韓 靜，卓 穎，袁 若

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)免疫傳感器中的應(yīng)用

韓 靜，卓 穎，袁 若*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

電化學(xué)免疫傳感器是一種將電化學(xué)分析方法與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的具有響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)的生物傳感器。近年來(lái)，基于新型納米材料催化、酶催化以及生物學(xué)放大技術(shù)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的電化學(xué)免疫傳感器的研究頗受關(guān)注。該研究綜述簡(jiǎn)要介紹電化學(xué)免疫傳感器的基本原理，重點(diǎn)評(píng)述了近年來(lái)基于各種信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)免疫傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展。

信號(hào)放大；電化學(xué)；免疫傳感器；綜述

0 引言

近年來(lái)隨著納米技術(shù)、信息科學(xué)以及生物科學(xué)的不斷創(chuàng)新，電化學(xué)生物傳感技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。在眾多的生物傳感器中，電化學(xué)免疫傳感器因與化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等眾多學(xué)科相互滲透、相互交叉而占據(jù)著非常重要的位置[1-2]。值得注意的是，電化學(xué)免疫傳感器具有如下特點(diǎn)：1）具有較好的特異性和選擇性；2）專一性強(qiáng)，只對(duì)特定的底物起反應(yīng)，而且不受顏色、濁度影響；3）體積小，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測(cè)；4）響應(yīng)快，樣品用量少，可以反復(fù)多次使用；5）成本低，便于推廣普及。正是因?yàn)殡娀瘜W(xué)免疫傳感器具有響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性高、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)以及分析化學(xué)等研究領(lǐng)域。

1 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原抗體之間高親和性和高特異性的結(jié)合反應(yīng)，以抗體或抗原作為分子識(shí)別元件，通過換能器將免疫反應(yīng)前后所引起目標(biāo)分析物濃度的信號(hào)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)。圖1是電化學(xué)免疫傳感器的檢測(cè)原理示意圖。電化學(xué)免疫傳感器具有快速、靈敏、選擇性高、測(cè)試費(fèi)用低、靈活便攜、適用于聯(lián)機(jī)化、有望實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等特點(diǎn)，在臨床診斷、生物分析等領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展前景[3]。

圖1 電化學(xué)免疫傳感器原理示意圖Fig.1 Scheme of the principle for an electrochemical immunosensor

2 信號(hào)放大技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用

隨著生物傳感技術(shù)的不斷發(fā)展以及人們對(duì)其要求的日益提高，研制具有靈敏度高、檢測(cè)限低、選擇性和穩(wěn)定性好以及經(jīng)濟(jì)實(shí)用的生物傳感器成為當(dāng)務(wù)之急。為了提高檢測(cè)靈敏度，需要引入信號(hào)放大技術(shù)，它是實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量蛋白定量檢測(cè)的重用手段。下面就納米材料催化、酶催化、親和素-生物素放大、生物放大技術(shù)以及多種信號(hào)放大技術(shù)聯(lián)用在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用分別作簡(jiǎn)要介紹。

2.1 納米材料信號(hào)放大

納米材料除了用作納米載體固載標(biāo)記物（如酶、信號(hào)物質(zhì)、抗體、適體等），還展現(xiàn)出優(yōu)異的電催化活性，非常適合于研制高靈敏度、高選擇性的電化學(xué)生物傳感器。一般情況下，納米材料主要通過以下幾種方式來(lái)增強(qiáng)傳感器的響應(yīng)信號(hào)：1）利用納米材料大的比表面積來(lái)提高信號(hào)物質(zhì)以及具有催化活性的納米粒子或酶的固載量，從而放大響應(yīng)信號(hào)；2）利用納米材料自身良好的催化活性及可作為模擬酶的獨(dú)特性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大[4]。其中以小粒徑的納米金、納米鉑（Pt）、納米鈀（Pd）、Fe3O4等在信號(hào)催化放大方面的應(yīng)用最為常見。

圖2 金磁納米微球標(biāo)記信標(biāo)抗體構(gòu)建夾心型電化學(xué)免疫傳感器[7]Fig.2 Magnetic gold nanospheres for the construction of sandwich-type electrochemical immunosensor from Ref.[7], Copyright 2008 ACS

南京大學(xué)朱俊杰、陳洪淵教授研究小組制備了納米金-溶膠狀碳納米復(fù)合材料并用于構(gòu)建高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器[5]。南京大學(xué)鞠熀先教授課題組利用納米粒子大的比表面積和銀沉積相結(jié)合的方法構(gòu)建了三重信號(hào)放大策略用于檢測(cè)CEA電化學(xué)免疫傳感器，檢測(cè)限達(dá)pg級(jí)[6]。袁若教授研究組[7]用金磁納米微球標(biāo)記信標(biāo)抗體用于夾心酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)CEA（圖2）。實(shí)驗(yàn)表明，金磁納米微球可以顯著提高信標(biāo)抗體和酶的固載量，檢測(cè)下限為10 pg/mL，比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免

疫法（ELISA）低了2個(gè)數(shù)量級(jí)。鞠熀先教授研究組[8]用AuPd雙金屬合金構(gòu)建高靈敏電化學(xué)免疫傳感器用于檢測(cè)小分子氯霉素（圖3）。研究表明，與單一的納米材料（Au或Pd）相比，AuPd復(fù)合納米材料不僅有單一材料的協(xié)同效應(yīng)，而且具有更加優(yōu)異的性能，如大的比表面積、表面更易功能化、更多的結(jié)合位點(diǎn)以及更高的催化活性等特點(diǎn)。

另外，部分納米材料還具有類過氧化物模擬酶的性質(zhì)，對(duì)特定的底物展現(xiàn)出高效的催化活性。例如，韓國(guó)釜山國(guó)立大學(xué)H.Yang教授研究小組最近報(bào)道了一種通過標(biāo)記的納米金電催化還原對(duì)硝基酚為對(duì)氨基酚以放大響應(yīng)信號(hào)的高靈敏電化學(xué)免疫傳感器[9]。Chunming Wang教授研究組[10]制備了納米Pt和Fe3O4功能化的石墨烯納米復(fù)合材料，該復(fù)合物對(duì)甲醇的催化氧化表現(xiàn)出高效的催化活性。福州大學(xué)唐點(diǎn)平教授研究小組[11]利用Fe3O4類過氧化物酶活性與過氧化氫高效催化性構(gòu)建了一種反向比色免疫分析新方法用于對(duì)PSA的高靈敏檢測(cè)（圖4）。

圖3 AuPd雙金屬合金構(gòu)建高靈敏電化學(xué)免疫傳感器[8]Fig.3 Electrochemical immunoassay procedure for the detection of a small molecule from Ref[8],Copyright 2013 ACS

圖4 類過氧化物酶Fe3O4納米磁珠用于反向比色免疫分析示意圖[11]Fig.4 Schematic illustration of magneto-controlled enzyme-mediated reverse colorimetric immunoassay protocol from Ref.[11],Copyright 2013 ACS

2.2 酶催化信號(hào)放大

酶（enzyme）在生物體中扮演重要的角色，是由生命體所產(chǎn)生具有生命調(diào)節(jié)能力的活性蛋白，

具有高效催化性和高度專一性?；诖?，可以通過酶催化其相應(yīng)的底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，從而構(gòu)建高靈敏的電化學(xué)生物傳感器。常用的生物酶有辣根過氧化物酶（HRP）、細(xì)胞色素c氧化酶（Cytc）、葡萄糖氧化酶（GOx）、堿性磷酸酯酶（AP）、葡萄糖脫氫酶（GDH）等。

南京大學(xué)夏興華教授研究組報(bào)道了采用電化學(xué)原位合成法直接將GOx修飾到電極表面的SiO2三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中[12]，構(gòu)建高靈敏的葡萄糖生物傳感器。北京大學(xué)邵元華研究小組制備了高度有序的硅納米管并用于Cytc的直接電催化[13]。陳洪淵教授研究小組[14]用酶催化（AP）在底物抗壞血酸酯 （AA-p）存在下原位產(chǎn)生抗壞血酸（AA），構(gòu)建高靈敏的光電化學(xué)夾心型免疫傳感器，這項(xiàng)研究工作為光電化學(xué)免疫分析的發(fā)展提供了新的方法。Yoon-Bo Shim研究組[15]合成一種鐵的配合物（FePhenTPy）作為電子媒介體修飾絲網(wǎng)印刷電極，通過葡萄糖脫氫酶（GDH）及其輔酶（NAD+）雙重催化放大構(gòu)建了簡(jiǎn)單的葡萄糖生物傳感器（圖5）。

圖5 葡萄糖脫氫酶及其輔酶構(gòu)建葡萄糖生物傳感器原理圖[15]Fig.5 Schematic illustration of glucose biosensors based on glucose dehydrogenase and its coenzyme from Ref.[15], Copyright 2013 ACS

此外，在多酶標(biāo)記實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)這樣一種情況，在同時(shí)標(biāo)記不同種類的酶時(shí)，一種酶催化生成的產(chǎn)物恰好是另一種酶催化反應(yīng)所需要的底物[16]。比如，Md.Aminur Rahman教授研究組[17]將辣根過氧化物酶（HRP）和葡萄糖氧化酶 （GOx）同時(shí)標(biāo)記到羧基化碳納米管表面（圖6）。首先GOx在底物葡萄糖存在下會(huì)產(chǎn)生H2O2，然而生成的H2O2恰好是HRP催化的底物。如此HRP和GOx形成雙酶聯(lián)級(jí)催化，對(duì)于免疫傳感器的信號(hào)放大作用顯著優(yōu)于單酶。該免疫傳感器對(duì)CEA的檢測(cè)限分別達(dá)到4.4 pg/mL。

圖6 雙酶標(biāo)記的碳納米管構(gòu)建多重信號(hào)催化放大的電化學(xué)免疫傳感器[17]Fig.6 Schematic illustrations of the fabrication of the electrochemical CEA immunosensor and detection principle from Ref.[17],Copyright 2013 ACS

韓國(guó)釜山國(guó)立大學(xué)H.Yang教授[18]將單酶和雙酶的催化性能進(jìn)行了對(duì)比（圖7）。當(dāng)在信標(biāo)抗體上僅標(biāo)記一種酪氨酸酶（Tyr），此時(shí)只有單重的信號(hào)放大。當(dāng)在信標(biāo)抗體上同時(shí)標(biāo)記β-半乳糖苷酶（Gal）和Tyr，在底物苯基β-D-半乳糖存在下，Gal首先將其轉(zhuǎn)換為苯酚。生成的產(chǎn)物可以進(jìn)一步被Tyr催化生成鄰苯二酚，最后鄰苯二酚再次被Tyr催化生成鄰苯醌。通過雙酶催化實(shí)現(xiàn)了三重信號(hào)放大，從而大大提高了傳感器的靈敏度。

2.3 親和素-生物素信號(hào)放大

圖7 基于單酶和雙酶催化放大構(gòu)建信號(hào)增強(qiáng)型電化學(xué)免疫傳感器原理示意圖[18]Fig.7 Schematic illustrations of the fabrication of the electrochemical immunosensor and detection principle for one-enzyme and two-enzyme from Ref.[18],Copyright 2014 ACS

生物素（biotin）俗稱維生素H，是由一個(gè)咪唑酮環(huán)和帶羧基的噻吩環(huán)所組成。親和素（avidin）是由四個(gè)亞基組成的一種堿性糖蛋白。從分子結(jié)構(gòu)可以看出，1個(gè)親和素分子理論上能夠結(jié)合4個(gè)生物素分子，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。更重要的是，親和素與生物素在很短的時(shí)間內(nèi)就能快速結(jié)合，并且二者間的特異性和親和力非常強(qiáng)，其結(jié)合能力往往是抗原與抗體作用力的10~100萬(wàn)倍。此外，多數(shù)的抗體、蛋白質(zhì)、DNA、酶等都很容易被生物素化，并且經(jīng)過生物素處理后，生物分子其原有的生物活性不會(huì)降低。因此，基于親和素-生物素信號(hào)放大在生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[19-21]。陳洪淵教授研究組將信標(biāo)抗體用生物素進(jìn)行修飾，當(dāng)加入親和素之后，在1個(gè)親和素位點(diǎn)上可以特異性結(jié)合更多生物素標(biāo)記的G堿基，有效提高了G堿基的固載量，通過hemin-G結(jié)構(gòu)對(duì)H2O2的催化完成對(duì)前列腺特異性抗原的高靈敏檢測(cè)[22]。美國(guó)北達(dá)科他州立大學(xué)劉國(guó)東教授研究小組用脫鐵蛋白納米顆粒將小分子鐵氰化鉀包裹在其空腔內(nèi)，利用親和素-生物素技術(shù)將生物素標(biāo)記的脫鐵蛋白標(biāo)記在信標(biāo)抗體上，在納米磁珠表面進(jìn)行雙抗夾心免疫反應(yīng)[23]。通過調(diào)節(jié)pH，可以將脫鐵蛋白的空腔打開，這樣鐵氰化鉀可以釋放到檢測(cè)底液中，從而用電化學(xué)測(cè)試完成對(duì)目標(biāo)分析物的定量檢測(cè)（圖8）?；?個(gè)親和素可以特異性結(jié)合4個(gè)生物素標(biāo)記的脫鐵蛋白，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。與其它固定方式相比，該方法能夠有效增加電活性物

質(zhì)的固定量，減少電極表面的非特異性吸附，有效放大響應(yīng)信號(hào)，提高傳感器的靈敏度。

圖8 親和素-生物素放大技術(shù)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器示意圖[23]Fig.8 Schematic diagram of the principle for the electrochemical immunosensor with biotin-streptavidin affinity for amplification from Ref.[23],Copyright 2006 ACS

2.4 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）是由Dirks和Pierce[24]在2004年提出的，該反應(yīng)在室溫下就可以進(jìn)行，無(wú)需變溫和其它酶的輔助。其基本原理是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，通過單鏈DNA作為引物鏈誘導(dǎo)寡核苷酸相互雜交、擴(kuò)增形成一條具有二維或三維結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA（dsDNA），從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的目的。由于該反應(yīng)通過引物鏈引起的反應(yīng)，因此可以有效地降低背景信號(hào)、減少假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生，從而引起了研究者的極大興趣。例如，唐點(diǎn)平教授研究組[25]利用分子生物學(xué)技術(shù)—DNA基于雜交鏈反應(yīng)作為信號(hào)放大手段，將引物DNA和信標(biāo)抗體固定在納米金上，實(shí)現(xiàn)高靈敏CEA檢測(cè)。首先用納米金標(biāo)記信標(biāo)抗體，并在納米金表面修飾上S0作為引發(fā)鏈。然后自發(fā)的與兩條單鏈 （分別為含G堿基序列的S1和S2）發(fā)生HCR反應(yīng)。當(dāng)加入hemin后，聚合雙鏈上大量的G堿基能與hemin結(jié)合形成DNzyme，從而實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)的放大。鞠熀先教授研究組[26]將HCR用于構(gòu)建DNA傳感器 （圖9）。首先利用目標(biāo)DNA作為引發(fā)鏈，誘發(fā)兩條發(fā)夾型單體通過HCR得到長(zhǎng)鏈dsDNA，由于dsDNA帶負(fù)電荷能將大量帶正電荷的Ag+相嵌其中，通過納米Ag增強(qiáng)拉曼信號(hào)構(gòu)建了簡(jiǎn)單、靈敏的免標(biāo)記型DNA傳感器。由于HCR不需要加入酶，以單鏈DNA作為引發(fā)劑誘導(dǎo)鏈聚合反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，條件溫和，也可用于其他生物傳感器的構(gòu)建。

Xiaolei Zuo教授研究組[27]利用HCR信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建了三維立體結(jié)構(gòu)的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)MicroRNA（圖10）。利用四面體結(jié)構(gòu)上的目標(biāo)DNA作為引發(fā)鏈，誘發(fā)兩條標(biāo)記有生物素的發(fā)夾型單體在電極表面通過HCR得到的長(zhǎng)鏈dsDNA，通過生物素-親和素識(shí)別能夠?qū)⒋罅康挠H和素修飾的生物酶（HRP）嵌入其中，再經(jīng)酶與底物催化實(shí)現(xiàn)多重信號(hào)放大。

3 結(jié)論

電化學(xué)免疫分析是將分析化學(xué)與臨床診斷相結(jié)合，利用抗體-抗原反應(yīng)的高親合作用建立起來(lái)的新型免疫分析技術(shù)，是疾病診斷、療效觀察和醫(yī)學(xué)研究的重要途徑。然而，在臨床檢測(cè)中，一般對(duì)樣品的檢測(cè)靈敏度不高，而過長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)又會(huì)耽誤病人的治療時(shí)機(jī)，因此研制準(zhǔn)確、快速、高靈敏的免疫傳感器是非常重要的。為了提高傳感器的靈敏度，通過將納米材料與多種信號(hào)放大技術(shù)，如新型納米材料催化、酶催化以及生

物學(xué)放大技術(shù)相結(jié)合是實(shí)現(xiàn)靈敏快速的分析檢測(cè)的常用手段。

圖10 基于HCR信號(hào)放大的電化學(xué)生物傳感器原理圖[27]

Fig.10 Schematic of electrochemical DNA detection.Probes are immobilized on a 3D tetrahedral scaffold,and signal is amplified by HCR from Ref.[27],Copyright 2014 ACS

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Signal amplification strategies applied in electrochemical immunosensors

Han Jing,Zhuo Ying,Yuan Ruo*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

Electrochemical immunosensors are valuable analytical tools as the advantages of rapid response,high sensitivity,good selectivity,simple manipulation and low cost,which combined the merits of electrochemical and immunoassay.Recently,amplified electrochemical biosensors have been received much attention,which achieved by employing nanomaterials,enzymes catalysis and biological amplification technique.The principle of electrochemical immunosensorsare presented,and the signal amplification strategies applied in electrochemical immunosensors are extensively reviewed.

signal amplification;electroanalysis;immunosensors;review

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21275119,21105081)

*通信聯(lián)系人，E-mail:yuanruo@swu.edu.cn