龔洪波

432819湖北省大悟縣新城中心衛(wèi)生院

酶標儀雙波長與單波長比色測定HBsAg的比較

龔洪波

432819湖北省大悟縣新城中心衛(wèi)生院

目的：尋找一種更加準確和重復性較好的酶標儀檢測的方法。方法：對酶標儀雙、單波長進行準確性和重復性進行比較。結(jié)果：CV的單波長3.45%，CV的雙波長1.86%，兩者的差距十分大，單波長的CV數(shù)值是遠遠大于雙波長，但是兩者的靈敏度卻是十分相同的。結(jié)論：在采用酶標儀比色時，應該使用雙波長進行檢測，進而使試驗分析的準確度更確切，降低實驗中出現(xiàn)的誤差。

酶標儀；HBsAg；雙波長

使用酶標儀對e抗進行檢測，在選擇雙、單波長使用方面進行研究分析，供大家參考。當使用酶標儀判定HBsAg的結(jié)果時，我們會相應地發(fā)現(xiàn)用單波長比色測定會促進部分弱陽性樣品漏檢，而采用雙波長比色測定則可進一步減少相應現(xiàn)象的發(fā)生。

資料與方法

HBsAg試劑盒為上海某公司。

DRG-3000型酶標儀，美國某公司產(chǎn)。

將HBsAg陽性對照血清倍比稀釋1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64后進行測定。

標本：257例患者血清。

方法：稀釋樣品100 μL加入反應孔，37℃25 min，洗孔后加酶結(jié)合物100 μL，37℃25 min，洗孔后加顯色劑100 μL，37℃10 min，加終止液50 μL終止反應，單波長用450 nm濾色片，雙波長用450 nm為主波長，630 nm為副波長，實驗同時設(shè)陰、陽性對照。樣品吸光度(A)/CO≥2.1判定為陽性(按說明書規(guī)定，CO=4.0×陰性對照吸光度值，若陰性對照吸光度＜0.05則以0.05計算)。

結(jié)果

倍比稀釋的陽性對照血清測定結(jié)果，單波長法A值2.846，2.437，1.806，1.580，1.438，0.350(CO 1.068)，即僅1: 2、1:4陽性。雙波長法 A值 2.641，2.528，2.475，2.286，2.262，2.188(CO 1.002)即1:2、1:4、1:8、1:16均陽性。

257例患者血清測定兩法結(jié)果一致的252例，5例不同的結(jié)果單波長法A值1.978，1.877，1.604，1.354，1.022，全陰性；雙波長法A值2.248，22.215，2.284，2.209，2.256，全陽性。1個月后再次檢測該5例患者HBsAg，結(jié)果仍為陽性。

單波長法測定易受顯色劑空白吸光度、血清濁度、反應孔劃痕等因素的影響，因此吸光度較高，而雙波長法可有效避免上述影響因素，減少了干擾，提高了HBsAg弱陽性樣品的檢出率。因此我們建議在使用酶標儀判定HBsAg結(jié)果時應盡可能使用雙波長比色法，以保證結(jié)果的可靠性。

討論

因為至今仍然沒有一種鏈球菌抗原使人體感染后，可以使抗原體100%地引起反應，在國外的大多文獻中主張在1個實驗中同時檢測2種以上的鏈球菌抗體。而針對急性的風濕熱，或者是擁有急性腎炎的患者，ASO水平偏低或者處于不穩(wěn)定的臨界值時，ADNaseB抗體在大多數(shù)情況下會出現(xiàn)升高的可能，所以可以做除ASO之外的關(guān)于第2種抗體進行相關(guān)的測定。

鏈球菌抗體的水平不僅會受到季節(jié)和地理位置影響，還受年齡的影響。所以，實驗室的位置特殊會影響數(shù)值，最后可以在同一地區(qū)為不同年齡的患者做測定，以免出現(xiàn)誤診。根據(jù)本實驗測定，結(jié)果表明，鏈球菌的2種抗原體，即ADNaseB與ASO的水平會在成年人與學齡前兒童中顯示較低，而對于學齡期則是較高，這一測定國內(nèi)外是顯示一致的。

酶標儀在測定雙波長和單波長過程中，其相應的自動化分析儀以及模式是十分相似的。但是，這兩者的吸光度測定在一定程度上有很大不同。而通常情況下，其相應的生化分析是屬于水平光路形成的，但是酶標儀檢測的是垂直光路。

這兩者之間的測定原理是完全一樣的，這兩者都完全使用的是朗博-比爾定律，均是測定樣本的吸光度，但針對垂直光的特點來說，其標本的吸光度被液體濃縮或者稀釋的影響特別小，但是酶標板的透光性和樣本的液面是否保持一致和孔底是否保持平整等等的影響卻是非常大的。

在進行使用單波長測定酶標儀進行吸光度的時候，排除被測定內(nèi)源性等因素以外的干擾外，相應液體表面所展現(xiàn)的張力對其的影響是巨大的。而在整個檢測中，由于相應的液體表面張力起到相關(guān)作用，在液體表面并不是相對平整的平面，其是一個凹凸不平的凹面，在側(cè)面觀察看起來像一個凹透鏡，而在這種情況下就會不可避免地影響光路順暢地經(jīng)過。而因為受到來自于凹液面的影響，當光線在通過液面的時候，除掉被液體正常吸收的一部分外，還有一部分是被直接反射以及折射過來的，就像光線透過凹透鏡那樣，促使吸光度的監(jiān)測受到直接影響。并且酶標儀主要采用的是點光源，其點光源通過光導纖維傳播，如果每次都進行相同的檢測，就會保證吸光度的重復性，可是利用內(nèi)機械運動等多種因素所引起的誤差，是不可能保證所有孔都被檢測到。因此，使孔和孔之間存在一些明顯差異。整塊板的單波長的CV檢測值3%以上，吸光度最低值和最高值的誤差達到12%以上。

然而，針對雙波長的檢測，其是為了減少電路干擾以及測定干擾，所以，測定結(jié)果會得到十分明顯的改善，整塊樣板的CV值＜2%。在對穩(wěn)性觀察時，這兩次的檢測結(jié)果均呈現(xiàn)出相應的一致性，而這項檢測表明ST-360穩(wěn)定性會好很多[1]。不僅如此，經(jīng)過相關(guān)資料我們知道，有關(guān)上海某公司所產(chǎn)生的直接WellscanMK2與ST-360測定結(jié)果是完全相同的，而兩者在進行檢測的性能上基本一致。但是，其相應的內(nèi)液體的表面張力是不同的，會促進單波長在測定過程中直接產(chǎn)生較大的誤差。而且，對于不同的洗滌劑將影響終止液和最后加入的底物液面基本情況是有區(qū)別。但是，其表面活性劑逐漸加入到洗滌劑清洗后，相關(guān)液面形成的更凹，其單波長所受到的影響也相對較大，同時表明抗原活性劑以及其的濃度形成正比關(guān)系。然后，在使用中性蒸餾水進行洗滌后，雙、單波長的技術(shù)檢測的結(jié)果是一樣的。

[1]于芹,王建軍.免疫診斷試劑盒使用的質(zhì)量控制[J].基層醫(yī)學論壇,2010,14(31):1021-1022.

Comparison of enzyme standard instrument dual wavelength and single wavelength colorimetric determination of HBsAg

Gong Hongbo
Xincheng Center Hospital of Dawu County,Hubei Province 432819

Objective:To find a more accurate enzyme standard instrument test method with good repeatability.Methods:The accuracy and repeatability of enzyme standard instrument dual wavelength and single wavelength were compared.Results:The single wavelength of CV was 3.45%.The dual wavelength of CV was 1.86%.The difference was very big.The CV value of the single wavelength was much larger than that of the dual wavelength,but the sensitivity of the two were very same.Conclusion:When using enzyme standard instrument than color,it should be detected using dual wavelength,and then make the accuracy of test analysis more accurately,and reduce the error occurred in the experiment.

Enzyme standard instrument;HBsAg;Dual wavelength

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.3.72