齊曉瑩，蔣中秀，劉洋，李寧，張曉曄

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第四腫瘤科，沈陽 110022）

·論著·

沉默信息調節(jié)因子2相關酶1在直腸癌中的表達及臨床意義

齊曉瑩，蔣中秀，劉洋，李寧，張曉曄

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第四腫瘤科，沈陽 110022）

目的探討沉默信息調節(jié)因子2相關酶1（SIRT1）在直腸癌中的表達及其臨床意義。方法采用免疫組化法檢測86例直腸癌組織和30例癌旁正常直腸組織中SIRT1的表達情況，并與臨床病理資料進行相關性分析。結果直腸癌組織中SIRT1的陽性表達率為88.4%，癌旁正常組織陽性率為16.6%，顯著高于癌旁正常直腸組織（P＜0.001）；直腸癌組織中SIRT1的表達與TNM分期（P＜0.05）、淋巴結轉移的有無（P＜0.05）、腫瘤浸潤深度（P＜0.05）呈正相關；與腫瘤組織分化程度（P＜0.05）呈負相關；而與性別、年齡、腫瘤直徑無關（P＞0.05）。結論SIRT1在直腸癌中表達明顯高于癌旁正常直腸組織，且與TNM分期、淋巴結轉移、浸潤深度及腫瘤分化程度密切相關。提示SIRT1在直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用，可以作為直腸癌判斷預后的重要指標之一。

沉默信息調節(jié)因子2相關酶1；直腸癌；免疫組化

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近30年來大腸癌在我國的發(fā)病率及死亡率明顯上升，我國大腸癌中以直腸癌多見，占大腸癌的60%～75%，嚴重危害人們的身體健康。大腸癌的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡密切相關，而細胞的凋亡受到多基因的調控。SIRT1是一種依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ類組蛋白去乙?；福?，2］。通過對組蛋白及非組蛋白的乙?；瘉韰⑴c調控細胞的分化、增殖以及凋亡。近年來，越來越多的研究結果顯示，SIRT1在許多人類惡性腫瘤中表達上調，如前列腺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等，提示其可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本研究應用免疫組化技術對86例直腸癌組織中的SIRT1進行檢測，探討直腸癌中SIRT1表達水平與相關臨床病理資料相關性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2012年01月至2013年12月于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院手術切除直腸癌石蠟標本共86例，臨床資料完整，男性46例（53.5%），女性40例（46.5%），年齡32～79歲，平均年齡（60.1±7.5）歲。高分化4例（4.7%）、中分化78例（90.6%）、低分化4例（4.7%）；無淋巴結轉移56例（65.1%）、有淋巴結轉移30例（34.9%）；TNM分期按照AJCC/UICC TNM臨床分期標準：I期24例（27.9%）、Ⅱ期24例（27.9%）、Ⅲ期38例（44.2%）。所有病例術前均未行化療、放療或其他治療，所有切除標本均經(jīng)病理確診。另設30例癌旁正常直腸組織（均經(jīng)病理證實）作為對照組。所有標本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，標本連續(xù)切片，切片厚度為4 μm。

1.2 主要試劑

SIRT1抗體購自美國Abcam公司，二抗試劑盒、DAB試劑盒、二抗稀釋液等購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

免疫組化染色：采用SP法免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶活性1 h，PBS漂洗5 min×3次，熱修復抗原15 min，緩慢冷卻至室溫，PBS漂洗5 min×3次，非免疫血清封閉2 h，一抗（小鼠抗人單克隆抗體1∶400）孵育4℃過夜，PBS漂洗5 min×3次，相應二抗孵育室溫1 h，PBS漂洗5 min×3次，SP試劑每張切片1滴室溫下作用1 h，DAB顯色80 s，自來水終止顯色5 min，蒸餾水漂洗5 min，蘇木素核復染6 min，自來水沖洗10 min，蒸餾水漂洗5 min，切片脫水、透明，樹膠封片。用PBS代替一抗作陰性對照。

免疫組化結果判定：SIRT1表達主要為細胞質及細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進行雙盲閱片，采用半定量結果判斷，分別對鏡下陽性細胞的百分比和染色強度給予評分。參照Andre［12］評分標準，隨機選取5個高倍視野（×400）計數(shù)腫瘤細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，得出陽性細胞百分率，根據(jù)免疫組化染色陽性腫瘤細胞的比例和染色強度進行評分：無陽性細胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；無著色為0分，輕度著色（淺黃色）為1分，中度著色（棕黃色）為2分，重度著色（棕褐色）為3分。將上述2項得分相加：＜3分為陰性（-），≥3分為陽性（+）。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關分析法進行相關性分析，結果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SIRT-1在癌旁正常直腸組織和直腸癌組織中的表達

SIRT-1陽性染色為癌細胞核和/或胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒。免疫組化結果表明，直腸組織中SIRT -1的陽性表達率明顯高于癌旁正常直腸組織（χ2= 54.279，P＜0.001），見圖1，分別為88.4%（76/86）、16.6%（5/30），差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

圖1 SIRT1在正常直腸黏膜及直腸癌組織中的表達 SP×200Fig.1 The expression of SIRT1 in normal rectal mucosa and rectal cancer tissue SP×200

2.2 直腸癌組織中SIRT1的表達水平與其各種臨床病理特征的相關性

在直腸癌組織中，SIRT1表達水平高低與年齡、性別、腫瘤直徑無關（P＞0.05）；TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者中SIRT1陽性表達率分別為70.8%、91.7%、97.4%（χ2=10.431，P＜0.05）。有、無淋巴結轉移的患者中SIRT1的表達率為100%和82.1%（χ2= 6.062，P＜0.05）；腫瘤未侵潤肌層、浸潤肌層陽性表達率為71.4%和96.6%（χ2=11.599，P＜0.05）；高、中、低分化的陽性表達率為50.0%、92.4%、50.0%。本實驗的結果表明直腸癌組織中SIRT1的表達與腫瘤的TNM分期（r=0.324，P＜0.05）、浸潤深度（r= 0.367，P＜0.05）、有無淋巴結轉移（r=0.265，P＜0.05）呈正相關，而與組織的分化程度（r=-0.358，P＜0.05）呈負相關。

表1 直腸癌與正常直腸黏膜組織中SIRT-1的表達Tab.1 The expression levels of SIRT-1 in different rectum tissuse

表2 直腸癌中SIRT1的表達水平與其臨床病理特征間的關系Tab.2 Relationship between the expression of SIRT1 in colorectal cancer tissue and clinicopathological features

3 討論

SIR2相關酶類（Sir2-related enzymes，sirtuins）是1995年Sinclair等［1］于酵母中發(fā)現(xiàn)的，是一類依賴NAD+的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶。在哺乳動物中，sirtuins蛋白家族有7個成員，有不同的亞細胞定位及功能［3］。SIRT1、6、7主要定位于細胞核，SIRT3-5主要定位于線粒體，SIRT2主要定位于細胞質［4］。SIRT1是研究最多的成員，其活化后不僅能去乙?；凹谆揎椊M蛋白，還能與多種非組蛋白相互作用，參與多種細胞生理、病理過程，如細胞衰老凋亡、壽命延長、DNA損傷修復、腫瘤發(fā)生、抗氧化應激、能量代謝調節(jié)等［4］。盡管有研究認為SIRT1可以作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，但越來越多的研究結果顯示，SIRT1在許多人類惡性腫瘤中陽性表達均上調［5～10］。為了證實SIRT1在直腸癌組織中的表達情況，本研究通過免疫組化方法檢測SIRT1在直腸癌及癌旁正常直腸組織中的表達，結果顯示SIRT1在直腸癌中表達明顯高于癌旁正常直腸組織，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示SIRT1的高表達可能在直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

SIRT1在許多腫瘤組織中高表達，如卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌［7］，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可從以下幾個方面參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及影響預后：（1）通過直接去乙?；饔?，調節(jié)癌基因及抑癌基因的表達，促進細胞增殖，這可能是SIRT1參與腫瘤形成的主要機制。如SIRT1通過對P53蛋白382賴氨酸的去乙?；筆53蛋白不穩(wěn)定，延長細胞的生存，促進細胞增殖［11］。（2）通過翻譯后修飾作用，影響一些轉錄因子的轉錄活性，包括DNA結合力、亞細胞定位及募集共轉錄因子的能力［7］，從而調控這些轉錄因子下游產(chǎn)物的表達及相應的生物學功能。（3）SIRT1調節(jié)表皮間質轉化被認為是一個促進腫瘤細胞侵襲和遷移可能機制。有研究報道：在腫瘤生長因子β誘導的表皮間質轉化的乳腺癌細胞中SIRT1表達上調［12］，沉默SIRT1能夠恢復細胞間的鏈接，降低細胞的侵襲性［13］。（4）SIRT1過表達導致一些腫瘤獲得多種耐藥性，該現(xiàn)象已在多種多藥耐藥癌細胞株中得到證實［14］。

本研究結果表明直腸癌組織中SIRT1的表達與腫瘤的TNM分期，浸潤深度、淋巴結轉移呈正相關，而與組織的分化程度呈負相關，提示TNM分期越晚、浸潤肌層、有淋巴結轉移及分化程度越低的患者相應腫瘤組織中SIRT1表達陽性率越高。Zheng［15］及Kang等［16］研究表明，SIRT1過表達組的癌癥患者預后較差，且總生存期較短。Zhao等［10］，Cha等［17］研究胃癌、胰腺癌中SIRT1高表達與腫瘤高分級及淋巴結轉移相關。Liang等［18］對大腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1表達與腫瘤高分級、淋巴結轉移、肝轉移及不良預后相關。本研究結果與上述研究結果趨勢一致。但是也有研究表明SIRT1在大腸癌及轉移灶中表達較正常組織低［19］，可能SIRT1在不同的組織中有不同的生物學功能，導致出現(xiàn)矛盾的臨床結果。本研究結果顯示SIRT1在直腸癌腫瘤組織中高表達，且與腫瘤的浸潤深度，淋巴結轉移，TNM分期及腫瘤分化密切相關。本研究腫瘤分化組的高分化及低分化的組織例數(shù)較少，分組不平衡，可能出現(xiàn)偏倚。

綜上，SIRT1可能在直腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有可能成為直腸癌判斷預后的一個重要指標。針對SIRT1相關生物學行為，干擾SIRT1表達，阻斷SIRT1相關信號通路，或沉默其基因表達，可能抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，從而提高治療直腸癌的療效，這一設想還需進一步研究證實。

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（編輯 裘孝琦）

Expression and ClinicalSignificance of Sir2-related Enzymes-1 in ColorectalCancer

QIXiao-ying，JIANGZhong-xiu，LIUYang，LINing，ZHANGXiao-ye
（DepartmentofOncology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110022，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of Sir2-related enzymes-1（SIRT1）in colorectal cancer.MethodsThe expression of SIRT1 was evaluated by immunohistochemistry in 86 selected cases of primary Colorectal cancer and 30 samples of normal rectum tissues besided carcinoma.The relationship of the expression and clinical pathological features were analyzed.ResultsThe positive expression rate of SIRT1 in Colorectal cancer tissue was 88.4%，and significantly higher than in normal rectum tissue besided carcinoma（P＜0.001）.There were no correlation between the expression ofSIRT1 and sex，age and tumordiameter，and significantpositive correlation between the expression ofSIRT1 and TNM stage（P＜0.05），lymph node metastasis（P＜0.05），infiltrating depth（P＜0.05），and negagtive correlation between the expression of SIRT1 and tumor differentiation（P＜0.05）.ConclusionThe positive expression rate of SIRT1 in colorectal cancer tissue was significantly higher than in normal rectum tissue besided carcinoma and intimate correlation with tumor differentiation，TNM stage，lymph node metastasis and Infiltrating depth.ConclusionSIRT1 may be an importantassistance gene to diagnose and judge prognosis，and may improve diagnostic rate and auxiliarily judge prognosisasa importantColorectalcancermarker.

Sir2-related enzymes-1；colorectal cancer；immunohistochemistry

R735.3

A

0258-4646（2015）07-0606-05

遼寧省自然科學基金（2014021032）

齊曉瑩（1985-），女，醫(yī)師，碩士.

張曉曄，E-mail：zhangxy1@sj-hospital.org

2015-04-17

網(wǎng)絡出版時間：