賀銀麗，郭珣，趙顯莉，裴彥宇，孫井江，高虹

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

過氧化物酶體增殖激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα)是脂肪酸氧化酶基因的主要轉錄調控子，PPARα 激動劑臨床上主要用于高甘油三酯血癥的治療。氯貝丁酯(clofibrate)屬于貝特類藥物，是PPARα 激動劑，通過調節(jié)脂肪β-氧化降低血脂［1］，在臨床上主要用于以甘油三酯增高為主的高脂血癥，但因其毒副作用較大，現(xiàn)臨床已淘汰此藥物。本實驗所使用的PPARα 轉基因小鼠體內高表達人PPARα 基因，我們將其應用在PPARα 激動劑氯貝丁酯的毒理學評價中，期望能更加敏感的發(fā)現(xiàn)其毒性，為PPARα 激動劑類藥物的臨床前毒理學評價尋找更加快速、靈敏、準確的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級8 周齡C57BL/6J 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2012-0001】。清潔級PPARα 轉基因小鼠，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所遺傳中心構建【SCXK(京)2009-007】，遺傳背景為C57BL/6J 小鼠，在本實驗室繁育【SYXK(京)20130014】。

1.2 主要試劑及儀器

實驗藥品:氯貝丁酯(百靈威科技有限公司)，羧甲基纖維素鈉(廣東汕頭市西隴化工廠有限公司);主要儀器:日立7100 生化自動分析儀。

1.3 動物分組及給藥方法

8 周齡PPARα 轉基因小鼠(Tg)和C57BL/6J 野生小鼠(WT)各28 只，每組雌雄各半，體重18 ～22 g，分組及給藥劑量見表1。溶媒對照為1%甲基纖維素鈉，灌胃給藥28d，每只動物灌胃體積為0.2 mL/10 g 體重。各組小鼠在同等的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

表1 實驗小鼠分組及給藥方法Tab.1 The medication method and grouping of laboratory mice

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 大體觀察與體重測定

每天觀察一次，觀察指標包括小鼠外觀和行為(包括小鼠的皮膚毛發(fā)，眼和黏膜的變化，呼吸，中樞神經系統(tǒng)，四肢活動及其他表現(xiàn))、排泄物等。每周測定小鼠體重，計算每周的體重增長率。

1.4.2 血生化指標測定

末次給藥禁食不禁水12 ～18 h 后，取全血0.3～0.4 mL，收集血清，在日立7100 生化自動分析儀上測定。主要測定肝功能和腎功能指標，包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、尿素(UN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)。

1.4.3 臟器系數(shù)測定與組織病理學檢查

采血結束后脫頸椎處死動物，取動物心臟、肝臟、腎臟，臟器稱重后以10%中性福爾馬林固定，組織經修塊，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，HE 染色，光鏡下檢查。臟器系數(shù)=臟器重量/動物體重 × 100%。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般體征觀察

整個實驗過程中動物眼睛與黏膜無異常分泌物，呼吸平穩(wěn)，活動正常，無抽搐震顫等異?，F(xiàn)象發(fā)生。給藥組大便較稀，但仍成形。

2.2 體重變化

PPARα 轉基因小鼠和C57BL/6J 小鼠在給藥28d 后，Tg 組與WT 組比較，體重變化率差異無顯著性(P ＞0.05)。但是Tg 雄性高劑量組在給藥第3周、第4 周體重持續(xù)下降，而WT 雄性高劑量組體重在第3 周出現(xiàn)短暫下降后第4 周又增加(圖1)。該結果提示Tg 雄性小鼠對氯貝丁酯毒性更加敏感。

2.3 血生化指標變化

參考本中心C57BL/6J 小鼠和PPARα 轉基因小鼠背景數(shù)據(jù)［2］，并與本實驗溶媒對照組比較，有顯著性差異的生化指標見表2。

從表2 可以看出，①各給藥組肌酐(CREA)均顯著高于對照組(P ＜0.01)，②Tg 雄性高、低劑量組肌酐值高于WT 雄性高、劑量組(P ＜0.05)。對于天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)，①Tg 雄性高、低劑量組AST 顯著高于對照組(P ＜0.01，P ＜0.05);②Tg 雄性高、低劑量組AST 值顯著高于WT 雄性高、劑量組(P ＜0.01，P ＜0.05)。Tg 雄性的腎臟損傷指標CREA、肝臟損傷指標AST 較WT 雄性升高更多，提示Tg 雄性小鼠腎臟損傷、肝臟損傷更嚴重。

2.4 臟器系數(shù)

①心臟系數(shù):各給藥組與對照組比，差異無顯著性。②肝臟系數(shù):Tg 和WT 各高、低劑量組均顯著高于對照組(P ＜0.01，P ＜0.05)(圖2A)。③腎臟系數(shù):Tg 高、低劑量組均顯著高于對照組(P ＜0.01，P ＜0.05);WT 高劑量組顯著高于對照組(P ＜0.05)(圖2B)。WT 低劑量組腎臟系數(shù)并沒有顯著性增加，提示WT 小鼠的腎臟損傷沒有Tg 小鼠嚴重。

圖1 給予氯貝丁酯后雄性小鼠體重變化率Fig.1 The change rate of mouse body weight after the clofibrate administration

表2 給予氯貝丁酯后血生化指標變化Tab.2 Changes of serum biochemistry in the mice after clofibrate administration

2.5 病理組織學變化

Tg 高劑量組:50%發(fā)生肝細胞溶解壞死，伴有再生，100%發(fā)生腎小球上皮細胞空泡變性。Tg 低劑量組:50%發(fā)生肝細胞再生，50%發(fā)生腎小管上皮細胞脂肪變性、腎小管上皮細胞核固縮。WT 高劑量組:50%發(fā)生腎小球上皮細胞空泡變性，肝臟未見病變。WT 低劑量組:50%發(fā)生小灶性肝細胞壞死炎細胞浸潤，50%發(fā)生腎小球上皮細胞空泡變性腎小管上皮細胞脂肪變性。Tg、WT 對照組各受檢臟器未見明顯病理改變。

從病理組織學結果可以看出氯貝丁酯對Tg 小鼠肝臟、腎臟的病理損傷程度比WT 小鼠更嚴重。

圖3 給予氯貝丁酯后肝臟病理變化(HE 染色，標尺=100 μm)Fig.3 Histological changes of the liver after clofibrate administration.HE staining.Bar=100 μm

圖4 給予氯貝丁酯后腎臟病理變化(HE 染色，標尺=100 μm)Fig.4 Histological changes of the kidney after clofibrate administration.HE staining.Bar=100 μm

3 討論

過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是核受體家族中的配體激活受體，PPARs 與配體結合激活后，與視黃醇類X 受體(RXR)形成異二聚體，形成的異二聚體與靶基因啟動子上游結合，最終調節(jié)靶基因的轉錄［3］。PPARs 有三個不同 亞型，包括α、β、γ。PPARα 通過基因轉錄控制氧化物酶、線粒體的β-氧化途徑、脂肪酸攝取和甘油三脂的分解，從而影響脂質代謝［4－7］，主要分布在代謝活性較高的組織中，如肝、腎、心臟，是脂類代謝分子基礎的研究熱點［8］。

在新藥研發(fā)過程尤其是臨床試驗階段中，大量候選藥物因為安全性問題被迫終止開發(fā)［9］。阿斯利康公司研發(fā)的PPAR-α/γ 雙重激動劑Tesaslitazar在1 個II 期和4 個III 期臨床試驗后，終止了對Tesaslitazar 的研究，因為在III 期臨床研究中發(fā)現(xiàn)該藥使血中肌酐升高，存在腎毒性。轉基因動物模型是基因組中含有外來遺傳物質的動物，可建立敏感動物品系及人類相同疾病的動物模型［10］，在藥物安全評價中，與傳統(tǒng)動物模型比較，具有敏感性高、結果真實可靠、外推行強、時間短、花費小等優(yōu)勢［11］。目前，PPARα 轉基因小鼠在國內外有用于心肌病的研究［12］，肝癌的發(fā)生機制的研究［13］等。本實驗使用PPARα 轉基因小鼠評價PPARα 激動劑氯貝丁酯的毒性，期望能更加敏感的發(fā)現(xiàn)其毒性。

CREA 是評價腎功能的重要生化指標，增高多見于腎功能不全、急慢性腎小球炎等，腎臟代謝廢物的能力下降。給藥結束后，Tg 雄性小鼠CREA 值顯著高于WT 雄性小鼠，提示PPARα 轉基因雄性小鼠對該藥物產生的腎臟損傷更加敏感，與阿斯利康公司研發(fā)的PPAR-α/γ 雙重激動劑Tesaslitazar 在臨床試驗中所產生的副作用一致。AST 是評價肝功能的重要生化指標，主要存在于肝細胞線粒體內，當肝臟發(fā)生嚴重壞死或破壞時，血清中濃度會偏高，增高常見于肝炎、脂肪肝、肝癌等疾?。?4］。Tg 雄性小鼠AST 顯著高于WT 雄性小鼠，提示PPARα 轉基因雄性小鼠對該藥物產生的肝臟損傷更加敏感。從表2中可以看出，Tg 雄性小鼠給藥組AST 與對照組比較有升高，但未見顯著性差異，可能是因為雌性小鼠的生理周期導致酶水平的變化，也可能是性激素影響藥物代謝轉化的結果［15］。此外，本實驗結果中還發(fā)現(xiàn)Tg 給藥組甘油三脂(TG)與Tg 對照組比有顯著下降(P ＜0.01，P ＜0.05)，而WT 組并沒有顯著下降，說明PPARα 轉基因小鼠在評價PPARα 激動劑類藥物的藥效時，也是一個更加敏感的動物模型，與本課題組前期所做的藥效學研究結果一致［16］。

臟器重量變化是藥物毒性反應的敏感指標之一，從病理學角度，當臟器出現(xiàn)細胞腫脹、出血、積水、增生等病理變化時，該臟器的重量可能增加［17］。本實驗中，各給藥組肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)均有顯著性增加，而心臟系數(shù)并沒有顯著性增加，與病理結果一致。根據(jù)本試驗血生化、臟器系數(shù)和病理檢測結果提示，PPARα 轉基因小鼠與C57BL/6J 野生小鼠相比，在評價PPARα 激動劑毒性方面是一個新的、敏感的動物模型。

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