劉德海，馬 煥，解復(fù)紅，權(quán)淑靜，賈 彬，王紅云，陳國參

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450008）

一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶煙曲霉菌株的鑒定及其產(chǎn)酶特性

劉德海1，馬 煥2，解復(fù)紅2，權(quán)淑靜2，賈 彬2，王紅云1，陳國參1

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450008）

從釀造大曲中分離篩選出一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌菌株L1，根據(jù)對該菌株形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)18S rDNA分析，將其鑒定為煙曲霉(Aspergillus fumigates)，并對其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，熱穩(wěn)定性較好，在50℃保溫120 min仍能保持79.6%酶活性；最適反應(yīng)pH值為4.0，在pH值3.0～5.0酶活性穩(wěn)定。

煙曲霉；β-葡萄糖苷酶；分離鑒定；酶學(xué)性質(zhì)

β-葡萄糖苷酶是纖維素酶的成分之一，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶，它能夠作用于纖維二糖或纖維寡糖，使其水解為葡萄糖分子[1]。木質(zhì)纖維素原料是自然界最豐富的可再生資源，也是主要的農(nóng)業(yè)廢棄物，β-葡萄糖苷酶在木質(zhì)纖維素降解中起到關(guān)鍵作用，但其含量少、活力低，成為木質(zhì)纖維素降解的瓶頸[2]。煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是一種自然界普遍存在的通過空氣傳播的的腐生真菌，能夠引起食品腐敗，但是煙曲霉能夠分泌產(chǎn)生多種有用的酶類，能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、植酸酶[3]、殼聚糖酶[4]、纖維素酶[5]、淀粉酶[6]等，在酶工程領(lǐng)域有諸多應(yīng)用，煙曲霉功能基因較多，煙曲霉包括一些編碼酶類的基因、幾丁質(zhì)合成酶的基因、植酸酶合成基因等，梁東春等[7]根據(jù)GenBank中發(fā)布的煙曲霉菌殼聚糖酶（EC3.2.1.132）基因序列人工合成8條DNA長鏈及4條引物鏈，并成功在大腸桿菌中表達(dá)，所得重組殼聚糖酶具有降解殼聚糖的生物活性，王穎等[8]從煙曲霉中克隆114 kb的cDNA片段，編碼一個氨基酸蛋白，序列分析表明該蛋白與其它真菌來源的幾丁質(zhì)酶同源；王嚴(yán)等[9]以自行篩選的煙曲霉WY-1為出發(fā)菌株，通過PCR方法克隆其植酸酶基因，并構(gòu)建了含有植物信號肽序列的植酸酶基因植物表達(dá)載體。

本研究從釀造酒曲中分離篩選出一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株L1，通過生物形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)18S rDNA分析，鑒定該菌株為曲霉屬（Aspergillus）煙曲霉（Aspergillus fumigatus），并對其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為構(gòu)建β-葡萄糖苷酶工程菌株及高效表達(dá)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

釀造磚曲：河南省王勿橋醋業(yè)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基[10]

菌種保藏培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL；

菌種篩選分離培養(yǎng)基：（NH4）2SO44.0 g，NaCl 2.0 g，CaCO34.0 g，KH2PO41.0 g，纖維二糖5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，加入適量鏈霉素；

菌種篩選透明圈培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）2.0 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O0.5 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，鏈霉素適量；

液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：麩皮2 g，（NH4）2SO40.4 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，CaCl20.05 g，蒸餾水100 mL。

1.1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：寶生物工程大連有限公司；瓊脂糖：法國Biowest公司；MarkerⅢ：上海萊楓生物科技有限公司；對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）：天津科密歐公司；4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylβ-D-glu copyranoside，p-NPG）、羧甲基纖維素鈉：美國Sigma公司；纖維二糖：美國Amresco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHSJ-3F酸度計：瑞士Mettle Toledo公司；YP2102電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司、T-Gradient Thermoblock PCR擴(kuò)增儀：德國Biometra公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 篩選方法[11-12]

無菌操作條件下，取釀造磚曲1.0 g，置于盛有99 mL無菌蒸餾水三角瓶中，100 r/min往復(fù)振蕩15 min，制成10-2菌液，將10-2菌液稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度菌液，按常規(guī)方法涂布分離培養(yǎng)，分別接入菌種篩選分離培養(yǎng)基平板上，挑取長出的單菌落，轉(zhuǎn)接入PDA培養(yǎng)基試管斜面，觀察得到的單菌落形態(tài)及外觀，選擇疑似煙曲霉菌株，接入菌種篩選透明圈培養(yǎng)基平板上，采用透明圈法對菌株進(jìn)行第二次篩選，觀察有無透明圈及透明圈大小，挑取能夠在纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板上生長，且在菌種篩選透明圈培養(yǎng)基平板上有明顯透明圈的的菌種，轉(zhuǎn)接入PDA培養(yǎng)基試管斜面進(jìn)行保藏。

1.3.2 液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)

液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，250 mL三角瓶，液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基100 mL，每三角瓶接種試管斜面菌種2～3環(huán)，培養(yǎng)條件為30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min的搖瓶培養(yǎng)3 d后，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶酶活力檢測分析。

1.3.3 粗酶液的提取

發(fā)酵液經(jīng)四層紗布過濾，10000r/min離心分離10min，上清液即為粗酶液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 酶活力的測定

采用對硝基苯酚法測定酶活[13]：取0.1 mL的待測酶液加入到5 mmol/L p-NPG溶液0.2 mL和pH值為5.0的醋酸緩沖液0.7 mL，于45℃恒溫反應(yīng)30 min后，立即加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2.0 mL終止反應(yīng)，再加入9.0 mL蒸餾水，于波長400 nm處測定吸光度值。

β-葡萄糖苷酶酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，以1min內(nèi)催化生成1 μmol p-NP所需的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

相對酶活測定：檢測粗酶液的酶活力，以測得的酶活性最大值作為100%，其他的酶活為實(shí)際酶活除以最大酶活的百分?jǐn)?shù)。其計算公式如下：

1.3.5 菌種的鑒定

菌種的形態(tài)生物學(xué)鑒定根據(jù)文獻(xiàn)[14]，分子生物學(xué)鑒定根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法對分離的菌種進(jìn)行鑒定。

真菌DNA的提取按照試劑盒說明書進(jìn)行得到基因。

采用真菌18SrDNA基因測序通用引物，上游引物ITS1：5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′和下游引物ITS4：5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：dd H2O 37.0 μL；10×Buffer 5.0μL；dNTP2μL；上游引物2μL；下游引物2μL；TaqDNA聚合酶0.6 μL；真菌模板基因組DNA 1 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)復(fù)性4 min，94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖（Biowest）凝膠檢測后送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果序列，登陸NCBI上提交Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性序列比對分析。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

最適反應(yīng)溫度：將底物p-NPG溶液分別在不同水浴溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保溫5 min，再加入經(jīng)適當(dāng)稀釋0.1 mL的待測酶液，在不同溫度下與底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，在pH值為5.0的醋酸緩沖液條件下按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，確定β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度。

最適作用pH：配制不同pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0醋酸緩沖液，將適當(dāng)稀釋的酶液與底物p-NPG在相同溫度45℃，不同pH緩沖液下酶促反應(yīng)，按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以pH值為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，確定β-葡萄糖苷酶最適作用pH。

熱穩(wěn)定性：將適當(dāng)稀釋的粗酶液分別在50℃水浴條件下保溫0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min，立即冰浴冷卻后取樣，按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以溫度為橫坐標(biāo)，保溫處理后酶液殘余相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，考察溫度對酶活力的影響。

pH穩(wěn)定性：分別用不同pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0醋酸緩沖液配制酶液，在45℃保溫30 min，按照β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法測定其酶活力，以不加酶的溶液作為對照。以pH值為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，考察pH值對酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌種的篩選

涂布平板法分離純化：以纖維二糖為唯一碳源，按常規(guī)方法采用菌種篩選分離培養(yǎng)基平板涂布分離培養(yǎng)，通過對釀造大曲中分離β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的純化培養(yǎng)，共分離得到15株菌株，根據(jù)文獻(xiàn)[14]魏景超《真菌鑒定手冊》觀察得到的單菌落形態(tài)及外觀，選擇出疑似煙曲霉菌株3株，分別接入篩選透明圈培養(yǎng)基平板上進(jìn)行二次篩選和液體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，其結(jié)果見表1。由表1可知，L1菌株透明圈直徑與菌落直徑之比（H/C值）較大，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶達(dá)到0.65U/mL，所測酶活力較高。故選擇L1菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 菌株L1的形態(tài)特征

菌株L1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，其菌落特征見圖1。

由圖1可知，菌落中心稍凸起，初形成白色、圓形，絨毛狀菌落，菌落反面淺黃綠色，顯微觀察可見，菌絲有隔膜，分生孢子梗光滑不分支，呈深淺不同的綠色，分生孢子穗圓筒形帶綠色，分生孢子串生于小梗上，分生孢子球形或近球形，粗糙，綠色，頂囊膨大，分布在有隔扳的縱橫交錯的氣生菌絲上。根據(jù)以上特征，對照魏景超《真菌鑒定手冊》及相關(guān)文獻(xiàn)報道，初步將L1菌株鑒定為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi imperfecti），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉屬（Aspergillus），煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

2.2.2 菌株L1的分子生物學(xué)鑒定

以提取的L1菌株DNA作為模板，采用引物ITS1：5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTAT TGAT ATGC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，根據(jù)與上海萊楓生物科技有限公司MarkerⅢ對照，得到了一個近600 bp大小的DNA片段。經(jīng)測序后，得到完整的18S rDNA的基因序列，其測序序列片段長度為573 bp，具體序列見圖3，將測序結(jié)果基因序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中與已有的相關(guān)同源序列BLAST比對分析，結(jié)果表明，L1菌株18S rDNA基因序列與GenBank中已有的煙曲霉菌（Aspergillusfumigatus）相似性在99%，親緣關(guān)系最近，其相似性、同源性分析見表2，并在18S rDNA基因序列同源性基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，表明菌株L1為曲霉屬（Aspergillus），煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

2.3 菌株L1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 最適反應(yīng)溫度

將菌株L1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在不同溫度下（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）與底物反應(yīng)，考察溫度對酶活的影響，結(jié)果如圖5。由圖5可知，菌株L1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的最適溫度為50℃。

2.3.2 最適反應(yīng)pH值

將菌株L1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在相同溫度45℃，不同pH值條件下（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）與底物反應(yīng)，考察pH值對酶活的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，β-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的最適pH值為4.0。

2.3.3 酶的熱穩(wěn)定性

將菌株L1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在最適反應(yīng)溫度（50℃）條件下，保溫不同時間0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min之后，考察酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7。由圖7可知，50℃條件下，β-葡萄糖苷酶在保溫120 min時酶活性為79.6%，說明該酶有較好的熱穩(wěn)定性。

2.3.4 pH穩(wěn)定性

將菌株L1產(chǎn)β-葡萄糖苷酶適當(dāng)稀釋的酶液分別在pH值1.0～7.0條件下保溫處理30 min之后，考察酶的pH穩(wěn)定性，結(jié)果如圖8。從圖8可以看出，β-葡萄糖苷酶的酶活性在pH值3.0～5.0之間穩(wěn)定。

3 結(jié)論

馬旭光等[16]對航天誘變菌株黑曲霉菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性進(jìn)行了研究：該酶最適溫度為55℃，55℃保溫2 h酶活力保持95%以上；最適反應(yīng)pH值為5.5，pH在3.0～6.0時酶活力穩(wěn)定性良好。覃擁靈等[17]對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生真菌芽枝霉菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，該酶在pH 4.0～9.0范圍內(nèi)，60℃以下酶活力穩(wěn)定。鄭芳等[18]分離篩選出一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌，其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)pH值和溫度分別為7.0和40℃。

本研究從釀造用酒曲中分離篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，經(jīng)過菌種篩選分離培養(yǎng)基、菌種篩選透明圈培養(yǎng)基篩選出一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株L1，對L1其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定，將其鑒定為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi imperfecti），叢梗孢目（Moniliales），叢梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉屬（Aspergillus），煙曲霉（Aspergillus fumigatus），并對菌株L1發(fā)酵所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，其最適反應(yīng)溫度為50℃，熱穩(wěn)定性較好，50℃保溫120 min仍能保持79.6%酶活性；最適反應(yīng)pH值為4.0，在pH值3.0～5.0之間酶活性穩(wěn)定。

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Identification of β-glucosidase producingAspergillus fumigatusand its enzyme production characteristics

LIU Dehai1,MA Huan2,XIE Fuhong2,QUAN Shujing2,JIA Bin2,WANG Hongyun1,CHEN Guocan1
(1.Henan Academy of Science Institute of Biology,Limited Liability Company,Zhengzhou 450008,China; 2.Henan Engineering Research Center of Industrial enzymes,Zhengzhou 450008,China)

A β-glucosidase producing strain L1 was screened from Daqu.By physical characterization and 18S rDNA molecular identification,the strain L1 was identified asAspergillus fumigatus.The enzymatic characteristics of β-glucosidase were studied as well,and the results showed that the optimum reaction temperature and pH were 50℃and 4.0.After incubation at 50℃for 120 min,it remained 79.6%of its activity.The enzyme was stable in the range of pH 3.0-5.0.

Aspergillus fumigatus;β-glucosidase;isolation and identification;enzyme activity

TQ920.1

A

0254-5071（2015）06-0118-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.026

2015-06-03

河南省中國科學(xué)院成果轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化中心項(xiàng)目（2014308）；河南省工程技術(shù)研究中心專項(xiàng)資金項(xiàng)目（132102213112）

劉德海（1970-），男，研究員，本科，主要從事酶工程研究工作。