張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻(xiàn) 潘松 周軍

雙特異性磷酸酶-6基因甲基化在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻(xiàn) 潘松 周軍

目的探討雙特異性磷酸酶-6(DUSP-6)基因甲基化在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法 應(yīng)用甲基化特異性PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR分別檢測(cè)38例鼻咽癌組織和14例慢性鼻咽炎組織中雙特異性磷酸酶-6基因甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 38例鼻咽癌組織中有29例發(fā)生雙特異性磷酸酶-6基因甲基化, 14例鼻咽部慢性炎癥組織中無一例發(fā)生雙特異性磷酸酶-6基因甲基化。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.217, P=0.105＞0.05), 而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中DUSP-6基因甲基化(24/26)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(5/12)的鼻咽癌組織, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.216, P=0.000＜0.05)。甲基化的鼻咽癌組織中雙特異性磷酸酶-6弱或無表達(dá), 非甲基化的鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中雙特異性磷酸酶-6強(qiáng)表達(dá)。結(jié)論 鼻咽癌中雙特異性磷酸酶-6表達(dá)與其基因甲基化狀態(tài)有關(guān), 雙特異性磷酸酶-6基因甲基化可能是鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素。

雙特異性磷酸酶-6；甲基化；鼻咽癌；轉(zhuǎn)移

DNA甲基化是基因表觀遺傳學(xué)的主要方式, 許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因的甲基化有關(guān), 尤其是抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化失活在惡性腫瘤的發(fā)生中起重要作用。人類雙特異性磷酸酶-6(dual-specificity phosphatase-6, DUSP-6)是雙特異性磷酸酶家族成員之一, 最近發(fā)現(xiàn)它具有腫瘤抑制作用。本研究擬應(yīng)用甲基化特異性PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)鼻咽癌組織中雙特異性磷酸酶-6基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及其表達(dá)情況,了解DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 本研究中52例鼻咽癌及慢性鼻咽炎組織標(biāo)本來源于本院因鼻咽部新生物取活檢的患者, 其中鼻咽癌組織38例, 慢性鼻咽炎組織14例。全部鼻咽癌組織經(jīng)病理診斷均為未分化癌, 按照2002年國際抗癌協(xié)會(huì)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期10 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期12 例、Ⅳ期5例, 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例, 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例。所有患者在活檢前均未經(jīng)放療或化療。

1.2 甲基化特異性PCR 應(yīng)用DNA提取試劑盒［Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD］提取上述組織的DNA, 然后用DNA修飾試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit)對(duì)上述提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理。根據(jù)Gene Bank中DUSP-6基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)甲基化和非甲基化的擴(kuò)增引物, 甲基化的引物僅能對(duì)鼻咽癌或鼻咽部慢性炎癥組織中DUSP-6基因甲基化的DNA擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物, 非甲基化的引物僅能對(duì)鼻咽癌或鼻咽部慢性炎癥組織中DUSP-6基因非甲基化的DNA擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物。DUSP-6甲基化的引物序列為：5'-ATATAATTTGTTTTAGTCGGTTCGT-3'(正義鏈), 5'-GATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCG-3'(反義鏈)；DUSP-6基因非甲基化的引物為：5'-AATATAATTTGTTTTAGTTGGTTTGT-3'(正義鏈), 5'-CAATTTACTATCTCTTAAACTCAACCTCAC-3'(反義鏈)。甲基化反應(yīng)條件為：94℃4 min預(yù)變性, 變性94℃30 s、退火56℃30 s、延伸72℃30 s 35個(gè)循環(huán), 末段延伸72℃5 min。然后將上述產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳成像分析。

1.3 RT-PCR檢測(cè)DUSP-6 mRNA表達(dá) 取低溫保存的上述各組織約50 mg, 用TRIzol試劑提取總RNA, 然后分別用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GeneBank中DUSP-6基因序列設(shè)計(jì)引物, 5'-GTGTCTTGGTACATTGCTTGGC-3'(正義鏈)和5'- GTCATAGGCATCGTTCATCGAC-3' (反義鏈), 作為內(nèi)參照的β-actin的引物: 5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3' (正義鏈)和5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3' (反義鏈)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min , 然后 95 ℃變性45 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s 35個(gè)循環(huán), 最后末段72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物5 μl用2%瓊脂糖凝膠電泳并成像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

甲基化特異性PCR結(jié)果顯示, 在DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌組織中僅甲基化引物能擴(kuò)增出甲基化產(chǎn)物, DUSP-6基因非甲基化的鼻咽癌組織中僅非甲基化引物能擴(kuò)增出非甲基化產(chǎn)物。38例鼻咽癌組織中有29例DUSP-6基因甲基化, 9例為非甲基化, 其中, 臨床分期I期8/10例甲基化, II期8/11例甲基化, III期9/12例甲基化, IV期4/5例甲基化。14例鼻咽部慢性炎癥組織中無一例出現(xiàn)DUSP-6基因甲基化(Fig1)。DUSP-6基因甲基化在鼻咽癌各分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.217, P=0.105＞0.05),而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中DUSP-6基因甲基化(24/26)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(5/12)的鼻咽癌組織, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.216, P=0.000＜0.05)。

RT-PCR結(jié)果顯示DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌組織中DUSP-6 mRNA弱表達(dá)或不表達(dá), 而DUSP-6基因非甲基化的鼻咽癌組織中DUSP-6 mRNA強(qiáng)表達(dá)。

3 討論

雙特異性磷酸酶是指既能對(duì)磷酸化酪氨酸去磷酸化, 也能對(duì)絲/蘇氨酸殘基去磷酸化的一組蛋白酶, 目前已知大部分雙特異性磷酸酶都在有絲分裂原激活蛋白磷酸酶信號(hào)途徑(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)中行使重要生理功能。DUSP6是雙特異性磷酸酶家族的一個(gè)成員, 它對(duì)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)途徑(extracellular-regulated kinases, ERK)有負(fù)反饋調(diào)控功能, 它的表達(dá)高低直接影響ERK信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用, 在人類正常組織細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)化、遷移及各種病理狀態(tài)的發(fā)生都起著非常重要的作用。最近研究發(fā)現(xiàn), DUSP-6具有抑癌功能,它的高表達(dá)可抑制細(xì)胞生長、增殖、分化及促進(jìn)細(xì)胞凋亡［1］。已有研究發(fā)現(xiàn), 在早期肺癌和胰腺癌組織中DUSP-6高表達(dá),而在晚期肺癌和胰腺癌組織中DUSP-6低表達(dá), 在DUSP-6低表達(dá)的肺癌和胰腺癌細(xì)胞系中恢復(fù)DUSP-6的表達(dá)能抑制癌細(xì)胞的生長、增殖, 同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn), 肺癌中DUSP-6低表達(dá)與其基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān)。DNA甲基化是基因表達(dá)遺傳學(xué)調(diào)控的一種方式。即在DNA序列不變的情況下調(diào)節(jié)某些特定基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性, 控制該基因的表達(dá)?；騿?dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與基因的活性有關(guān), 啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高甲基化是基因失活的主要原因之一, 它對(duì)基因的滅活是通過抑制該基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的。DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生中起重要作用,以抑癌基因?yàn)榇淼腃pG島高甲基化所致的基因失活已成為腫瘤表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容。本研究發(fā)現(xiàn)38例鼻咽癌組織中有29例DUSP-6基因甲基化(甲基化率為76.3%),且DUSP-6基因甲基化的鼻咽癌組織中DUSP-6 mRNA弱或不表達(dá), 而非甲基化的鼻咽癌組織和鼻咽部慢性炎癥組織中DUSP-6 mRNA強(qiáng)表達(dá), 這說明DUSP-6的表達(dá)與其基因甲基化狀態(tài)有關(guān)。另外, DUSP-6基因甲基化與鼻咽癌是否有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān), 這說明DUSP-6基因甲基化狀態(tài)可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

總之, DUSP-6的表達(dá)與其基因甲基化狀態(tài)有關(guān), DUSP-6基因甲基化可能在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。

［1］ 張松, 李爍, 高春生.uPA基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.腫瘤防治研究, 2012, 39(6):691-693.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.31.020

2015-06-11］

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(醫(yī)療衛(wèi)生類)(項(xiàng)目編號(hào)：201203373)

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