彭哲慧，潘超，孫鵬，馮爾玲，吳軍，朱力，彭清忠，王恒樑

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生物法合成傷寒O-糖蛋白結(jié)合疫苗及其免疫原性評估

彭哲慧1,2，潘超2，孫鵬2，馮爾玲2，吳軍2，朱力2，彭清忠1，王恒樑2

1. 吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南吉首 416000；2. 軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

傷寒由傷寒沙門氏菌(Typhi)引發(fā)，至今在發(fā)展中國家仍是備受關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題。文章通過敲除傷寒菌脂多糖合成途徑中O-抗原連接酶基因，轉(zhuǎn)入含腦膜炎奈瑟球菌()蛋白糖基化途徑中糖基轉(zhuǎn)移酶的表達載體，以及改構(gòu)的重組銅綠假單胞菌()外毒素A(rEPAN29)的表達載體，使細胞內(nèi)能夠誘導合成以傷寒O特異性多糖(O-specific polysaccharides, OPS)為目標抗原、以rEPAN29為載體蛋白的傷寒OPS-rEPAN29糖蛋白復合物，并對純化所得復合物進行了免疫原性評價。ELISA測定血清抗體滴度表明，rEPAN29作為載體蛋白能有效增加糖鏈的免疫原性，糖蛋白比單獨的多糖能誘導產(chǎn)生更好的免疫應答；3次免疫、間隔3周比間隔2周IgG滴度稍有提高；而免疫過量的糖蛋白，抗O-多糖的血清抗體效價并無提升。文章為生物法制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗提供了新思路，理論上也適用于其他革蘭氏陰性菌的疫苗研發(fā)。

結(jié)合疫苗；傷寒沙門氏菌；合成生物學；重組EpA；O-多糖抗原

傷寒是由傷寒沙門氏菌(Typhi, 俗稱傷寒桿菌)引發(fā)的一種急性腸道傳染病，當今在亞非拉的發(fā)展中國家仍是一個備受關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題，近年在我國的發(fā)病率也居傳染病發(fā)病率的前10位[1]。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，傷寒的死亡率約為1%~4%，而4歲及以下患兒死亡率是4歲以上的10倍，倘若患者得不到有效治療，死亡率可增大到10%~20%[2]。針對大多數(shù)病原菌感染引起的疾病，常規(guī)的治療辦法是使用抗生素，但抗生素的長期使用增加了細菌的耐藥性，不僅影響治療效果，還導致超級細菌的產(chǎn)生。接種疫苗不僅可以有效產(chǎn)生特異性免疫，而且也是除改善環(huán)境衛(wèi)生條件以外最有效的預防和控制手段。

O特異性多糖(O-specific polysaccharides, OPS)存在于幾乎所有革蘭氏陰性菌菌體最外層，由多個結(jié)構(gòu)相同的重復糖單位構(gòu)成，與細菌的致病性密切相關(guān)，在細菌信號識別、黏附、免疫逃避等過程中發(fā)揮著重要作用，能夠激起宿主產(chǎn)生免疫反應[3]。O抗原疫苗在免疫原性上的缺陷催生了將O抗原與免疫蛋白載體結(jié)合得到糖蛋白疫苗的想法，這樣既具有很好的靶向性，又具備較強的免疫原性。

腦膜炎奈瑟球菌()糖基轉(zhuǎn)移酶PglL[4]的發(fā)現(xiàn)，及利用細菌中蛋白糖基化修飾過程與脂多糖(Lipid polysaccharide, LPS)合成的相似性[5]，使得O抗原與免疫蛋白載體在細菌中結(jié)合成為可能。而將糖基化系統(tǒng)轉(zhuǎn)入減毒病原菌中，利用生物發(fā)酵技術(shù)簡單、高效地生產(chǎn)多糖結(jié)合疫苗，成為取代工藝繁瑣、均一性難控制的化學法合成法的一種新的生產(chǎn)方式。

本文通過-Red重組技術(shù)敲除傷寒病原菌脂多糖合成途徑中O-抗原連接酶，轉(zhuǎn)入含腦膜炎奈瑟球菌蛋白糖基化途徑中糖基轉(zhuǎn)移酶的表達載體，以及改構(gòu)的重組銅綠假單胞菌()外毒素A(rEPAN29)的表達載體，使其合成以傷寒OPS為目標抗原、以rEPAN29為載體蛋白的傷寒OPS-rEPAN29糖蛋白復合物，并對所得復合物進行了特性研究，為傷寒糖蛋白結(jié)合疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

傷寒沙門氏菌CMCC50096由中國醫(yī)學細菌保藏管理中心提供；大腸桿菌DH5α購自全式金公司；pMD-18T購自TaKaRa公司；質(zhì)粒pETKan(擴增pKD4質(zhì)粒上兩端帶有FRT位點的卡那霉素抗性基因，產(chǎn)物經(jīng)Ⅰ和dⅢ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pET-22b載體連接所得質(zhì)粒，Kmr)、pKD46(溫度敏感型，含有受阿拉伯糖啟動子調(diào)控的、、基因，Ampr)、pCP20(溫度敏感型，編碼能夠識別FRT位點的FLP重組酶，Cmr、Ampr)、pAK(實驗室自行構(gòu)建的低拷貝質(zhì)粒，Kmr)、pMMB66EH- rEPAN29(C端帶有His-標簽、N端帶糖基化識別基序的rEPA表達載體)和pETtac28-pglL(糖基轉(zhuǎn)移酶PglL表達載體)本實驗室保存；SPF級Balb/c雌性小鼠6周齡(13~16 g)，由軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 傷寒50096株基因缺失與回復突變株的構(gòu)建與鑒定

依據(jù)NCBI上傷寒沙門氏菌Ty2全基因組序列(NC_004631.1)中基因(GenBank登錄號為29139723 的第3925131-3926345位)及上下游序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物，引物信息見表１。

以傷寒桿菌50096株基因組為模板，利用λ-Red基因重組系統(tǒng)[6]構(gòu)建突變株50096?waaL，并用包含waaL基因、自身啟動子及上下游調(diào)控序列的質(zhì)粒pAK-waaL電擊轉(zhuǎn)化50096?waaL感受態(tài)，構(gòu)建回復株50096waaLH。用waaL基因內(nèi)部引物(waaL-inP1, P2)、外部引物(waaLotP1, P2)、Kan引物(kanP1, P2)分別以3種菌為模板進行PCR驗證。其中pyrobest DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自博邁德公司；測序由華大公司完成；L-阿拉伯糖、氨芐青霉素、卡那 霉素購自Sigma公司。

表1 引物信息

注：下劃線表示酶切位點。

1.2.2 野生株、缺失株與回復株生長狀態(tài)、表型的測定與部分生化特性比較

取對數(shù)期野生株、缺失株與回復株菌液調(diào)600至0.05，37℃液體LB培養(yǎng)基同步培養(yǎng)測定600值；收集37℃過夜培養(yǎng)菌液1 mL，低鹽PBS洗滌菌體后，沉淀用裂解緩沖液(終濃度為1mol/L pH6.8 Tris-HCl，0.5 mol/L 2-巰基乙醇，2% SDS，10%甘油，100 mg/L溴酚藍)重懸，沸水浴10 min，再用蛋白酶K于60℃處理2 h，各取10 μL上樣，SDS-PAGE電泳后銀染檢測；并使用生物梅里埃公司的API 20E生化鑒定試劑條測定，參照說明書判讀結(jié)果進行生化特性比較。

1.2.3 傷寒O-連接糖基化修飾途徑的構(gòu)建與IPTG誘導表達及檢測

將質(zhì)粒pMMB66EH-rEPAN29和pETtac28-pglL先后電擊轉(zhuǎn)化50096?感受態(tài)細胞，分別用氨芐抗性平板和氨芐及卡那霉素雙抗平板篩選陽性克隆，獲得重組菌50096?/pMMB66EH-rEPAN29和50096?/pETtac28-pglL+pMMB66EH-rEPAN29。液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)重組菌并用IPTG 18℃誘導20 h，按精編分子生物學實驗指南要求收集菌液制備SDS-PAGE樣品，各取10 μL上樣，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色和Western Blot檢測。

1.2.4 傷寒O-多糖蛋白復合物的分離純化

將上述18℃誘導20 h的50096?/pETtac28- pglL+pMMB66EH-rEPAN29菌體加入純水重懸后超聲破菌(超聲3 s暫停5 s，累計超聲時間30 min)，離心收集上清，向該粗提液中加入上樣緩沖液(終濃度為20 mmol/L(pH 7.5)Tris-HCl，0.2 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑)，充分攪拌后離心收集上清，此上清為含有傷寒沙門氏菌OPS修飾的rEPA融合蛋白(OPS-rEPAN29)的粗提液。用Chealating親和層析柱初步純化樣品后，接G25 fine層析柱除鹽，然后用ProteinPak DEAE8HR陰離子交換層析柱進一步純化，最后用Superdex 75 FPLC精純化，得到精純化的OPS-rEPAN29，將此樣品用8% SDS-PAGE電泳分析、考馬斯亮藍染色，評價糖蛋白樣品純度；Western blot分析糖蛋白的特異性；蒽酮-硫酸法測定樣品中的糖含量。

1.2.5 傷寒LPS及OPS的制備

取過夜培養(yǎng)野生株菌液，以熱酚法提取LPS，用乙酸法處理脫去脂質(zhì)A核心得到OPS，銀染驗證后用蒽酮-硫酸法測定樣品中的糖含量。LPS因為帶有脂質(zhì)A核心能被銀染顯色，凝膠上可以看到梯狀條帶，OPS因脫去了脂質(zhì)A核心不能被銀染顯色，故無梯狀條帶。經(jīng)熱酚法提取的LPS和乙酸脫脂質(zhì)A制備的OPS銀染鑒定結(jié)果與預期完全一致(圖片結(jié)果未顯示)。糖定量結(jié)果CLPS=2.1 μg/μL，COPS=1.2 μg/μL，糖濃度均符合免疫要求，可用做動物免疫實驗和ELISA檢測。

1.2.6 免疫樣品的制備

將純化的糖蛋白復合物和O-多糖過濾除菌，分別取2.5 μg和5.0 μg多糖量的糖蛋白和O-多糖樣品用生理鹽水稀釋后與氫氧化鋁佐劑按照15:1的比例混合制成均一溶液，以此為疫苗組免疫樣品。另取等量的氫氧化鋁佐劑用生理鹽水稀釋后做陰性對照組免疫樣品。

1.2.7 動物免疫及效價評估

選取體重13~16 g，6周齡的Balb/c雌性小鼠并隨機分組，每組10只，分別為糖蛋白組，多糖組和Al佐劑組。分別按方案A：0、14、28 d分別經(jīng)皮下注射2.5 μg和5.0 μg兩種糖劑量的免疫樣品，第3次免疫后7 d斷尾采血并分離血清，間接ELISA法測定各組小鼠血清中抗傷寒O-多糖的抗體滴度；方案B：0、21、42 d經(jīng)皮下注射2.5 μg和5.0 μg兩種糖劑量的免疫樣品，第3次免疫后14 d斷尾采血并分離血清，間接ELISA法測定各組小鼠血清中抗傷寒O-多糖的抗體滴度。用提取的傷寒50096株LPS包被酶聯(lián)板，每孔包被10 μg的LPS，其他操作步驟參見精編分子生物學實驗指南。

2 結(jié)果與分析

2.1 傷寒50096野生株、缺失株、回復株的鑒定與生長狀態(tài)、部分生化特性比較

基因內(nèi)部引物(inP1, P2)、外部引物(otP1, P2)、Kan引物(P1, P2)PCR驗證結(jié)果如圖1A所示。若缺失突變株構(gòu)建成功，則用外部引物檢測時，野生株50096的擴增產(chǎn)物大小為2601 bp，50096-?由于缺失了基因，其擴增產(chǎn)物大小為1724 bp，而50096H由于在50096?基礎(chǔ)上導入了包含基因自身啟動子及上下游調(diào)控序列的質(zhì)粒，其擴增產(chǎn)物有兩個片段，即1724 bp和2601 bp片段。并且，當用內(nèi)部引物檢測時，應僅有野生株和回復株能擴增到489 bp的產(chǎn)物；當用Kan引物檢測時，均不能擴增出產(chǎn)物。PCR擴增結(jié)果與預期相符，從分子水平驗證了缺失株構(gòu)建成功。

傷寒50096野生株、缺失株、回復株的LPS銀染檢測結(jié)果如圖1B所示，因缺失突變株敲除了基因，OPS無法結(jié)合到脂質(zhì)A核心上，所以只有缺失株在凝膠中沒有形成長串的梯狀條帶。銀染結(jié)果與預期一致，從表型上驗證了缺失株構(gòu)建成功。

傷寒50096野生株、缺失株、回復株的生長曲線如圖1C所示。3株細菌在生長趨勢和最終濃度上基本一致，說明基因的缺失對菌的生長基本無影響；而API 20E試劑盒檢測結(jié)果表明3種菌的所有指標判定均相同，說明分子上的改構(gòu)對菌株所檢測的這20項生化特性無影響(結(jié)果未顯示)。

缺失株和回復株雖去除了基因和導入了含基因的質(zhì)粒，但菌的生長及理化性質(zhì)基本不受影響。

2.2 傷寒O-連接糖基化修飾途徑IPTG誘導表達的檢測

IPTG誘導糖基化途徑表達后，對重組菌50096-?/pMMB66EH-rEPAN29和50096?/pETtac-28-pglL.pMMB66EH-rEPAN29進行了SDS-PAGE考染和Anti-His Western blot，結(jié)果如圖2所示。在誘導劑作用下，50096?/rEPAN29和50096?/ pglL.rEPAN29由于都含有底物蛋白基因，故均能表達rEPAN29蛋白。而僅在50096?/pglL+rEPAN29中表達的rEPAN29能被糖基化，從而在凝膠中底物蛋白條帶上方會出現(xiàn)含不同數(shù)量重復糖單位的糖蛋白條帶。從圖2A可以看出，凝膠中50096?/pglL. rEPAN29樣品泳道內(nèi)在約70 kDa處有條帶且在70~ 120 kDa處有一串梯狀條帶，50096?/rEPAN29樣品泳道內(nèi)僅在約70 kDa處有條帶，結(jié)果與預期完全符合，表明在傷寒重組菌50096?/pglL+rE-PAN29中IPTG可成功誘導表達外源蛋白并將其糖基化。

圖1 50096野生株、缺失株、回復株的鑒定和比較

A：PCR鑒定結(jié)果；B：LPS銀染鑒定；C：生長曲線測定。

圖2 rEPAN29蛋白糖基化修飾的SDS-PAGE考染與Anti-His Western blot檢測

A：IPTG誘導重組菌蛋白糖基化的檢測(“＋”表示菌內(nèi)含有該基因，“－”表示菌內(nèi)不含該基因)；B：糖蛋白純化后產(chǎn)物的檢測。

2.3 傷寒O-多糖蛋白復合物的分離純化、定量及檢測

分離純化后的OPS-rEPAN29經(jīng)SDS-PAGE考染和Anti-His Western blot檢測，結(jié)果如圖2B所示。分離純化后得到的糖蛋白中基本不含未糖基化的底物蛋白，且糖蛋白均一性較好，大部分分子量在150 kDa以上。糖定量結(jié)果COPS–rEPA=1.1 μg/μL，糖濃度符合免疫要求，該糖蛋白樣品可用來進行動物免疫實驗。

2.4 動物免疫及效價評估

第3次免疫后將小鼠斷尾取血，ELISA檢測小鼠血清中抗傷寒O-多糖的IgG抗體效價，結(jié)果如圖3所示。與載體蛋白相連后，OPS-rEPAN29作為胸腺依賴性抗原，相較于OPS能更好地誘導機體產(chǎn)生免疫反應，而單獨免疫Al佐劑并不引起免疫反應。ELISA結(jié)果顯示，A、B組均只有糖蛋白組小鼠血清有抗體效價，多糖與佐劑組均無效價，即只有糖蛋白組小鼠產(chǎn)生了抗O-多糖的抗體，且兩倍劑量糖蛋白組的小鼠抗體滴度稍低于一倍劑量組。免疫間隔3w與間隔2w相比血清IgG滴度差異不大。

3 討 論

目前，我國應對傷寒廣泛使用的是注射用傷寒Vi莢膜多糖疫苗，它具有較好的穩(wěn)定性、安全性，接種副反應低，成年人中保護率能達到70%左右[7]，且價格便宜，僅需免疫一次，注射7 d后即可產(chǎn)生保護作用，適用于經(jīng)濟落后地區(qū)的疾病大規(guī)模防控。但Vi多糖屬于非胸腺依賴型抗原，免疫過程中無T 細胞參與，產(chǎn)生親和力較低的IgM和IgG2，不能產(chǎn)生免疫記憶，且由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全，在5歲以下兒童中保護效果不理想[8]，在2歲以下的嬰幼兒中不能單獨誘導產(chǎn)生免疫保護[9]。而將傷寒的聚糖與蛋白載體結(jié)合后得到的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，作為胸腺依賴型抗原可引起T細胞依賴性免疫反應，產(chǎn)生抗體IgG1并產(chǎn)生免疫記憶，相比于多糖疫苗提供了更好的免疫保護性和保護時間，且能在5歲以下的嬰幼兒中誘導產(chǎn)生免疫保護，填補了多糖疫苗在這一方向上的盲區(qū)[10]。

圖3 各組小鼠抗傷寒O多糖的抗體滴度

A：免疫間隔2 w；B：免疫間隔3 w。

本文介紹了一種利用合成生物學技術(shù)制備多糖結(jié)合疫苗的新方法，從免疫效價實驗的結(jié)果來看：傷寒O-多糖不能單獨激發(fā)免疫反應產(chǎn)生抗體，這可能是因為O-多糖在免疫反應中被當成半抗原，不能引起有效免疫反應；當OPS連接上底物蛋白rEPAN29形成糖蛋白后，免疫效果明顯地提高，但糖蛋白整體的免疫原性依舊受到載體蛋白種類、多糖/蛋白摩爾比以及糖鏈長度等的制約。在研發(fā)多糖結(jié)合疫苗的過程中，為了有效地激發(fā)免疫反應，載體蛋白大多使用的是棒狀桿菌和梭菌屬的無活性的毒素[11]，如白喉毒素(Diphtheria toxin, DT)、白喉毒素(Diph-theria toxin)無毒突變體CRM197(Cross-reacting materials 197, CRM197)、破傷風毒素(Tetanus toxin, TT)、破傷風毒素C片段(Tetanus toxin fragment C, TTC)、霍亂毒素B亞單位(Cholera toxin B subunit, CTB)、銅綠假單胞菌外毒素蛋白A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A protein, EPA)等。最理想的載體蛋白應當既具有一定的免疫原性，作為載體蛋白能更好的激發(fā)機體產(chǎn)生對抗病原菌的特異性抗體，又不至于因為毒性或免疫原性太強而對機體產(chǎn)生毒副作用，或是影響糖鏈部分的免疫效果。例如EPA能很好地提高免疫效果，又沒有明顯的不良反應[12,13]，現(xiàn)已成功商品化，用于糖蛋白疫苗的研發(fā)[14]。與此同時，針對不同病原菌的疫苗研發(fā)還應考慮蛋白的特性，如多價CRM197綴合物引起旁觀免疫干預(Bystander interference)的風險較高，特別是影響Hib疫苗和乙型肝炎疫苗的免疫應答[11]。此外，多糖/蛋白摩爾比過低無法產(chǎn)生有效的特異性免疫應答，而過高則有可能阻礙蛋白酶對載體蛋白的降解[15]。糖鏈的長度對糖蛋白疫苗的免疫原性也起著至關(guān)重要的作用[16]，針對不同細菌的糖蛋白疫苗，對糖鏈長度的要求也不同。對于生物法合成糖蛋白疫苗來說，在載體蛋白的選擇方面，雖然很多毒素都能夠引起強烈的免疫反應，但因缺少糖基化位點而不能直接作為載體蛋白使用，需利用分子生物學方法改構(gòu)，從而引入相應的糖基化位點。然而，胞內(nèi)合成的糖蛋白糖鏈長度與糖基化位點個數(shù)與位置是相對固定的，雖然多糖/蛋白摩爾比能通過載體蛋白中插入的糖基化位點個數(shù)來控制，但是否所有插入的糖基化位點都能夠成功的糖基化還需進一步評估。與此同時，糖蛋白結(jié)構(gòu)的復雜程度和糖鏈插入位置對整個糖蛋白免疫原性是否有提高也應當受到關(guān)注。

從免疫方案來看：免疫每兩針之間間隔3 w的免疫效果比間隔2 w有輕微提高，可能是因為動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體在3 w的免疫間隔時間后，已經(jīng)消失殆盡，而初次應答后的記憶細胞依舊存在，能更好地引起體內(nèi)抗體的激增。另外，二倍劑量的糖蛋白免疫并沒有提高抗體滴度，這可能是由于免疫飽和性的存在，過量的抗原也無法被捕捉與呈遞，但確切的原因還不清楚。

若將我國使用的傷寒Vi多糖與載體蛋白結(jié)合，相較于Vi多糖疫苗能產(chǎn)生更好的免疫保護，將有望取代現(xiàn)有疫苗。但由于Vi多糖與脂多糖的合成途徑不相同，不能直接使用PglL識別和轉(zhuǎn)移Vi多糖鏈至免疫原性蛋白上，如何改進實驗方法，利用生物法制備Vi多糖-蛋白疫苗是我們下一步研究的重點方向。

綜上所述，雖然傷寒在低齡兒童中發(fā)病率相對不集中，但糖蛋白結(jié)合疫苗具有更好的免疫原性和免疫保護性，將使其成為傷寒疫苗的發(fā)展方向，生物法合成糖蛋白結(jié)合疫苗的簡單高效性也決定了它將成為化學法之外的又一新路徑。由于生物法合成糖蛋白結(jié)合疫苗自身的特點，該方法依舊需要更多的探索以及大量的動物及臨床實驗數(shù)據(jù)加以擴展。

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(責任編委: 劉鋼)

Preparation and immunogenicity-evaluation of typhoid O-specific polysaccharides bio-conjugate vaccines

Zhehui Peng1, 2, Chao Pan2, Peng Sun2, Erling Feng2, Jun Wu2, Li Zhu2, Qingzhong Peng1, Hengliang Wang2

Typhoid fever caused byTyphi is still a major public health problem in developing countries. In this study, we constructed a genetically modifiedTyphi strain expressing O-specific polysaccharides (OPS) antigen conjugated to a carrier, recombinant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A(rEPAN29). The conjugates (OPS-rEPAN29) were further purified and evaluated for their immunogenicity. The results of ELISA showed that the conjugates evoked higher titers of IgG than OPS, suggesting that rEPAN29increased immunogenicity of OPS significantly as a carrier. Moreover, three injections with 3-week interval evoked slightly higher titers of IgG than three injections with 2-week interval. However, injection of excess conjugates could not evoke higher titers of IgG against lipid polysaccharide (LPS). In summary, our study provides a new strategy for preparing polysaccharides-protein conjugate vaccines as well as similar bio-conjugate vaccines of other Gram-negative pathogens.

conjugate vaccine;; synthetic biology; rEPA; O-polysaccharide antigen

2015-01-25;

2015-03-13

國家自然科學基金項目(編號：81373316)資助

彭哲慧，碩士研究生，專業(yè)方向：病原微生物。E-mail: michel121@126.com

彭清忠，教授，研究方向：微生物制藥。E-mail: qzpengjsu@163.com；王恒樑，研究員，研究方向：病原微生物。E-mail: wanghl@bmi.ac.cn

10.16288/j.yczz.15-001

2015-4-29 10:55:58

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150429.1056.002.html