由GDNF家族受體α(GFRα)和RET蛋白組合成的受體復(fù)合物結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)受體酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)通路〔6〕，發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)元生長及再生修復(fù)的作用。

GDNF具有多種生物學(xué)活性，不僅能高特異性地促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的存活，減少其凋亡，增加對多巴胺的攝取，而且對外周自主神經(jīng)系統(tǒng)，特別是運(yùn)動神經(jīng)元作用廣泛〔7〕。夏思文等〔8〕認(rèn)為GDNF可以促進(jìn)運(yùn)動神經(jīng)元生長，且以100 ng/ml較為適宜，當(dāng)濃度再高，隨著神經(jīng)元表面受體的飽和，誘向作用減弱。也有研究〔9,10〕顯示，GDNF在促進(jìn)胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)元的存活、軸突的生長、控制神經(jīng)元的分化及調(diào)節(jié)突觸傳遞中發(fā)揮重要作用。此外，GDNF可減少神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元變性壞死，也是對該類疾病進(jìn)行基因治療的候選神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。

2GDNF對CIRI的影響及其機(jī)制

2.1CIRI后神經(jīng)細(xì)胞變化及GDNF對其影響CIRI引起的神經(jīng)損傷包括缺血中心區(qū)的神經(jīng)元壞死和周圍缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元程序性凋亡兩種形式，且凋亡是腦缺血后神經(jīng)元死亡的重要形式。這些細(xì)胞的損害導(dǎo)致興奮性氨基酸釋放、Ca2+內(nèi)流、自由基產(chǎn)生、蛋白激酶C(PKC)降低等一系列連鎖反應(yīng)〔11〕，特別是缺血后不配對電子的持續(xù)反應(yīng)而導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生〔12〕，被認(rèn)為是導(dǎo)致腦功能障礙的主要原因。目前研究〔13〕已證實，當(dāng)CIRI發(fā)生后，在腦組織缺血壞死區(qū)域與正常區(qū)域之間存在著缺血半暗帶區(qū)，該區(qū)域腦組織處于低灌注狀態(tài)，細(xì)胞完整性、代謝和功能仍然存在，如能及時恢復(fù)血供或進(jìn)行藥物干預(yù)，組織功能或能恢復(fù)，損傷程度減輕。因此，對CIRI后腦組織缺血半暗帶區(qū)進(jìn)行及時有效的神經(jīng)保護(hù)是目前研究熱點(diǎn)。

腦內(nèi)GDNF的表達(dá)對于CIRI后腦內(nèi)缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的存活、分化及再生修復(fù)至關(guān)重要。有研究〔14〕顯示，GDNF能夠通過細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴激酶5介導(dǎo)趨化神經(jīng)干細(xì)胞從室管膜下區(qū)向嗅球遷移，分化成特定區(qū)域的神經(jīng)元表型，發(fā)揮生理作用，這就為CRIR后GNDF促進(jìn)受損部位神經(jīng)元再生修復(fù)提供可能。胡躍強(qiáng)等〔15〕研究提示CIRI后缺血半暗帶區(qū)GDNF表達(dá)代償性增高，參與保護(hù)CIRI損傷。

另外，有研究〔16〕顯示，GDNF是腦缺血性損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生的影響因素之一，能激活神經(jīng)干細(xì)胞再生機(jī)制，促進(jìn)其再生。龐源廣等〔17〕認(rèn)為GDNF能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)揮改善CIRI的作用。

以上研究均說明，腦缺血后機(jī)體可通過促進(jìn)內(nèi)源性GDNF的表達(dá)，提高神經(jīng)元抵抗缺血性損傷的能力，促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生，是機(jī)體的一種自我保護(hù)性機(jī)制。但腦缺血后單純腦組織自身GDNF的代償性增高不足以抵抗損傷性因子的作用〔10〕，而外源性GDNF又由于腦內(nèi)血腦屏障(BBB)存在導(dǎo)致彌散到腦組織內(nèi)的含量甚少，不能充分發(fā)揮腦保護(hù)作用。因此，如何提高機(jī)體內(nèi)源性GDNF的表達(dá)對于促進(jìn)CIRI后神經(jīng)功能的恢復(fù)至關(guān)重要。

2.2GDNF保護(hù)CIRI的基礎(chǔ)及可能機(jī)制

2.2.1GDNF保護(hù)CIRI的基礎(chǔ)研究表明，GDNF對神經(jīng)元的保護(hù)及損傷修復(fù)是通過其受體復(fù)合物介導(dǎo)激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)分子而發(fā)揮作用的。GDNF的受體復(fù)合物由GFRα和RET蛋白組成〔6〕。GFRα是通過糖基-磷脂酰肌醇(GPI)結(jié)合位點(diǎn)直接錨定于細(xì)胞膜的外側(cè)，其信號不能通過細(xì)胞膜。在目前已知的GFRα4種亞型(GFRα1-4)中，GFRα1是GDNF的主要受體。RET蛋白是原癌基因c-Ret編碼產(chǎn)物，其胞外有4個鈣黏附素樣結(jié)構(gòu)(CLD1-4)和1個半胱氨酸富集區(qū)(CRD)，胞內(nèi)有酪氨酸激酶區(qū)，胞內(nèi)和胞外通過跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域(TM)相連接，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化〔18〕。GDNF先與GFRα1結(jié)合形成GDNF/GFRα1復(fù)合二聚體，但因GFRα1錨定于胞外，無跨膜結(jié)構(gòu)，不能傳導(dǎo)信號，故GDNF/GFRα1復(fù)合二聚體會促進(jìn)GFRα1與RET蛋白結(jié)合形成GDNF/GFRα1/RET復(fù)合物，激活RET蛋白磷酸化，進(jìn)而激活受體酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。也有研究〔19〕顯示，GDNF可以不依賴RET，而與神經(jīng)細(xì)胞間黏附分子(NCAM)、整合素β1結(jié)合發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。由以上可知，GDNF發(fā)揮作用的基礎(chǔ)是與GDNF/GFRα1/RET、NCAM、整合素β1受體等結(jié)合，產(chǎn)生相應(yīng)效應(yīng)分子發(fā)揮作用。

2.2.2GNDF保護(hù)CIRI的可能機(jī)制研究〔20〕表明，CIRI的機(jī)制包括Ca2+超載、自由基增多、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡等，各個因素相互聯(lián)系，相互影響。而GDNF保護(hù)CIRI的途徑就是通過部分干預(yù)以上導(dǎo)致CIRI發(fā)生的機(jī)制過程進(jìn)行的。①GDNF抑制細(xì)胞凋亡：半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)家族作為特異性的死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。Yu等〔21〕研究顯示，GDNF可抑制腦缺血損傷后Caspase-1、3的表達(dá)發(fā)揮抑制神經(jīng)元凋亡的作用。陳貴軍等〔22〕研究提示GDNF可促進(jìn)NSCs增殖分化并抑制介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的Caspase-3的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。②GDNF抑制Ca2+超載：當(dāng)發(fā)生腦缺血損傷時，組織內(nèi)谷氨酸濃度增高，N-乙酰谷氨酸(NMDA)受體被持續(xù)激活，激活Ca2+通道，細(xì)胞內(nèi)Ca2+大量內(nèi)流，造成Ca2+超載，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡。Gomes等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)，GDNF可抑制N-甲基-O天冬氨酸(NMDA)受體活性，抑制Ca2+超載。③GDNF抑制環(huán)氧酶(COX)：COX廣泛參與機(jī)體損傷后的炎癥反應(yīng)過程，在CIRI后腦內(nèi)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮作用。周鐵柱等〔24〕研究提示GDNF能通過降低COX-2表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)作用。④GDNF抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生：星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、生長及突觸傳遞等過程中發(fā)揮重要作用。其在CIRI發(fā)生后反應(yīng)性增生可減少神經(jīng)元壞死和凋亡，但與此同時，膠質(zhì)細(xì)胞過度增生會引起膠質(zhì)化，形成膠質(zhì)瘢痕影響神經(jīng)元修復(fù)。而GDNF可抑制細(xì)胞周期蛋白，組織細(xì)胞過度增生。

3中醫(yī)藥調(diào)控GDNF對CIRI的保護(hù)作用

CIRI屬于中醫(yī)“中風(fēng)”病范疇，為本虛標(biāo)實，上盛下虛之證。中醫(yī)藥以其整體調(diào)節(jié)和綜合治療優(yōu)勢，在調(diào)節(jié)內(nèi)源性GDNF對CIRI的治療中作用顯著，已成為改善CIRI及其機(jī)制研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。中藥提取物、中藥復(fù)方、針刺等研究日漸增多。

3.1單味中藥及其有效成分對GDNF的調(diào)控作用

3.1.1葛根葛根素(Pue)是從中藥葛根中提取的有效成分之一，韓江全等〔25〕提示葛根素(Pue)可以通過提高GDNF表達(dá)改善腦缺血損傷，同時也提示改善CIRI后半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞功能對于腦缺血神經(jīng)功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。

3.1.2人參人參皂苷(Rb)是從中藥人參中提取出來的主要生物活性成分，其中以Rb1含量最高。徐鵬等〔26〕提示Rb1可通過提高CIRI后缺血周邊區(qū)GDNF表達(dá)改善神經(jīng)功能損傷。也有研究〔27〕顯示，Rb1能調(diào)節(jié)GDNF mRNA表達(dá)對缺血腦組織起保護(hù)作用。

3.1.3胡黃連胡黃連甲醇是從中藥胡黃連中提取的有效成分。位蘭玲等〔28〕研究顯示，胡黃連甲醇能調(diào)節(jié)CIRI后GDNF mRNA表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3.1.4丹參丹參多酚酸是丹參水溶性成分中重要的有機(jī)酸類化合物，王強(qiáng)等〔29〕發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸能顯著降低大鼠行為學(xué)評分，減小腦梗死體積，能顯著提高腦內(nèi)GDNF蛋白含量，且以高劑量(30mg/kg)時最明顯，因此推測這可能是中藥丹參發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。

以上資料表明，中藥葛根、人參、胡黃連、丹參幾味藥均可通過上調(diào)CIRI后GDNG表達(dá)，發(fā)揮改善腦損傷作用，這也可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制之一，為臨床治療缺血性腦損傷藥物的選擇提供基礎(chǔ)。

3.2中藥復(fù)方對GDNF的調(diào)控作用

3.2.1腦絡(luò)欣通中藥復(fù)方腦絡(luò)欣通是治療腦缺血的經(jīng)驗方，具有益氣活血功效。胡建鵬等〔30〕提示腦絡(luò)欣通可通過增強(qiáng)GDNF表達(dá)改善CIRI，且作用優(yōu)于單獨(dú)益氣和單獨(dú)活血。

3.2.2清熱化瘀方清熱化瘀方由水牛角、丹參、川芎、地龍、石菖蒲等10味中藥組成，具有清熱祛風(fēng)化痰、活血化瘀通絡(luò)的功效。胡躍強(qiáng)等〔31〕研究提示清熱化瘀方能顯著上調(diào)GDNF mRNA及其蛋白表達(dá)，保護(hù)受損神經(jīng)元。

3.2.3醒腦解毒湯醒腦解毒湯是遼寧省血栓病中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療中心經(jīng)驗方，由冰片、大黃、水蛭、石菖蒲、黃連、梔子、澤瀉組成，有開竅醒腦，解毒通絡(luò)功效。于莉等〔32〕研究發(fā)現(xiàn)醒腦解毒湯能有效上調(diào)各個時間點(diǎn)GDNFmRNA表達(dá)，提示其能通過增加GDNF表達(dá)改善腦部損傷。

3.2.4腦脈通腦脈通由中藥大黃、人參、川芎、葛根組成，具有益氣活血、解毒降濁功效。研究〔33〕顯示腦脈通可使MCAO大鼠腦組織GDNF表達(dá)增強(qiáng)，并能顯著促進(jìn)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向神經(jīng)元分化及表達(dá)GDNF，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

以上研究顯示，以益氣、活血、化痰、開竅等治則為基礎(chǔ)組成的中藥復(fù)方能顯著上調(diào)GDNF蛋白的表達(dá)，改善缺血性腦損傷，這也切中腦卒中病后正虛邪盛、痰阻竅閉的病機(jī)，不僅證實了中藥復(fù)方的作用，更為臨床治療疾病提供思路。

3.3針刺及電針對GDNF的調(diào)控作用

3.3.1普通針刺劉丹等〔34〕研究提示針刺可通過促進(jìn)CIRI后GDNF表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且應(yīng)盡早介入。

3.3.2電針電針是在針刺腧穴“得氣”后，于針上通以接近人體生物電的微量電流波，以持續(xù)刺激穴位，達(dá)到防治疾病的一種療法。沈峰等〔35〕認(rèn)為電針可通過提高CIRI后腦內(nèi)GDNF表達(dá)參與腦保護(hù)過程，但未進(jìn)行各時間點(diǎn)之間的比較，對電針治療的時間窗未研究。徐濤等〔36〕研究說明CIRI能引起腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子自發(fā)性保護(hù)性增高，但作用時間較短；而電針能促進(jìn)GDNF表達(dá)。

針刺治療作為中醫(yī)治療手段之一，在ICVD治療中有獨(dú)特作用。以上資料顯示，針刺可通過上調(diào)腦損傷后GDNF表達(dá)，改善缺血性腦損傷后神經(jīng)功能，對損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)起重要作用。

4思考與展望

GDNF作為近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的、高效能并廣泛存在的神經(jīng)營養(yǎng)因子，探索其在缺血性腦損傷中的作用及藥物干預(yù)機(jī)制已成為在缺血性腦損傷治療方面取得突破的重要途徑。雖然GDNF在改善CIRI方面發(fā)揮重要作用，但還是存在一些問題：①CIRI自身可誘導(dǎo)內(nèi)源性GDNF表達(dá)代償性增高，但含量較少，作用時間短暫，自我修復(fù)能力有限；②外源性GDNF為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，不能通過消化道直接給藥，給藥方式受限；③GDNF作為大分子親水物質(zhì)，很難透過血腦屏障(BBB)，即使髓鞘內(nèi)給藥，其向腦損傷部位的彌散量也有限；④GDNF發(fā)揮作用依賴于與其受體特異性結(jié)合，而GDNF受體含量有限，不能滿足CIRI后腦組織修復(fù)所需，存在受體不足限制。

中醫(yī)藥可通過多層次、多靶點(diǎn)來調(diào)節(jié)內(nèi)源性GDNF表達(dá)，防治腦缺血再灌注損傷，但也有不足之處：①中醫(yī)藥對GDNF的調(diào)控研究大多停留實驗室研究方面，如何安全有效的用于臨床還需進(jìn)一步探索；②目前大多研究只單純性地說明中醫(yī)藥對GDNF有調(diào)控作用，但針對其影響機(jī)制研究及中醫(yī)理論認(rèn)識研究較少，研究形式單一；③雖然中藥有效成分、復(fù)方、針刺等調(diào)控GDNF的研究均有開展，但研究中藥種類較少；中藥復(fù)方多是自擬方，而對于成方研究開展較少；針刺治療目前大多為電針療法，針?biāo)幗Y(jié)合等多途徑研究有待開展。④雖然實驗室研究顯示中醫(yī)藥可通過調(diào)控GDNF改善腦缺血損傷，但具體的干預(yù)時間窗不統(tǒng)一，對于中醫(yī)藥在CIRI后特定階段及時有效干預(yù)研究還需深入。因此GDNF作為CIRI后神經(jīng)干細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)，對其機(jī)制及中醫(yī)藥干預(yù)研究將成為今后努力的方向。

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〔2014-02-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)