李作美，李 娜，王曉云，于澤權(quán)

（蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

桶裝純凈水的微生物檢測與鑒定

李作美，李 娜，王曉云，于澤權(quán)

（蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

選用成品桶裝純凈水為研究對象，成品分別在下線6 h、12 h、24 h、48 h、96 h后進行菌落總數(shù)檢測，并對其微生物類別進行鑒定，目的是對桶裝純凈水中的微生物有針對性地進行預(yù)防和控制。結(jié)果表明，成品下線6 h后，檢測樣品時幾乎沒有微生物的存在，然而隨著時間的延長，菌落總數(shù)明顯的增多。分別對不同的菌落進行分離、純化并進行鑒別，結(jié)果顯示有細菌（主要是大腸桿菌）和真菌。

桶裝純凈水；微生物；菌落總數(shù)；大腸桿菌

快節(jié)奏的現(xiàn)代生活使得桶裝純凈水走進千家萬戶，其已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪幸环N方便快捷的飲用水資源。但由于質(zhì)量參差不齊，純凈水是否真的“純凈”，存在著質(zhì)疑[1]。

目前我國的桶裝純凈水市場抽檢合格率低，主要表現(xiàn)在純凈水中微生物數(shù)量超標(biāo)，這在一定程度上給消費者的健康帶來危害[2]。由于桶裝純凈水在生產(chǎn)、運輸和飲用過程中稍有不慎就容易引起污染，其衛(wèi)生安全值得人們?nèi)リP(guān)注。本實驗以某公司生產(chǎn)的桶裝純凈水為研究對象，對水樣中的微生物進行檢測和分離鑒定，旨在為今后桶裝純凈水的生產(chǎn)、運輸及飲用中制定更加安全的防控措施。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某公司生產(chǎn)的桶裝純凈水。

蛋白胨和酵母浸膏（生化純），氯化鈉、葡萄糖、乳糖、磷酸二氫鉀、瓊脂、乙醇、碘、草酸銨、碘化鉀等（分析純）：南京博岸生物科技有限公司；溴甲酚紫、伊紅、結(jié)晶紫、美藍、沙黃等：南京匯鑫化學(xué)試劑有限公司。

細菌培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、葡萄糖蛋白胨瓊脂水培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭（eosinmethylene blue，EMB）培養(yǎng)基[3-7]。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9012恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YM-50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；B203LED光學(xué)顯微鏡：重慶奧特關(guān)學(xué)儀器有限公司；CX-204凈化工作臺：久禾凈化技術(shù)有限公司；FA1604電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水樣的稀釋[8]

在裝有225 mL蒸餾水的滅菌三角瓶內(nèi)注入25 mL樣品，混合均勻，得到10-1的樣品溶液。在裝有9 mL蒸餾水的滅菌試管中加入1 mL稀釋10倍的樣品溶液，混合均勻，得到10-2的樣品溶液，同樣方法制成10-3的樣品溶液。

分別吸取10-1、10-2、10-3樣品1 mL于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋梯度做2個平皿。吸取1mL無菌水加入無菌平皿作空白對照。

1.3.2 菌落總數(shù)的測定[9-10]

在適合計數(shù)范圍內(nèi)若唯有一個稀釋度平板菌落數(shù)，則計算兩平板菌落數(shù)平均值，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，獲得每毫升樣本中菌落總數(shù)；在適合計數(shù)范圍內(nèi)有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)，其計算公式：

式中：N為樣品中菌落數(shù)，CFU/mL；∑C為平板菌落數(shù)之和；n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

若是每一個稀釋度平板菌落數(shù)都超過300CFU，就計數(shù)稀釋度最高的平板，其余平板記“多不可計”，以平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)作結(jié)果。若是每一個稀釋度平板菌落數(shù)都低于30，就計算稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)獲得結(jié)果。若是每一個稀釋度（包含樣本原液）平板都沒有菌落生長，就以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)記錄。若是每一個稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300范圍內(nèi)，就計算最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

1.3.3 大腸菌群的測定

乳糖膽鹽發(fā)酵試驗[11]：在乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)接種待測樣品，每一個稀釋度接種三管，37℃培育24h，若乳糖膽鹽發(fā)酵管均沒有產(chǎn)氣現(xiàn)象就記錄大腸菌群陰性；若產(chǎn)氣，即試管中倒置的德漢氏小管中有氣泡產(chǎn)生，則繼續(xù)試驗。

伊紅美藍瓊脂平板分離[11]：在EMB培養(yǎng)基平板上分別接種產(chǎn)氣產(chǎn)酸的培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)18～24h。篩選吻合如下特點：深紫黑色有金屬光澤、紫黑色不帶或略帶金屬光澤、淡紫紅色中央顏色較深的菌落，涂片。

革蘭氏染色[12]：制片，用結(jié)晶紫染色液染色1min后用蒸餾水清洗。涂片烘干用革蘭氏碘液作用1min用蒸餾水清洗。涂片烘干用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇脫色約30s，蒸餾水洗。涂片烘干用復(fù)染色液染色1min水洗烘干。顯微鏡觀測，染色結(jié)果呈紫色的是革蘭氏陽性菌，呈紅色的是革蘭氏陰性菌。

復(fù)發(fā)酵實驗[11]：樣本為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另外一部分，接種到乳糖發(fā)酵管，每管能夠接種來自同一初發(fā)酵管同類型菌落1～3個，37℃培養(yǎng)24h。乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，可記錄為大腸菌群陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌菌落總數(shù)的測定[13]

2.1.1 成品下線6h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線6h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每一個濃度稀釋梯度做2個平行實驗，即表1中用序號1和2所表示。采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制成平板，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見表1。由表1可知，培養(yǎng)基內(nèi)無菌落生長，各梯度平均菌落數(shù)為0，平均菌落總數(shù)＜1×10-3CFU/mL。

2.1.2 成品下線12h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線12h后，對純凈水進行取樣稀釋并培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見表2。由表2可知，培養(yǎng)基中存在較少菌落，10-1樣品的平均菌落數(shù)為40～50CFU/mL，其他稀釋度平均菌落數(shù)為0，樣品中平均菌落總數(shù)為45CFU/mL。

2.1.3 成品下線24h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線24h后，從同一批次的純凈水中取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，采用細菌培養(yǎng)基制成平板，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見表3。由表3可知，培養(yǎng)基中菌落數(shù)量明顯增加，10-1樣品平均菌落數(shù)33CFU/mL，10-2樣本平均菌落數(shù)13CFU/mL，10-3樣本平均菌落數(shù)6CFU/mL，樣品平均菌落總數(shù)335CFU/mL。

2.1.4 成品下線48 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線48 h后，從同一批次的純凈水中取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，結(jié)果見表4。由表4可知，經(jīng)過培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基上菌落較多，10-1樣本平均菌落數(shù)222 CFU/mL，10-2樣本平均菌落數(shù)89 CFU/mL，10-3樣本平均菌落數(shù)24 CFU/mL，樣品平均菌落總數(shù)225 CFU/mL。

2.1.5 成品下線96 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線96 h后，取樣稀釋并培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，結(jié)果見表5。由表5可知，培養(yǎng)基長滿了菌落，10-1樣本菌落數(shù)多不可計，10-2樣本平均菌落數(shù)220 CFU/mL，10-3樣本平均菌落數(shù)33 CFU/mL，樣品平均菌落總數(shù)2.5×104CFU/mL。

2.2 真菌菌落總數(shù)的測定

2.2.1 成品下線6 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線6 h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，分別配制酵母菌培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基來培養(yǎng)酵母和霉菌，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)皿內(nèi)無酵母菌及霉菌的生長，樣品霉菌平均菌落總數(shù)＜1×10-3CFU/mL，酵母平均菌落總數(shù)＜1×10-3CFU/mL，結(jié)果見表6。

2.2.2 成品下線12 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線12 h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，經(jīng)過培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)皿中有少量霉菌及酵母存在，10-1樣本霉菌平均數(shù)為3 CFU/mL，酵母菌平均數(shù)為5 CFU/mL，其他稀釋度無菌落生長。樣品霉菌平均菌落總數(shù)30 CFU/mL，酵母平均菌落總數(shù)45 CFU/mL，結(jié)果見表7。

2.2.3 成品下線24 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線24 h后，對純凈水進行取樣并稀釋成3個濃度梯度，從表8可以看出，霉菌及酵母菌數(shù)量明顯增加，10-1樣本霉菌平均菌落數(shù)56 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)27 CFU/mL。10-2樣本霉菌菌落數(shù)11 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)6 CFU/mL。10-3樣本霉菌菌落數(shù)5 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)3 CFU/mL。樣本霉菌平均菌落總數(shù)560 CFU/mL，酵母平均菌落總數(shù)270 CFU/mL。

2.2.4 成品下線48 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線48 h后取樣培養(yǎng)，霉菌及酵母菌數(shù)量增加較多，10-1樣本霉菌平均菌落數(shù)107 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)135 CFU/mL。10-2樣本霉菌菌落數(shù)59 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)39 CFU/mL。10-3樣本霉菌菌落數(shù)27 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)15 CFU/mL。樣本霉菌平均菌落總數(shù)1×103CFU/mL，酵母菌平均菌落總數(shù)1.3×102CFU/mL，結(jié)果見表9。

2.2.5 成品下線96 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線96 h后，取樣并稀釋成3個濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個濃度做2個平行試驗，經(jīng)過培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。10-1樣本霉菌、酵母菌平均菌落數(shù)多不可計，10-2樣本霉菌平均菌落數(shù)163 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)166 CFU/mL，10-3樣本霉菌平均菌落數(shù)46 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)79 CFU/mL。樣品霉菌平均菌落總數(shù)4.4×104CFU/mL，酵母菌平均菌落總數(shù)7.9×104CFU/mL，結(jié)果見表10。

2.3 大腸菌群測定

2.3.1 乳糖膽鹽發(fā)酵試驗

成品下線96 h后取樣，置乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察乳糖膽鹽發(fā)酵10-1-1、10-1-2、10-1-3、10-2-2、10-2-3和10-3-2號試管中產(chǎn)氣，其余的不產(chǎn)氣的記為大腸菌群陰性菌。結(jié)果見表11。

2.3.2 伊紅美藍瓊脂平板試驗

在乳糖膽鹽發(fā)酵管中，選取德漢氏小管產(chǎn)氣的試管，進行取樣稀釋，然后接種到EMB培養(yǎng)基中，涂布均勻，37℃培養(yǎng)24 h。觀察到培養(yǎng)基的表面長滿了帶有金屬光澤的紫色菌落。

2.3.3 乳糖發(fā)酵試驗

由于乳糖發(fā)酵試驗不是純菌發(fā)酵而是樣品發(fā)酵，所以初發(fā)酵陽性并不能代表大腸菌群為陽性，要進行驗證實驗。挑選合適的菌落進行革蘭氏染色，同時取相同部位的菌落置于乳糖發(fā)酵管37℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果見表12。

由表12可知，10-1-2、10-2-2和10-2-3號試管中存在大腸菌群。對照MPN檢索表可得，樣品中大腸菌群1 100 CFU/100 mL。95%可信限下限300 CFU/100 mL，上限3 600 CFU/100 mL。

3 結(jié)論

根據(jù)GB4789—2010《食品微生物學(xué)檢驗》和GB17324—2003《瓶（桶）裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，采用菌落計數(shù)及多管發(fā)酵等。對某公司生產(chǎn)的桶裝純凈水進行微生物檢測鑒定[14-16]。樣品采集選擇的時間分別為成品下線后6 h、12 h、24 h、48 h和96 h。在純凈水生產(chǎn)工藝中有臭氧殺菌的工序，殘留的臭氧有殺菌的功效，加上生產(chǎn)環(huán)節(jié)符合衛(wèi)生要求，因此成品下線6 h檢測樣品時幾乎沒有微生物的存在。

實驗結(jié)果表明，桶裝純凈水隨著存放時間的延長，微生物的菌落總數(shù)也隨之增多，成品下線12 h后，細菌、霉菌、酵母菌菌落總數(shù)及大腸菌群均超過國標(biāo)要求。分析造成這種現(xiàn)象的原因，有可能是3種情況：一是桶裝純凈水在生產(chǎn)過程中殺菌不徹底；二是在運輸銷售過程中的擠壓、碰撞造成桶蓋松動；三是開啟飲用的過程中受到有菌的飲水機的影響。針對這幾種微生物污染的原因，首先應(yīng)從生產(chǎn)環(huán)節(jié)加以控制，嚴(yán)格要求從業(yè)人員進行無菌操作，制定良好的操作規(guī)范，確定關(guān)鍵控制點。對制水車間和灌裝車間進行紫外線殺菌，對生產(chǎn)管道和貯水容器、空桶及桶蓋進行臭氧消毒。其次在運輸銷售過程中，要檢查桶蓋的密封性是否完好，嚴(yán)防過分的擠壓、劇烈的碰撞導(dǎo)致桶蓋松動。最后在開啟飲用前，要對飲水機進行清洗消毒，防止雜菌污染?？傊?，解決好桶裝純凈水在生產(chǎn)、運輸和飲用過程中的微生物污染問題，是提高桶裝純凈水質(zhì)量的有效途徑。

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Detection and identification of microorganisms in bottled purified water

LIZuomei,LINa,WANGXiaoyun,YUZequan

(Departmentof Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233000,China)

The totalbacterialcountwas detected and microorganism categories were identified in bottled purified water afteronline production for6 h, 12 h,24 h,48 h,96 h.The main detection purpose was to prevent and control microorganism in pure water process.Test results showed that total bacterial count of samples after online production for 6 h almost had no microorganisms,however,with the extension of time,the totalnumber of colonies increased obviously.Afterseparation,purification and identification ofdifferentcolonies,the results showed thatbacteria(mainly Escherichia coli)and fungiwere founded.

bottled purified water;microorganism;totalbacterialcount;Escherichia coli

TS201.3

A

0254-5071（2015）02-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.036

2014-09-02

蚌埠學(xué)院工程研究中心項目（BBXYGC2013C05）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（201411305016）

李作美（1975-），講師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。