金超楠，劉 莉，史吉平，孫慶元

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210）

離子束誘變與連續(xù)馴化選育耐毒性產(chǎn)丁醇菌株

金超楠1，2，劉 莉2，史吉平2，孫慶元1*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210）

利用離子束注入的方法對(duì)丁醇發(fā)酵菌株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052進(jìn)行誘變，篩選得到了突變株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CN18，相對(duì)于出發(fā)菌株，該突變株的丁醇產(chǎn)量從9.9 g/L增加至12.8 g/L，提高了29.3%；總?cè)軇┊a(chǎn)量從13.4 g/L增加至18.2 g/L，提高了35.8%。該突變菌株連續(xù)傳代20次，溶劑產(chǎn)量穩(wěn)定，菌株無明顯退化。使用含木質(zhì)素降解產(chǎn)物的培養(yǎng)基對(duì)該菌株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)馴化，最終獲得一株耐木質(zhì)素降解產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株，命名為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CN88，其耐受木質(zhì)素降解產(chǎn)物的質(zhì)量濃度提高至1.0 g/L。在0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L的抑制物質(zhì)量濃度下發(fā)酵，可分別產(chǎn)總?cè)軇?5.2 g/L、14.4 g/L、12.7 g/L。

拜氏梭菌；離子束誘變；連續(xù)培養(yǎng)；抑制物；遺傳穩(wěn)定性

石油等能源危機(jī)促使人們尋求新型能源來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化石燃料。生物質(zhì)能源是最具潛力的可替代能源之一，其中，丁醇作為第二代生物質(zhì)能源，展現(xiàn)了更多應(yīng)用上的優(yōu)勢，在許多國家中已經(jīng)進(jìn)行了代替燃料用油的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃[1-3]。利用生物質(zhì)原料生產(chǎn)丁醇一般要經(jīng)過三步，即預(yù)處理、酶解、發(fā)酵[4]。由于菌種無法耐受木質(zhì)纖維素降解單體的抑制作用，導(dǎo)致菌體生長受到嚴(yán)重抑制，最終導(dǎo)致溶劑產(chǎn)量很低，成為了廣泛推廣應(yīng)用的瓶頸[5-6]，因此尋找和選育的高產(chǎn)耐毒菌株是必要的[7]。

目前對(duì)于菌種改造主要有兩種方法：（1）基因工程菌的構(gòu)建[8]，（2）傳統(tǒng)的誘變方法[9-10]。低能量的離子束注入誘變技術(shù)在1991年第一次應(yīng)用于大米育種[11]。這種誘變方法有很多優(yōu)勢，如低損傷率、高誘變率、更廣泛的光譜范圍等[12]?？衫么朔N誘變方法提高出發(fā)菌株對(duì)于木質(zhì)素單體抑制物的耐受性，同時(shí)保證菌種高產(chǎn)。另外，可以通過菌種馴化方法來進(jìn)一步提升其耐丁醇和木質(zhì)素單體的毒性以及丁醇的生產(chǎn)能力[13-14]。

該實(shí)驗(yàn)利用離子束注入方法誘變出發(fā)菌株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052，并結(jié)合連續(xù)培養(yǎng)的馴化方式，對(duì)菌種進(jìn)行進(jìn)一步改造，從而獲得耐木質(zhì)素降解產(chǎn)物的高產(chǎn)丁醇突變株，為開發(fā)直接利用生物質(zhì)酶解液而不經(jīng)過脫毒步驟的發(fā)酵方法奠定了基礎(chǔ)，相關(guān)的研究結(jié)果也對(duì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)所使用的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052，購于美國菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基

TYA種子培養(yǎng)基：葡萄糖40.0 g，酵母粉2.0 g，蛋白胨6.0 g，牛肉粉2.0 g，NH4AC 3.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，K2HPO40.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH值，115℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50.0 g，其他同TYA種子培養(yǎng)基。

選擇培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基中加入等量的各種混合抑制物（對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、丁香醛、香草酸、香草醛、香豆酸以及阿魏酸），配制成含不同總質(zhì)量濃度抑制物的一系列選擇培養(yǎng)基（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L）。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡糖糖、酵母粉、蛋白胨、瓊脂、正丁醇、NH4AC、MgSO4·7H2O、K2HPO4、FeSO4·7H2O、牛肉粉、木糖、甘油等化學(xué)試劑均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、乙醇、丙酮、甲酸、乙酸均為色譜純：美國Sigma試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離子束誘變臺(tái)：濟(jì)南杰康設(shè)備凈化廠；LC-20A高效液相色譜儀、GC-2010plus高效氣相色譜儀：日本SHIMADZU公司；MDF-U53V-80℃超低溫冰箱：日本三洋公司；AW400SG厭氧培養(yǎng)箱：英國依萊泰科公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

從-80℃冰箱取出種子，置于冰上融化后轉(zhuǎn)接到含10 mL種子培養(yǎng)基的試管中，在沸水中熱激1.0 min，迅速放入冷水中使之冷卻，37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，然后按10%的接種量轉(zhuǎn)入含有40 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 低能N+離子束注入誘變

將培養(yǎng)24 h的二級(jí)種子離心去上清液，加入等量的生理鹽水洗滌，再次離心去上清液后用等量的培養(yǎng)基懸浮菌體，放入含有玻璃珠的100 mL三角瓶中打勻，使菌落的個(gè)數(shù)大約在108個(gè)/mL，取5 mL菌液放入玻璃培養(yǎng)皿中，再用過膜的無菌空氣將其干燥，制造出干膜細(xì)胞。接下來放到誘變儀器的托盤上，分別用10 keV能量的范圍為0、2×1014N+/cm2、4×1014N+/cm2、6×1014N+/cm2、8×1014N+/cm2、10×1014N+/cm2的離子束劑量對(duì)菌體進(jìn)行誘變，整個(gè)過程的操作均在真空環(huán)境下進(jìn)行（10-3Pa），時(shí)長55 s，脈沖5 s。然后將菌液稀釋不同的梯度進(jìn)行涂布，進(jìn)行平板培養(yǎng)，避光放置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率（存活率=1-致死率），確定最佳的離子束誘變劑量[15]。

1.3.3 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將篩選得到的菌株在液體TYA培養(yǎng)基中連續(xù)傳代20次，37℃靜置培養(yǎng)48 h，氣相色譜（gas chromatography，GC）法測定溶劑產(chǎn)量，每代做2個(gè)平行。

1.3.4 連續(xù)培養(yǎng)馴化

將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期的菌液按照1∶10的比例接種到連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)（500 mL，密閉），此時(shí)的選擇培養(yǎng)基含抑制物質(zhì)量濃度為0.6 g/L。24 h后開始進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，補(bǔ)料速度為10 mL/h。每隔24 h取樣，通過測量發(fā)酵液的OD600nm值和pH值來指示菌體在培養(yǎng)基中的生長和代謝情況。連續(xù)馴化過程中，每隔5 d提升一次進(jìn)料培養(yǎng)基的抑制物質(zhì)量濃度（每次提升0.2 g/L），直至菌體無法耐受導(dǎo)致死亡，以此來達(dá)到馴化菌體耐毒性的目的。

1.3.5 發(fā)酵液溶劑及有機(jī)酸的測定方法

氣相色譜儀Shimadzu 2010 Plus測定丁醇、丙酮、乙醇及乙酸、丁酸的含量。色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Inert Cap Pure Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：50℃保持3.8 min，以20℃/min升至220℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度200℃，火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度230℃；載氣N2流速1.0 mL/min，H2流速40.0 mL/min；空氣流速400.0 mL/min；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比50∶1。采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能N+離子束注入誘變

分別用10 keV能量的范圍為0、2×1014N+/cm2、4×1014N+/cm2、6×1014N+/cm2、8×1014N+/cm2、10×1014N+/cm2的離子束劑量對(duì)菌體進(jìn)行誘變，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，不同誘變劑量下菌體的存活率（存活率= 1-致死率）在6×1014N+/cm2時(shí)恰好形成一個(gè)“馬鞍型”曲線，一般認(rèn)為80%的菌體致死率是誘變的最佳結(jié)果，因此馬鞍處的20%存活率劑量即為最適的誘變劑量。此時(shí)的誘變可以達(dá)到最高效率，既使得菌體死亡數(shù)多，又使得存活下來的菌體數(shù)量足夠且生命力強(qiáng)。因此選擇6×1014N+/cm2的離子束劑量參數(shù)下對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行多輪誘變。

2.2 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)最佳劑量多輪誘變處理后的菌液，經(jīng)過24 h的中間避光富集培養(yǎng)，按1%的接種量轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將菌液涂布于固體TYA培養(yǎng)基上，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。挑選較大的菌落轉(zhuǎn)接到TYA液體種子培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)搖瓶發(fā)酵，以48 h為發(fā)酵終點(diǎn)，取樣進(jìn)行氣相色譜測定。篩選丁醇產(chǎn)量高的菌株，獲得產(chǎn)量最高的突變株，命名為拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18。

對(duì)突變菌株拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18進(jìn)行20代連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，每代搖瓶發(fā)酵48 h，用氣相色譜儀測定溶劑產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，傳代20次以內(nèi)，菌株C.beijerinckiiCN18的發(fā)酵特性基本沒有退化，丁醇、乙醇、丙酮的產(chǎn)量基本平穩(wěn)，說明此突變菌株遺傳特性非常穩(wěn)定，比較適合工業(yè)化應(yīng)用。

2.3 拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18發(fā)酵結(jié)果

對(duì)比突變株C.beijerinckiiCN18與出發(fā)菌株C.beijerinckiiNCIMB8052在不同抑制物質(zhì)量濃度條件下，發(fā)酵48 h后產(chǎn)丁醇、乙醇、丙酮、丁酸等溶劑的能力，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，無論是溶劑產(chǎn)量或是耐毒性，突變株都比出發(fā)菌株優(yōu)異得多。在沒有抑制物存在的發(fā)酵培養(yǎng)基中，C.beijerinckiiCN18可以利用底物發(fā)酵產(chǎn)出18.2 g/L總?cè)軇?，其中包?2.8 g/L丁醇、0.6 g/L乙醇、4.8 g/L丙酮；而C.beijerinckiiNCIMB 8052只能產(chǎn)出13.4 g/L總?cè)軇?，其中包括丁?.9 g/L，乙醇0.4 g/L，丙酮3.1 g/L。突變株的總?cè)軇┊a(chǎn)量提高了35.8%，丁醇產(chǎn)量提高了29.3%。另外，突變株的耐毒性也有顯著提高，在抑制物質(zhì)量濃度＞0.6 g/L之后，出發(fā)菌株的溶劑產(chǎn)量急劇下降，抑制物質(zhì)量濃度＞0.8 g/L之后總?cè)軇┊a(chǎn)量≤3 g/L；而突變株在抑制物質(zhì)量濃度為1.0g/L時(shí)仍然可以產(chǎn)出近12g/L的總?cè)軇?，可見其耐毒性有顯著提高。因此C.beijerinckiiCN18可作為進(jìn)一步耐毒性研究和利用生物質(zhì)原料水解液的極具潛力的菌株。

2.4 連續(xù)培養(yǎng)馴化選育出C.beijerinckiiCN88

利用連續(xù)培養(yǎng)的方法對(duì)菌種進(jìn)行耐毒性馴化，最終使得突變菌株對(duì)木質(zhì)素單體抑制物的耐受性有進(jìn)一步的提高，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在連續(xù)培養(yǎng)過程中，初始抑制物質(zhì)量濃度為0.6 g/L，5 d為一個(gè)周期，第6天抑制物質(zhì)量濃度提高至0.8 g/L，第11天抑制物質(zhì)量濃度提高至1.0 g/L，第16天抑制物質(zhì)量濃度提高至1.2 g/L。每次菌體進(jìn)入到更高一級(jí)抑制物濃度時(shí)，OD600nm值都會(huì)開始下降，同時(shí)pH值升高，隨著時(shí)間的推移，OD600nm值會(huì)慢慢回升，pH值會(huì)下降，直至一個(gè)平衡的狀態(tài)。這是由于菌體生長代謝分為兩個(gè)階段：產(chǎn)酸期及產(chǎn)溶劑期。在剛剛接入菌體時(shí)，由于抑制物質(zhì)量濃度過高，不利于菌體生長，所以細(xì)胞濃度有所下降。經(jīng)過一段時(shí)間，菌體適應(yīng)了新環(huán)境，開始大量增殖，代謝進(jìn)入了產(chǎn)酸期，因此pH值會(huì)下降，同時(shí)細(xì)胞濃度開始慢慢回升，直至一個(gè)穩(wěn)定平衡的階段。之后在進(jìn)入新抑制物質(zhì)量濃度環(huán)境時(shí)，此過程又重復(fù)一次，已經(jīng)適應(yīng)了上一質(zhì)量濃度的細(xì)胞生長再次收到抑制，然后在適應(yīng)新環(huán)境，細(xì)胞濃度回升至平穩(wěn)，pH值先下降后上升。直至達(dá)到1.2 g/L抑制物質(zhì)量濃度時(shí)，細(xì)胞濃度下降后再也沒能回升，菌液渾濁度不再增加，pH值持續(xù)升高，即判斷該濃度為此次馴化的終點(diǎn)濃度，1.2 g/L的抑制物質(zhì)量濃度是C.beijerinckiiCN18耐受的最大限度。將馴化后的菌種保存好，重新命名為拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN88。

2.5 C.beijerinckiiCN88在有抑制物存在的培養(yǎng)基中發(fā)酵

由圖5可知，各培養(yǎng)基中抑制物質(zhì)量濃度分別為0.6g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L時(shí)，C.beijerinckiiCN88可以分別通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)出總?cè)軇?5.2 g/L、14.4 g/L、12.7 g/L、5.2 g/L?？梢姡?jīng)過誘變和馴化C.beijerinckiiCN88的抑制物耐受程度有了顯著提高，并且同時(shí)保證溶劑的產(chǎn)量不會(huì)大幅降低。該菌株可以耐受1.0 g/L的木質(zhì)素降解產(chǎn)物。實(shí)際應(yīng)用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵時(shí)，抑制物種類更多，但C.beijerinckiiCN88已對(duì)其中抑制效果最明顯的幾種有了耐受性，可以進(jìn)一步嘗試該菌株以木質(zhì)纖維素水解液為底物進(jìn)行直接發(fā)酵。

3 結(jié)論

通過對(duì)出發(fā)菌株C.beijerinckiiNCIMB 8052進(jìn)行離子束誘變處理，篩選得到了突變株C.beijerinckiiCN18，該菌株相對(duì)于出發(fā)菌株丁醇產(chǎn)量從9.9 g/L增加至12.8 g/L，提高了29.3%；總?cè)軇?3.4g/L增加至18.2g/L，提高了35.8%。經(jīng)過20次連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)，該突變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)馴化，得到的C.beijerinckiiCN88可以耐受1.0 g/L的木質(zhì)素降解產(chǎn)物，在抑制物質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)，馴化后的菌株可產(chǎn)出12.7 g/L總?cè)軇?，比出發(fā)菌株產(chǎn)出的1.9 g/L總?cè)軇┨岣吡?.7倍；比C.beijerinckiiCN18產(chǎn)出的11.6 g/L總?cè)軇┨岣吡?.5%。這為今后直接利用生物質(zhì)水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇奠定了基礎(chǔ)。

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Screening of inhibitor-tolerant and butanol producing strain by ion beam implantation and continuous culturing domestication

JIN Chaonan1,2,LIU Li2,SHI Jiping2,SUN Qingyuan1*
(1.School of Bioengineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

The mutation method of ion beam implantation was employed toClostridium beijerinckiiNCIMB 8052 in this study.As a result,a mutant strainC.beijerinckiiCN18 was screened.Comparing to the original strain,the buranol production increased from 9.9 g/L to 12.8 g/L,which improved 29.3%.Meanwhile,the total solvent production was 18.2 g/L,which was 35.8%higher than the original data of 13.4 g/L.Additionally,C.beijerinckiiCN18 could maintain stable solvent production during 20 times serial passages,which showed excellent genetic stability.In the following,a mutant strainC.beijerinckiiCN88 with high resistance of lignin-degraded products was obtained after continuous culturing domestication,which could grow well even under 1.0 g/L inhibitor.Under the inhibitor concentrations of 0.6 g/L,0.8 g/L and 1.0 g/L,it could produce 15.2 g/L,14.4 g/L and 12.7 g/L total solvents,respectively.

Clostridium beijerinckii;ion beam implantation;continuous culturing domestication;inhibitor;genetic stability

Q939.99

A

0254-5071（2015）06-0025-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.006

2015-05-17

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（21306219）；中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（2015232）；中國科學(xué)院上海高等研究院交叉學(xué)科青年創(chuàng)新基金（141002）

金超楠（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：孫慶元（1957-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锝到廪r(nóng)藥殘留以及食（醫(yī)）用真菌的開發(fā)。