殷利眷，胡斯奇，郭斐

?

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在病毒感染疾病治療中的應(yīng)用

殷利眷，胡斯奇，郭斐

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，衛(wèi)生部病原系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)是基于細(xì)菌或古細(xì)菌CRISPR介導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來，由一段RNA通過堿基互補(bǔ)配對識(shí)別DNA，指導(dǎo)Cas9核酸酶切割識(shí)別的雙鏈DNA，誘發(fā)同源重組或非同源末端鏈接，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)在目的DNA上進(jìn)行編輯。病毒通過特異的受體侵染細(xì)胞，其基因組在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程完成其生活周期，某些DNA病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組會(huì)整合到宿主基因組中。基因治療是病毒感染疾病治療的新趨勢。因此，基因編輯技術(shù)在持續(xù)感染的病毒或潛伏感染病毒疾病治療中具有重大的潛在意義。文章主要從CRISPR-Cas9作用機(jī)制以及在病毒感染疾病治療中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了綜述。

CRISPR；同源重組；非同源末端鏈接；基因編輯；病毒

病毒感染是危害人類健康的主要威脅之一，與人類密切相關(guān)的有呼吸道病毒、肝炎病毒和艾滋病病毒等。目前應(yīng)對病毒感染的方法主要依賴疫苗防御和藥物治療。但是，對于很多病毒感染性疾病現(xiàn)在還沒有完全有效或徹底的治療方法，如艾滋病等。隨著全基因組測序技術(shù)的成熟和基因功能的研究，通過基因編輯進(jìn)行抗病毒治療成為可能。最初的基因編輯方法是利用玻璃管注射DNA到細(xì)胞核或者電轉(zhuǎn)DNA進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞核中的DNA通過同源重組的方式插入到細(xì)胞基因組中[1]，從而達(dá)到基因編輯的目的。但是，利用該方法將外源DNA片段準(zhǔn)確插入到目的位置的效率很低。之后又出現(xiàn)了鋅指核酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)核酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)，這兩種核酸酶都是由經(jīng)過設(shè)計(jì)的、序列特異性的DNA結(jié)合元件和非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域結(jié)合而成的嵌合體[2, 3]，其作用機(jī)制分別是鋅指蛋白或者轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)蛋白衍生構(gòu)建的DNA識(shí)別蛋白模塊和具有雙鏈DNA切割活性的Ⅰ核酸酶偶聯(lián)，特異的切割目標(biāo)雙鏈DNA，產(chǎn)生雙鏈斷裂DNA，然后激活細(xì)胞內(nèi)的同源重組(Homology-directed repair, HDR)或者非同源末端鏈接(Nonhomologous end joining, NHEJ)[4]，利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制對DNA進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，大大提高了在目的區(qū)域發(fā)生刪除、錯(cuò)配或插入突變的機(jī)率。兩者分別通過多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組合或者氨基酸重復(fù)序列組合識(shí)別不同的DNA序列，但這種方式識(shí)別靶向位點(diǎn)非常有限，并且識(shí)別模塊的構(gòu)建也非常復(fù)雜。2013年，出現(xiàn)了一種全新的基因編輯技術(shù)——clustered regularly interspacedshort palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9(Cas9)，CRISPR-Cas9作用方式不同于ZFN和TELEN，此系統(tǒng)通過RNA與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，指導(dǎo)Cas9核酸酶切割互補(bǔ)的雙鏈DNA[5]。這一新系統(tǒng)具有制備簡單、成本低、作用高效等優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)后獲得了快速發(fā)展。本文主要綜述了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制和其在病毒感染疾病治療中的應(yīng)用。

1 CRISPR-Cas9作用機(jī)制

CRISPR即成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是基因組中一個(gè)含有多個(gè)短重復(fù)序列的位點(diǎn)[6]。Yoshizumi Ishino等[7]在研究大腸桿菌基因調(diào)控堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)換時(shí)發(fā)現(xiàn)了這種重復(fù)序列-間隔序列-重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)。2005年，3個(gè)研究團(tuán)隊(duì)都報(bào)道了CRISPR的間隔序列與噬菌體基因組和質(zhì)粒高度同源，猜想CRISPRs可能是細(xì)菌或古細(xì)菌的一種新的免疫系統(tǒng)[8~10]。Barrangou等[11]將嗜熱鏈球菌與不同的噬菌體共培養(yǎng)，篩選具有噬菌體抗性的菌株，通過DNA測序發(fā)現(xiàn)CRISPR座位中有了新的間隔序列，該間隔序列來自侵染的噬菌體，并且證實(shí)了CRISPR和其相關(guān)的基因賦予了細(xì)菌對噬菌體的抗性，通過插入或刪除靶向噬菌體的間隔序列可增強(qiáng)或者削弱細(xì)菌的噬菌體抗性。總之，CRISPR- Cas9是細(xì)菌的一種“獲得性免疫系統(tǒng)”。

最初人們假想CRISPR介導(dǎo)的獲得性免疫機(jī)制類似于RNA干擾，而Barrangou等[11]研究發(fā)現(xiàn)CRISPR介導(dǎo)的噬菌體抗性需要基因。之后，Emmanuelle Charpentier實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)CRISPR介導(dǎo)的免疫需要兩個(gè)RNA，分別是反式激活RNA(trans- activating crRNA, tracrRNA)和CRISPR RNA。tracrRNA與CRISPR RNA互補(bǔ)配對，激活RNAase Ⅲ和CsnⅠ，對CRISPR RNA進(jìn)行剪切，使之成為成熟的crRNA[12]。2006年，Jinek等[13]從釀膿鏈球菌()中分離純化Cas9蛋白，發(fā)現(xiàn)Cas9介導(dǎo)的雙鏈DNA的斷裂也依賴于crRNA-guide和tracrRNA。Garneau等[14]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌 CRISPR-Cas系統(tǒng)通過特異的間隔序列介導(dǎo)，對特異的靶向序列編輯，最終將外源入侵質(zhì)?；蛘呤删wDNA進(jìn)行平末端切割。

CRISPR-Cas9介導(dǎo)的細(xì)菌獲得性免疫具體機(jī)制如圖1所示。

當(dāng)外源噬菌體或質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)菌后，細(xì)菌通過識(shí) 別特異的PAM(Protospacer adjacent motif)序列，將 外源DNA 加工成大小合適的間隔序列，插入到 CRISPR 序列中。CRISPR 位點(diǎn)表達(dá)反式激活 crRNA (tracrRNA)，與重復(fù)區(qū)域的pre-crRNA 配對，在Cns Ⅰ和RNase Ⅲ作用下形成成熟的crRNA。Cas9 蛋 白有識(shí)別crRNA 和具有核酸酶功能的環(huán)狀區(qū)域，核 酸酶區(qū)域包含HNH 核酸酶和RuvC 樣核酸酶結(jié)構(gòu) 域，分別切割互補(bǔ)和不互補(bǔ)的目標(biāo)DNA 鏈。Cas9 識(shí)別目標(biāo)基因中的PAM 序列，crRNA 識(shí)別位于 PAM 5′端互補(bǔ)的20 bp DNA 序列，繼而穩(wěn)定Cas9 和基因組的結(jié)合，導(dǎo)致靶位點(diǎn)的切割，基因組發(fā)生發(fā)生雙鏈斷裂的DNA 利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制(同 源重組/非同源末端鏈接)對DNA 進(jìn)行遺傳學(xué)修飾。

圖1 CRISPR-Cas9干擾外源DNA入侵示意圖

2013年2月，在Jinek[13]和Gasiunas[15]報(bào)道CRISPR-Cas9可以分離dsDNA之后的6個(gè)月左右，Cong等[5]和Mali等[16]分別在上發(fā)表文章證明RNA指導(dǎo)的Cas9核酶能夠?qū)θ说摹⒒蚝托∈蠡蜻M(jìn)行切割，被編輯的基因發(fā)生同源重組或非同源末端鏈接；同時(shí)，Jinek等[17]和Cho等[18]分別在和上發(fā)表文章，證明RNA指導(dǎo)的Cas9能夠編輯人網(wǎng)格蛋白輕鏈(Human clathrin light chain,)基因和等基因。這是首次將CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為真核細(xì)胞的基因組編輯工具。

2 CRISPR-Cas9在病毒感染疾病治療中的應(yīng)用

在發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以編輯哺乳動(dòng)物基因組之后，該技術(shù)得到了迅速的推廣應(yīng)用，包括動(dòng)物模型構(gòu)建、基因功能研究、腫瘤基因敲除等[19,20]。在病毒感染疾病治療方面，ZFN和TALEN技術(shù)曾被廣泛應(yīng)用，但介于兩者構(gòu)建復(fù)雜、編輯效率低、靶位點(diǎn)局限性等特性，新的基因編輯技術(shù)CRISPR- Cas9引起了大家的關(guān)注并開始探索該技術(shù)在病毒疾病治療中的應(yīng)用。

2.1 編輯受體基因序列阻止病毒入侵

病毒表面蛋白與細(xì)胞表面受體蛋白相互作用是病毒侵入細(xì)胞的必要環(huán)節(jié)。CCR5蛋白是HIV入侵淋巴細(xì)胞的關(guān)鍵輔助受體。研究發(fā)現(xiàn)，歐洲少部分人群基因缺失32 bp堿基，這部分人群不易被HIV感染。另外，目前唯一得到徹底治愈的HIV患者即“柏林病人”，其同時(shí)患有白血病，通過化療破壞其自身骨髓后，植入具有Δ32突變型的骨髓，體內(nèi)才檢測不到HIV病毒，而且不需要服用藥物。已有研究利用鋅指酶技術(shù)敲除艾滋病人血液T細(xì)胞或者CD4造血干細(xì)胞中的艾滋病毒受體CCR5，能有效降低病毒水平，提高CD4細(xì)胞存活率，并且鋅指酶制劑已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段[21~23]。由此可見，利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建Δ32 CD4 T細(xì)胞對阻礙HIV感染或復(fù)制具有重要作用。Lin等[24]利用CRISPR-Cas9和轉(zhuǎn)座技術(shù)完整地缺失了誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的32 bp序列，HIV-1感染突變的細(xì)胞和正常細(xì)胞，感染1 d去除病毒，加入CD4細(xì)胞維持HIV-1復(fù)制，16 d后發(fā)現(xiàn)在正常的iPSC中檢測到HIV，但是突變的細(xì)胞中沒有檢測到HIV。這說明CRISPR-Cas9編輯的Δ32細(xì)胞可以有效阻礙HIV侵入，更重要的是，CRISPR-Cas9編輯細(xì)胞受體是治療病毒感染疾病的有效方案之一。

2.2 清除潛伏感染的HIV-1基因組

HIV-1基因組由兩條正鏈RNA組成，感染淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞后，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成雙鏈DNA，進(jìn)入細(xì)胞核，整合酶介導(dǎo)雙鏈DNA整合到細(xì)胞染色體中。部分整合的DNA處于轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)，潛藏于細(xì)胞中。目前的藥物治療只能在一定程度上抑制HIV復(fù)制，但不能徹底清除HIV；另外，藥物治療并不能針對潛藏的HIV。因此，基因編輯是一個(gè)有望徹底治愈艾滋病的途徑。Ebina等[25]通過設(shè)計(jì)針對LTR的gRNA，與hCas9共轉(zhuǎn)染整合有HIV-1骨架(含有GFP標(biāo)簽)的Jurkat細(xì)胞，經(jīng)過3輪轉(zhuǎn)染，流式分析GFP陽性細(xì)胞比例由97.8%下降到35.5%。通過設(shè)計(jì)引物進(jìn)行LTR擴(kuò)增及測序，檢測到插入或缺失突變，發(fā)生突變的比例達(dá)到90%，成功限制了原病毒的激活和表達(dá)。Hu等[26]構(gòu)建了靶向HIV-1 LTR U3啟動(dòng)子的gRNA-Cas9質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染整合有單輪次感染的HIV基因的小膠質(zhì)細(xì)胞和T4細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ca9能夠消除整合的病毒基因組。以上結(jié)果表明該技術(shù)具有徹底清除潛伏的HIV基因組的可能性。

2.3 清除皰疹病毒基因組

皰疹病毒家族在人群中廣泛傳播，大于90%的人群至少感染一種皰疹病毒。Epstein-Barr 病毒(EBV)是皰疹病毒家族成員之一，為雙鏈DNA病毒，感染單核細(xì)胞，是一種腫瘤病毒。目前沒有有效的疫苗和治療藥物。EBV感染細(xì)胞后，DNA進(jìn)入細(xì)胞核，以環(huán)化的狀態(tài)作為附加體滯留在細(xì)胞核。Wang等[27]采用EBV慢性感染的細(xì)胞——Raji細(xì)胞，針對EBV基因組6個(gè)不同的功能位點(diǎn)設(shè)計(jì)了7個(gè)gRNA，利用核轉(zhuǎn)染方式將靶向EBV基因組的gRNA-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)EBV基因組的特異位點(diǎn)被有效編輯；隨培養(yǎng)時(shí)間計(jì)算存活的細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Cas9-gRNA的細(xì)胞增值效率較對照組降低，即降低了EBV致瘤效應(yīng)，Annexin V 染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜完整，但是磷脂酰絲氨酸外翻，說明Cas9-gRNA將EBV基因組擾亂后細(xì)胞恢復(fù)了正常的凋亡途徑；數(shù)字PCR檢測Cas9-gRNA處理后的細(xì)胞中EBV基因組拷貝數(shù)，以Cas9未處理的細(xì)胞為對照，發(fā)現(xiàn)25%的細(xì)胞檢測不到EBV基因組，認(rèn)為EBV基因組被徹底清除，50%的細(xì)胞中EBV基因拷貝數(shù)都有不同程度的降低。Bi等[28]構(gòu)建了靶向單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)胸腺激酶基因的gRNA，分離位點(diǎn)處于限制性酶WⅠ中，在Cas9-gRNA存在下，WⅠ的酶活性顯著降低，生長曲線發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制能力降低，病毒滴度減少，在靶位點(diǎn)檢測到錯(cuò)配和缺失突變。由此可見，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)有希望用于治療慢性病毒感染疾病。

2.4 編輯人乳頭瘤病毒基因組

人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一種DNA病毒，屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其16、18、31、33和45亞型屬高風(fēng)險(xiǎn)HPV，約90%的宮頸癌與之有關(guān)[29]。在這類癌細(xì)胞中，HPV DNA整合到宿主基因組中，并高表達(dá)病毒原癌基因和。誘導(dǎo)細(xì)胞腫瘤抑制因子p53降解，干擾視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma, Rb)蛋白穩(wěn)定性，從而干擾細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老。Zhen等[30]構(gòu)建了靶向和的gRNA，將Cas9質(zhì)粒和gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞提取RNA，qPCR檢測發(fā)現(xiàn)、表達(dá)量下降比例超過90%；MTT比色分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性顯著降低；將轉(zhuǎn)染有Cas9和gRNA的SiHa細(xì)胞通過頸背注射移植到小鼠，單轉(zhuǎn)染Cas9作為對照，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積和重量顯著低于對照組。Edward等[31]設(shè)計(jì)了針對HPV-18和讀碼框的gRNA，構(gòu)建到含有Cas9的px330載體， 293T細(xì)胞含有HPV-18和的DNA質(zhì)粒， HIV基因以及為報(bào)告基因；Cas9轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，3 d后檢測GFP表達(dá)比例，發(fā)現(xiàn)GFP陽性比例較對照組顯著下降；用HeLa細(xì)胞進(jìn)行Surveyor實(shí)驗(yàn)分析并進(jìn)行測序，檢測到和基因發(fā)生缺失或插入突變Western blot檢測rev蛋白表達(dá)顯著降低，并且發(fā)現(xiàn)靶向基因后，p53蛋白含量升高，靶向基因后，Rb蛋白含量升高。因此，Cas9編輯技術(shù)有望應(yīng)用于乳頭瘤病毒引發(fā)的宮頸癌治療。

2.5 編輯乙型肝炎病毒基因組

Hepatitis B 病毒(HBV)是一種DNA病毒，屬于嗜肝病毒科?；蚪M進(jìn)入細(xì)胞核后形成超螺旋DNA，是抗病毒治療的主要障礙之一。Lin等[32]體外將HBV表達(dá)質(zhì)粒和靶向HBV基因組的gRNA-Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)HBV核心蛋白和表面蛋白的表達(dá)量明顯降低；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將HBV表達(dá)質(zhì)粒和靶向HBV基因組的gRNA-Cas9質(zhì)粒共注射到HBV肝炎耐受小鼠的尾靜脈，檢測發(fā)現(xiàn)小鼠血清表面抗原水平較對照組明顯降低。雖然該研究缺乏gRNA-Cas9直接靶向HBV慢性感染小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但是也說明CRISPR-Cas9編輯技術(shù)對持續(xù)HBV感染疾病有潛在的治療意義。

3 CRIPR-Cas9技術(shù)存在的脫靶問題和優(yōu)化策略

Cas9核酸酶可以在sgRNA指導(dǎo)下結(jié)合任何含有PAM序列的DNA，sgRNA中20個(gè)核酸序列通過堿基互補(bǔ)配對靶向特定DNA，穩(wěn)定Cas9與目的DNA的結(jié)合?？梢酝ㄟ^改變sgRNA序列，使之結(jié)合到任意位點(diǎn)，sgRNA與目標(biāo)DNA互補(bǔ)配對確保Cas9作用位點(diǎn)特異性。但是，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)根據(jù)堿基錯(cuò)配數(shù)目、位置以及堿基特性差異，Cas9容許gRNA 20nt序列與靶DNA之間存在不同數(shù)目的錯(cuò)配[5, 33, 34]。引起的脫靶問題，限制Cas9編輯技術(shù)在臨床中的應(yīng)用。為降低Cas9脫靶效應(yīng)，提高特異性，Ran等[35]利用只能切割互補(bǔ)DNA單鏈的部分核酸酶功能缺陷的Cas9(D10A)，在靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條gRNA，分別與正負(fù)鏈DNA互補(bǔ)配對，使得突變型Cas9分別切割正負(fù)鏈DNA，引發(fā)特定位點(diǎn)的雙鏈斷裂。該方案提高了CRISPR-Cas9編輯的特異性，并且保持其核酸酶活性。Shen等[36]利用D10A或者H840A突變的Cas9核酶編輯X相關(guān)的雄激素受體基因()，測序和T7EN實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變的Cas9能有效編輯，并未檢測到脫靶現(xiàn)象。Tsai等[37]將核酸酶活性缺失的dCas9與DNA非特異性限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ融合表達(dá)，構(gòu)建了CRISPR RNA指導(dǎo)的Ⅰ編輯技術(shù)，Ⅰ編輯位點(diǎn)的選擇依賴于兩條gRNA，與單個(gè)gRNA指導(dǎo)的Cas9相比，增加了靶位點(diǎn)的特異性。

4 結(jié)語與展望

由細(xì)菌免疫系統(tǒng)衍生的新的基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9與ZFN和TALEN相比較，具有設(shè)計(jì)簡單、應(yīng)用靈活、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在敲除細(xì)胞表面受體和切割病毒基因組、抑制病毒復(fù)制中有顯著效果。但是，在未來臨床應(yīng)用以及基因治療中還有很長的一段路要走，還存在一些困難，比如提高Cas9編輯的準(zhǔn)確性，避免脫靶現(xiàn)象出現(xiàn)；高效的導(dǎo)入細(xì)胞方法以及確保細(xì)胞靶向性等等。研究人員需要不斷優(yōu)化系統(tǒng)，通過改造CIRSPR編輯方法，如CRISPR-Cas9缺刻酶[35]或者CRISPR-RNA指導(dǎo)I酶[37]，降低脫靶效應(yīng)；采用腺病毒載體提高Cas9基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等[38]。CRISPR-Cas9作為新的基因編輯技術(shù)，在慢性病毒感染或潛伏病毒感染疾病中具有巨大的潛在科學(xué)研究和臨床治療意義。

[1] Capecchi MR. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century., 2005, 6(6): 507–512.

[2] Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD. Genome editing with engineered zinc finger nucleases., 2010, 11(9): 636–646.

[3] Miller JC, Tan SY, Qiao GJ, Barlow KA, Wang JB, Xia DF, Meng XD, Paschon DE, Leung E, Hindley SJ, Dulay GP, Hua KL, Ankoudinova I, Cost GJ, Urnov FD, Zhang HS, Holmes MC, Zhang L, Gregory PD, Rebar EJ. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing., 2011, 29(2): 143–148.

[4] Wyman C, Kanaar R. DNA double-strand break repair: all's well that ends well., 2006, 40: 363–383.

[5] Cong L, Ran FA, Cox D, Lin SL, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu XB, Jiang WY, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems., 2013, 339(6121): 819–823.

[6] Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P. CRISPR—a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea., 2008, 6(3): 181–186.

[7] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in, and identification of the gene product., 1987, 169(12): 5429–5433.

[8] Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin., 2005, 151(8): 2551–2561.

[9] Mojica FJM, Díez-Villase?or C, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements., 2005, 60(2): 174–182.

[10] Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements inacquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies., 2005, 151(3): 653–663.

[11] Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes., 2007, 315(5819): 1709–1712.

[12] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao YJ, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E. CRISPR RNA maturation by-encoded small RNA and host factor RNase III., 2011, 471(7340): 602–607.

[13] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity., 2012, 337(6096): 816–821.

[14] Garneau JE, Dupuis Mè, Villion M, Romero DA, Barrangou R, Boyaval P, Fremaux C, Horvath P, Magadán AH, Moineau S. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA., 2010, 468(7320): 67–71.

[15] Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria., 2012, 109(39): E2579–E2586.

[16] Mali P, Yang LH, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9., 2013, 339(6121): 823–826.

[17] Jinek M, East A, Cheng A, Lin S, Ma EB, Doudna J. RNA-programmed genome editing in human cells., 2013, 2: e00471.

[18] Cho SW, Kim S, Kim JM, Kim JS. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease., 2013, 31(3): 230–232.

[19] Ota S, Kawahara A. Zebrafish: a model vertebrate suitable for the analysis of human genetic disorders., 2014, 54(1): 8–11.

[20] Xue W, Chen SD, Yin H, Tammela T, Papagiannakopoulos T, Joshi NS, Cai WX, Yang GL, Bronson R, Crowley DG, Zhang F, Anderson DG, Sharp PA, Jacks T. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver., 2014, 514(7522): 380–384.

[21] Holt N, Wang JB, Kim K, Friedman G, Wang XC, Taupin V, Crooks GM, Kohn DB, Gregory PD, Holmes MC, Cannon PM. Human hematopoietic stem/progenitor cells modified by zinc-finger nucleases targeted tocontrol HIV-1., 2010, 28(8): 839–847.

[22] Perez EE, Wang JB, Miller JC, Jouvenot Y, Kim KA, Liu O, Wang N, Lee G, Bartsevich VV, Lee YL, Guschin DY, Rupniewski I, Waite AJ, Carpenito C, Carroll RG, Orange JS, Urnov FD, Rebar EJ, Ando D, Gregory PD, Riley JL, Holmes MC, June CH. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+T cells by genome editing using zinc-finger nucleases., 2008, 26(7): 808–816.

[23] Tebas P, Stein D, Tang WW, Frank I, Wang SQ, Lee G, Spratt SK, Surosky RT, Giedlin MA, Nichol G, Holmes MC, Gregory PD, Ando DG, Kalos M, Collman RG, Binder-Scholl G, Plesa G. Gene editing ofin autologous CD4 T cells of persons infected with HIV., 2014, 370(10): 901–910.

[24] Ye L, Wang JM, Beyer AI, Teque F, Cradick TJ, Qi ZX, Chang JC, Bao G, Muench MO, Yu JW, Levy JA, Kan YW. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection., 2014, 111(26): 9591–9596.

[25] Ebina H, Misawa N, Kanemura Y, Koyanagi Y. Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus., 2013, 3: 2510.

[26] Hu WH, Kaminski R, Yang F, Zhang YG, Cosentino L, Li F, Luo B, Alvarez-Carbonell D, Garcia-Mesa Y, Karn J, Mo XM, Khalilli K. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection., 2014, 111(31): 11461–11466.

[27] Wang JB, Quake SR. RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection., 2014, 111(36): 13157–13162.

[28] Bi YW, Sun L, Gao DD, Ding C, Li ZH, Li YD, Cun W, Li QH. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases., 2014, 10(5): e1004090.

[29] De Villiers EM. Heterogeneity of the human papillomavirus group., 1989, 63(11): 4898–4903.

[30] Zhen S, Hua L, Takahashi Y, Narita S, Liu YH, Li Y.andgrowth suppression of human papillomavirus 16-positive cervical cancer cells by CRISPR/Cas9., 2014, 450(4): 1422–1426.

[31] Kennedy EM, Kornepati AVR, Goldstein M, Bogerd HP, Poling BC, Whisnant AW, Kastan MB, Cullen BR. Inactivation of the human papillomavirus E6 or E7 gene in cervical carcinoma cells by using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided endonuclease., 2014, 88(20): 11965– 11972.

[32] Lin SR, Yang HC, Kuo YT, Liu CJ, Yang TY, Sung KC, Lin YY, Wang HY, Wang CC, Shen YC, Wu FY, Kao JH, Chen DS, Chen PJ. The CRISPR/Cas9 system facilitates clearance of the intrahepatic HBV templates., 2014, 3(8): e186.

[33] Fu YF, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells., 2013, 31(9): 822–826.

[34] Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, Ran FA, Konermann S, Agarwala V, Li YQ, Fine EJ, Wu XB, Shalem O, Cradick TJ, Marraffini LA, Bao G, Zhang F. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases., 2013, 31(9): 827–832.

[35] Ran FA, Hsu PD, Lin CY, Gootenberg JS, Konemann S, Trevino AE, Scott DA, Inoue A, Matoba S, Zhang Y, Zhang F. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity., 2013, 154(6): 1380–1389.

[36] Shen B, Zhang WS, Zhang J, Zhou JK, Wang JY, Chen L, Wang L, Hodgkins A, Iyer V, Huang XX, Skarnes WC. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects., 2014, 11(4): 399–402.

[37] Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, Goodwin MJ, Aryee MJ, Joung JK. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing., 2014, 32(6): 569–576.

[38] Maggio I, Holkers M, Liu J, Janssen JM, Chen XY, Goncalves MA. Adenoviral vector delivery of RNA-guided CRISPR/Cas9 nuclease complexes induces targeted mutagenesis in a diverse array of human cells., 2014, 4: 5105.

(責(zé)任編委: 謝建平)

The application of CRISPR-Cas9 gene editing technology in viral infection diseases

Lijuan Yin, Siqi Hu, Fei Guo

The RNA-guided Cas9 nuclease from microbial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) adaptive immune system has been used to facilitate efficient genome engineering in eukaryotic cells. The specific targeted genome is recognized and cut by gRNA-directed CRISPR/Cas9 complex, specifically by the endonuclease Cas9. The targeted gene locus could be repaired either by homology-directed repair or nonhomologous end joining, thus achieving a desired editing outcome. Viruses infect cells through specific receptors, and then the viral genome is transcribed, replicated and translated to complete its life cycle. As a result, some DNA virus and retrovirus genomes are integrated into the cellular genome. Gene therapy is a new trend to treat viral infected diseases. Given its designable sequence-specific editing of the targeted genome, CRISPR/Cas9 has tremendous potential in treating persistent and latent viral infections. In this review, we summarize the mechanism and progresses of CRISPR/Cas9, and also highlight its therapeutic application in infectious diseases.

CRISPR; homology-directed repair; nonhomologous end joining; gene editing; virus

2014-12-24;

2015-01-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81371808)資助

殷利眷，碩士研究生，專業(yè)方向：病毒與宿主限制因子相互作用。E-mail: yljzhx@sina.com

郭斐，博士，研究員，研究方向：分子病毒學(xué)。E-mail: guoafei@ipbcams.ac.cn

10.16288/j.yczz.14-460

2015-3-26 10:09:33

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150326.1009.003.html