歐陽遜，劉松梁，姚明明，曾 潔，張廣吉

(中國桂林昊旺生物科技有限公司科研中心，廣西 桂林 541000)

安全、低毒、低殘留、高效、方便和經濟等是農藥生產的基本原則，這些原則是農藥和農業(yè)發(fā)展的基本要求，也是當今人們對環(huán)境友好生產的訴求[1]，滿足這些要求當推生物農藥。ZR-型保幼激素即是一種典型生物農藥，不僅是一種具備保幼激素活性的高效昆蟲生長調節(jié)劑，而且生物活性和穩(wěn)定性都遠遠超過天然保幼激素[2-4]。其中ZR-515是廣西昊旺生物科技有限公司主打產品，于2014年12月建成投產，實現(xiàn)了國內首家工業(yè)化規(guī)模生產保幼激素類似物烯蟲酯（11-甲氧基-3,7,11-三甲基-2E，4E-十二烯酸異丙酯）。

作為農藥原藥，投放市場前須辦理農藥登記，辦理農藥登記需提供一定數(shù)量高純的烯蟲酯（＞98%），以及原藥中存在的雜質成分確認。目前車間生產的烯蟲酯含量在92%左右，僅在合格范圍內，與高純原藥含量有較大差距，需通過一定手段純化方能取得。

鑒于烯蟲酯性黏，飽和蒸氣壓低，同時對溫度敏感，不宜用蒸餾除去可能存在的雜質；同時可能存在的雜質分子量與烯蟲酯分子量比較接近，也不適合分子蒸餾法提純；比較可行的純化方法有高效液相制備及提純。但據(jù)相關單位信息，提純100g費用4～5萬，是一筆不小的費用。本公司科研中心實驗室通過一段時間摸索，采用柱層析方法進行分離提純，制得高純烯蟲酯。

1 儀器和試劑

福立氣相色譜儀（9790Ⅱ），島津液相色譜儀，玻璃層析柱（30mm×400mm），柱層析硅膠（0.038～0.049mm），三用紫外分析儀，硅膠板（50mm×100mm），旋轉蒸發(fā)儀。

正己烷（95%），丙酮（AR），癸二酸二丁酯（GD），甲醇（GR），烯蟲酸標準樣品（＞99%），烯蟲酯（87% ～93%）。

2 烯蟲酯的含量測定分析

烯蟲酯含量測定普遍使用氣相色譜和高效液相色譜分析[5-6]，本研究采用氣相色譜與液相色譜結合分析烯蟲酯含量[7]。

2.1 氣相色譜分析

2.1.1 儀器

氣相色譜儀：氫火焰離子化檢測器，氣相工作站。色譜柱：OV-1701，30m×0.32mm×0.5μm毛細管柱。微量進樣器：10μL。

2.1.2 氣相色譜條件

溫度：柱室240℃，汽化室270℃，檢測室270℃。

氣體流量：載氣 (N2) 30 mL?min-1，H230mL·min-1，Air 300 mL·min-1。

進樣量：1.0μL；保留時間：烯蟲酯約5.2min，內標物約6.3min，參見圖1。

2.1.3 測定步驟

2.1.3.1 標準溶液的配制

圖1 內標法測定烯蟲酯出峰情況

稱取烯蟲酯標準樣一定量（精確至 0.0002g），置于10mL容量瓶中，準確加入2.0mL內標物（癸二酸二丁酯），用丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.3.2 試樣溶液的配制

稱取烯蟲酯與標準樣相同的量（精確至0.0002g），按2.1.3.1同法操作。

2.1.3.3 測定

分別取標準樣溶液進樣3次和試樣溶液進樣2次測定。

2.1.3.4 計算

由測得的3次標準樣烯蟲酯與內標物峰面積之比計算平均值，同時測2次試樣烯蟲酯與內標物峰面積之比，計算平均值，按下式計算烯蟲酯含量X。

式中：r1為標準樣烯蟲酯與內標物峰面積之比算平均值；r2為試樣烯蟲酯與內標物峰面積之比算平均值； m1為標準樣烯蟲酯質量；m2為試樣烯蟲酯質量； w1為標準樣烯蟲酯質量分數(shù)。

平行測定2次試樣，結果允許誤差不大于1.5%。

2.2 高效液相色譜分析

2.2.1 儀器

色譜柱：C18，5μm，150mm×4.6mm；流動相：流速 1.0mL·min-1， V甲醇/V水= 85/15；檢測波長：270nm；柱溫：35℃ ；進樣量： 4.6μL。

2.2.2 測定步驟

取一定量標準樣烯蟲酯溶解于100mL容量瓶中，從中取5mL用甲醇稀釋到50mL，同法配制試樣烯蟲酯溶液。在相同條件下各平行進樣2次，測得標準樣積分面積A標樣和試樣的積分面積A試樣，取平均值。

2.2.3 計算

式中：A試樣為試樣的面積；A標樣為標準樣的面積；m試樣為試樣的質量，g；m標樣為標準樣的質量，g；p為標準樣的含量，%；n為試樣溶液的稀釋倍數(shù)與標準樣溶液的稀釋倍數(shù)比。

平行2次測得結果面積的絕對誤差小于0.5%.

3 烯蟲酯的定性分析

高效液相色譜對烯蟲酯檢測的靈敏性可用于其定性分析，分析操作可按照2.2的步驟進行，從而可判斷烯蟲酯可能存在的雜質個數(shù)，具體見圖2、圖3、圖4。

圖2 烯蟲酯標樣液相圖譜

圖3 純化烯蟲酯（99.22%）圖譜

圖4 烯蟲酯原樣（88%）圖譜

從以上3個圖譜可看出，經純化后烯蟲酯3.605min處的雜質基本去除，9.322min的雜質去除，12.279min處和1.756min處的雜質仍然存在（參見圖3），但含量變少。

4 烯蟲酯的純化

鑒于烯蟲酯作原藥登記需提供一定量的高純烯蟲酯，而且還可部分用于企業(yè)內部用作參考標樣，因此有必要摸清烯蟲酯的純化處理條件。鑒于烯蟲酯黏性大，飽和蒸氣壓低，僅通過分相、水洗和減壓蒸餾不能去除雜質，需另辟途徑方可實現(xiàn)純化，于是采用了柱層析純化。

4.1 硅膠板層析實驗

為了摸準洗脫條件，用硅膠板做層析實驗，使Rf差值在0.2左右，從而分離烯蟲酯中雜質。經試驗，分別以正己烷與丙酮、乙酸乙酯與丙酮混合液作流動相，烯蟲酯原樣、雜質Rf情況見圖4～圖8（圖中A為烯蟲酯、B、C為雜質）。

圖4 正己烷∶丙酮100∶0.8烯蟲酯原樣的薄層層析圖

圖5 正己烷∶丙酮100∶1烯蟲酯原樣的薄層層析圖

圖6 正己烷∶丙酮100∶1.2烯蟲酯原樣的薄層層析圖

圖7 乙酸乙酯∶丙酮100∶0.8烯蟲酯原樣的薄層層析圖

圖8 乙酸乙酯∶丙酮100∶1烯蟲酯原樣的薄層層析圖

當用乙酸乙酯和丙酮作溶劑時，烯蟲酯、雜質A、B都接近溶劑線，不能分離，而極性最大的雜質已離開點樣線(見圖7、圖8)。最后以V正/V丙：100/1～100/2正己烷丙酮混合液作洗脫液。

4.2 柱層析

層析柱：30mm×400mm；層析硅膠：0.038～0.049mm；硅膠裝填高度：27～30cm； 上樣量：4～6g；流動相：正己烷丙酮混合液；檢測：三用紫外分析儀。

4.2.1 定性分析

收集不同洗脫段的烯蟲酯溶液，經旋轉蒸發(fā)儀減壓脫除溶劑后，洗脫液前段、中后段的硅膠板層析圖見圖9。

圖9 烯蟲酯原樣、層析前段和中后段的薄層層析情況

結果表明，宜采集洗脫中后段濃縮液，并用液相對洗脫液中段的濃縮液進行定性分析，結果見圖3、4及表1。發(fā)現(xiàn)經純化后，個別雜質峰已消失，部分雜質峰明顯減少，達到純化效果。

表1 烯蟲酯純化前后雜質峰變化情況

4.2.2 定量分析

濃縮液經旋轉蒸發(fā)儀減壓脫除溶劑后，對收集的中后段烯蟲酯用氣相色譜作定量分析，結果見表2。說明柱層析可純化烯蟲酯，得到高純度的烯蟲酯，并且發(fā)現(xiàn)與烯蟲酯原樣濃度關系不大。

表2 烯蟲酯純化前后的含量

5 潛在的經濟效益

根據(jù)目前的分離技術，使用比較先進的高效液相色譜制備機純化烯蟲酯，費用4～5萬元·(100g)-1，處理耗費色譜純溶劑500L·(100g)-1左右，溶劑的后續(xù)處理將是一筆不小的費用。使用柱層析分離提純，柱層析純化成本1.6萬元·(100g)-1。主要溶劑正己烷可部分回收，如提純的烯蟲酯能部分轉化為產品，產生的效益參見表3。由表3可見，實驗室用柱層析法分離提純烯蟲酯是一種可行、實用、見效快的方法。

表3 柱層析純化烯蟲酯費用核算

[1] 黎金嘉.農藥液體制劑配方設計參考[J].農藥市場信息，2007(13)：4-6.

[2] 金人憲，楊育華.ZR-型保幼激素類似物合成工藝研究[J].現(xiàn)代農藥，2007(1)：15-17．

[3] Amanda S.Hill,Joanne V.Mei,Chih-MingYin, Bruce S, et al.Determination of the Insect Growth Regulator Methoprone in Wheat Grain and Milling Fractions Using an Enzyme immunoassay[J]. Agric.Food chem., 1991(39): 1882-1886.

[4] Joanne V. Mei, Chih-Ming Yin, Louis A, Corpino, et al.Hapten Synthesis and Development of immunoassays for Methoprene[J]. Agric. Food chem., 1991(39): 2083-2090.

[5] Robert A. Heckman, Bruce S. Ferguson, Titan S. Fan, et al. Validation of an Enzyme immunoassays for analysis of Metfhoprene Reidues on Tobacco[J]. Agric. Food chem.,1992(40): 2530-2532.