顏 琪，顧春華，李京寧

（1.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏 銀川 750000）

基于離子色譜技術(shù)快速定量乳制品中亞硝酸鹽的含量

顏 琪1，顧春華2，李京寧1

（1.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心，寧夏 銀川 750000）

本研究旨在建立離子色譜法快速測定乳制品中亞硝酸鹽含量的分析方法。樣品采用0.005 mmol/L NaOH提取，1∶1的乙腈-3%乙酸溶液作為蛋白沉淀劑，以1.8 mmol/L NaHCO3-和1.2 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速為1.2 mL/min，分析柱為InoPacAS14，電導(dǎo)檢測器檢測。結(jié)果表明，亞硝酸鹽的檢出限為0.04 mg/kg，加標(biāo)回收率為96.8%～99.4%，與國標(biāo)GB/T 5009.33—2010中檢測方法比較，相對偏差＜1%。方法簡便，快速，用于乳制品中亞硝酸鹽含量的測定結(jié)果滿意。

離子色譜法；亞硝酸鹽；乳制品；定量檢測

乳制品中含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、多種維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)要素[1]。亞硝酸鹽在細(xì)菌的作用下可變成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝酸胺，亞硝酸鹽含量過高會引起高鐵蛋白癥[2-3]。目前各類品種繁多的乳制品不斷涌入市，隨著人們生活水平的提高，越來越多的家庭把乳制品當(dāng)作每日不可缺少的必需品[4]。因此，牛奶質(zhì)量的好壞直接影響到人們的身體健康。隨著人們對食品安全認(rèn)識的提高，乳制品中亞硝酸鹽的含量日漸成為人們關(guān)注的對象，乳制品中亞硝酸鹽含量高低是衡量乳制品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[5-6]。因此監(jiān)測乳制品中亞硝酸鹽含量有著極為重要的意義。

目前，乳制品中亞硝酸鹽主要依據(jù)國標(biāo)GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》，采用比色法進(jìn)行定量[7]。但實(shí)踐證明，此法存在操作冗長費(fèi)時，需用多種化學(xué)試劑，干擾大，靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性較差等缺點(diǎn)[8]。離子色譜法是重要的現(xiàn)代無機(jī)陰離子分析新技術(shù)，具有快速、靈敏、選擇性好、前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)[9]。本研究采用離子色譜法測定乳制品中亞硝酸鹽的含量，通過研究其分離提取的最佳條件及色譜分析參數(shù)，旨在建立一種準(zhǔn)確、快速測定乳制品中亞硝酸鹽含量的方法，適用于大批量檢測工作，進(jìn)一步為亞硝酸鹽的測定研究提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抽取3種市售乳制品（牛奶、酸奶、奶粉，各20個樣品）；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；乙腈、乙酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉均為色譜純：天津市康科德科技有限公司；亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg/L）：北京易萊希諾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-2000型離子色譜儀及分析系統(tǒng)（內(nèi)置式的數(shù)字化的電導(dǎo)檢測器SRS自動再生微膜抑制器）、Chromeleon色譜工作站：美國戴安公司；InoPacAS14分離柱：戴安中國有限公司；美國MILLIPORE（密理博）純水機(jī)：廣州哲天科學(xué)儀器有限公司；ME梅特勒分析天平：武漢宏錦科技有限公司；H-1850R高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；B220恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；0.45μm微孔濾膜：天津富集科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備及分析

稱取經(jīng)混勻的液體乳5.00 g或乳粉1.00 g（精確至0.01 g）于25 mL具塞比色管中，加入10 mL提取劑，水浴加熱，取出后冷卻至室溫。加入10 mL蛋白沉淀劑，用去離子水定容至刻度，搖勻，靜置10 min。在常溫下離心，取上清液，以0.45μm濾膜過濾，備用。以保留時間定性，峰面積外標(biāo)法定量，在相同色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液經(jīng)離子色譜分析。

1.3.2 亞硝酸鹽分析離子色譜條件

色譜柱：陰離子分離柱Dionex AS14柱（4 mm×250 mm）及保護(hù)柱IonPac AS14（4 mm×50 mm）；流動相：淋洗液；檢測器：電導(dǎo)檢測器；抑制器：陰離子抑制器；進(jìn)樣量：25μL。

1.3.3 計(jì)算公式

試樣中亞硝酸鹽（以NO2-計(jì)）含量按下公式計(jì)算：

式中：X為試樣中亞硝酸鹽的含量，mg/kg；C為試樣中實(shí)測亞硝酸鹽的質(zhì)量濃度，mg/L；V為試樣溶液體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

式中：X為試樣中實(shí)測亞硝酸鹽的含量，mg/kg；A為試樣所含亞硝酸鹽的含量，mg/kg；B為加入標(biāo)品量，mg/kg。

1.3.4 亞硝酸鹽分離提取及色譜分析條件的優(yōu)化

（1）分離提取條件的優(yōu)化

提取劑的種類、提取溫度及時間對亞硝酸鹽的提取效果有很大影響，為確保準(zhǔn)確的定量結(jié)果，本研究對亞硝酸鹽的分離提取主要從以下幾個方面展開：提取劑種類的選擇、提取溫度及時間的優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)的分離提取工藝。以亞硝酸鹽的回收率為評價指標(biāo)，根據(jù)查閱資料，選用的提取劑為超純水及0.005 mmol/L NaOH[10]，并且采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)U9（96），以提取溫度、時間作為分離提取關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化工藝，因素與水平見表1。

（2）蛋白沉淀劑的選擇

乳制品中含有大量的蛋白質(zhì)，會污染分離柱，縮短分離柱的使用壽命，使柱效降低，因此在前處理過程中必須除去蛋白[11]。GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》比色法中通常使用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白，然而此法在沉淀蛋白的同時卻在溶液中引入了鋅、鐵等金屬離子，其進(jìn)入色譜柱中會發(fā)生殘留，不但干擾分離效果，且會損壞色譜柱[12]。本試驗(yàn)查閱資料擬選用的蛋白沉淀劑種類[13]見表2。

（3）分離參數(shù)的優(yōu)化

以亞硝酸鹽的回收率為評價指標(biāo)，選出最佳的離心轉(zhuǎn)速與時間，離心試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表3。

（4）離子色譜分析參數(shù)的優(yōu)化

乳制品的基體組成復(fù)雜，會存在雜質(zhì)與亞硝酸鹽的保留時間接近的問題，干擾目標(biāo)物的測定[14]。而物質(zhì)的保留時間受淋洗液的種類、濃度及流速的影響，是影響分析效果的主效因素，因此應(yīng)該在保證檢測靈敏度的前提下，通過優(yōu)化流速、淋洗液種類及濃度，從而調(diào)整樣品保留時間，避免分離過程中雜質(zhì)的干擾[15-16]。

經(jīng)查閱資料，篩選出選擇1.8 mmol/LNaHCO3+1.2mmol/L Na2CO3作為淋洗液，且流速為1.2 mL/min[17-18]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2010處理數(shù)據(jù)，使用IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑對亞硝酸鹽回收率的影響

提取劑對亞硝酸鹽回收率的影響見圖1。由圖1可知，用0.005 mmol/L的NaOH溶液和超純水分別對亞硝酸鹽進(jìn)行提取時，前者的效果更好，對亞硝酸鹽的回收率高，這是因?yàn)閬喯跛猁}（NO2-）在弱堿性條件下更能穩(wěn)定地存在[19]，因此，本試驗(yàn)選擇0.005 mmol/L的NaOH溶液作為提取劑。

2.2 提取時間及溫度對亞硝酸鹽回收率的影響

對亞硝酸鹽分離提取工藝關(guān)鍵參數(shù)，即提取時間及溫度的優(yōu)化結(jié)果見表4。

由表4可知，第6組試驗(yàn)的回收率指標(biāo)值99.3%最大。通過IBMSPSS Statistics 19軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出顯著性檢驗(yàn)中R2=0.998，F(xiàn)＞F0.01，說明回歸方程高度顯著。根據(jù)回歸方程各個系數(shù)絕對值的大小可判斷兩個因素對亞硝酸鹽回收率的影響順序?yàn)闇囟龋緯r間。通過Excel規(guī)劃求解，得出最優(yōu)搭配及最佳試驗(yàn)指標(biāo)。亞硝酸鹽分離提取最佳參數(shù)為提取時間30 min，提取溫度60℃。按以上獲得的最優(yōu)分離工藝參數(shù)提取亞硝酸鹽，3次回收率平均值為99.4%。

2.3 蛋白沉淀劑對亞硝酸鹽回收率的影響

蛋白沉淀劑對亞硝酸鹽回收率的影響見圖2。由圖2可知，使用乙腈-3%乙酸混合溶液提取亞硝酸鹽時，沉淀蛋白效果最為理想。這可能是由于兩種有機(jī)溶劑的組合能更好地沉淀性質(zhì)不同的蛋白雜質(zhì)[20]。比較乙腈與3%乙酸在不同體積比條件下對蛋白的沉淀效果及對亞硝酸鹽（NO2-）回收率的影響，結(jié)果見表5。

從表5中可以看出，隨著乙腈在混合溶液中比例的增加，沉淀蛋白的效果越來越好，且對亞硝酸鹽的回收率也逐漸升高，當(dāng)乙腈與3%乙酸體積比為5∶5時，沉淀蛋白的效果滿意且能兼顧良好的回收率。隨著乙腈體積的繼續(xù)增加，沉淀蛋白的效果及對亞硝酸鹽的回收率均趨于下降趨勢。因此，本試驗(yàn)選擇1∶1的乙腈-3%乙酸溶液體積比作為蛋白沉淀劑，沉淀效果較好，省去過小柱步驟，節(jié)約成本，快速有效。

2.4 離心轉(zhuǎn)速和離心時間對亞硝酸鹽回收率的影響

根據(jù)擬定的離心轉(zhuǎn)速和離心時間進(jìn)行試驗(yàn)，所得結(jié)果見表6。

由表6可知，在離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min時，延長離心時間，亞硝酸鹽的回收率越高，離心效果越好；在離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min時離心效果整體均高于4 000 r/min離心時的效果，這說明，離心轉(zhuǎn)速越高，雜質(zhì)沉降的效果相對越好。當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，離心時間為20 min時，亞硝酸鹽回收率最高，達(dá)99.2%，并且上清液澄清，與雜質(zhì)得到了很好的分離，便于進(jìn)行下一步濾膜過濾。

2.5 離子色譜條件的選擇

選擇1.8 mmol/L NaHCO3+1.2 mmol/L Na2CO3作為淋洗液，且流速為1.2 mL/min時，以電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)，洗脫時間為橫坐標(biāo)，得到的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，結(jié)果見圖3。由圖3可知，亞硝酸鹽出峰時間為4.667 min。樣品以相同色譜條件進(jìn)樣，亞硝酸鹽與乳制品中的雜質(zhì)得到了很好的分離，峰形完整，達(dá)到了最佳的分離狀態(tài)，乳制品中亞硝酸鹽的出峰時間為4.643 min，結(jié)果見圖4。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系和檢出限

將亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)備工作溶液，測得亞硝酸鹽在不同質(zhì)量濃度對應(yīng)的峰面積。峰面積A與質(zhì)量濃度C的線性方程為C=0.593 8+0.0137 6A，相關(guān)系數(shù)R為0.999 8。以信號噪聲的3倍計(jì)算檢出限，亞硝酸鹽的檢出限為0.04 mg/kg。GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》中檢測方法的檢出限為0.2 mg/kg，檢出限本法低于國標(biāo)5倍。

2.6.2 回收率試驗(yàn)

依次對已知含有一定亞硝酸鹽含量的4種乳制品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，計(jì)算其平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表7。

表7可以看出，亞硝酸鹽的回收率在96.8%～99.4%之間，本方法測定亞硝酸鹽的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.5%。由此表明，本試驗(yàn)方法具有良好的準(zhǔn)確度，可以達(dá)到定量分析的要求。

2.7 方法對比試驗(yàn)

隨機(jī)選擇乳樣45個，分別按GB/T 5009.33—2010《食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽》中的比色法和離子色譜法檢測樣品，進(jìn)行對比試驗(yàn)，亞硝酸鹽含量測定結(jié)果取平均值，結(jié)果見表8。

表8結(jié)果表明，兩種方法所測的亞硝酸鹽結(jié)果基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.12，P＞0.05），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1%。因此，離子色譜法具備替代比色法檢測乳制品中亞硝酸鹽含量的可能性。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)等統(tǒng)計(jì)方法獲得亞硝酸鹽分離提取及色譜分析的最佳工藝參數(shù)：提取劑為0.005 mmol/L的NaOH溶液，提取時間為30 min，提取溫度為60℃，蛋白沉淀劑為體積比1∶1的乙腈-3%乙酸溶液，離心轉(zhuǎn)速為8 000 r/min，離心時間為20 min，分離液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，以1.8 mmol/L NaHCO3+1.2 mmol/L Na2CO3作為淋洗液，流速為1.2 mL/min進(jìn)行色譜分析，亞硝酸鹽的回收率達(dá)99.4%。

離子色譜法亞硝酸鹽的檢出限為0.04 mg/kg，加標(biāo)回收率為96.8%～99.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.5%，對乳制品中亞硝酸鹽檢測結(jié)果的重復(fù)性優(yōu)于國標(biāo)方法。該方法前處理簡便，靈敏度、準(zhǔn)確性高，檢測限低，能夠滿足液態(tài)乳和乳粉中的亞硝酸鹽的檢測要求。

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Nitrite determination of in dairy products by ion chromatography technique

YANQi1,GU Chunhua2,LIJingning1

(1.Gansu Instiute of Food Inspection and Research,Lanzhou 730030,China; 2.Food Testing Center of the Ningxia HuiAutonomous Region,Yinchuan 750000,China)

An analytical method was developed for nitrite determination in dairy products using ion chromatography.Samples were extracted with 0.005 mmol/L NaOH,and protein was precipitated by the mixture of acetonitrile and 3%acetic acid solution with ratio of 1∶1.The eluent was composed of 1.8 mmol/L NaHCO3-and 1.2 mmol/L Na2CO3,and the flow rate was 1.2 ml/min.The analysis was performed on Dionex AS14 separation column,and the conductivity detectorwas used for detection.Results showed thatthe detection limitwas 0.04 mg/kg fornitrite.The recoveries tested by the standard additions method were in the range of 96.8%to 99.4%.The results was compared with the results of GB/T 5009.33—2010,the relative deviation was less than 1%.The method was simple,time-saving,and suitable forthe determination ofnitrite in dairy products.

ion chromatography;nitrite;dairy product;quantitative determination

O658

A

0254-5071（2015）02-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.034

2014-12-02

顏 琪（1964-），女，高級工程師，本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量和安全分析。