孫建秀，李璇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管/甲狀腺外科，沈陽(yáng) 110001）

·論著·

Hrs對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及增殖作用的研究

孫建秀，李璇

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管/甲狀腺外科，沈陽(yáng) 110001）

目的研究在結(jié)腸癌細(xì)胞系中Hrs與凋亡及增殖的關(guān)系。方法在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116和SW-480中下調(diào)Hrs蛋白表達(dá)，通過(guò)Incucyte、MTT法、軟瓊脂試驗(yàn)、FACS檢測(cè)細(xì)胞凋亡與增殖情況。結(jié)果下調(diào)Hrs表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116和SW-480凋亡明顯增加，增殖及細(xì)胞活性均顯著受到抑制。結(jié)論Hrs與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

Hrs；結(jié)腸癌；凋亡；增殖

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來(lái)，其發(fā)病率不斷上升，雖然手術(shù)治療技術(shù)較為成熟，但5年生存率僅為50%～55%［1，2］。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)酪氨酸激酶底物（hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate，Hrs）與STAM（signal transducing adaptor molecule）共同組成內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（endosomal-sorting proteins required for transport，ESCRT）。Hrs與溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)及膜蛋白的泛素化降解相關(guān)，但其與結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚不明確。本研究通過(guò)在結(jié)腸癌細(xì)胞系中下調(diào)Hrs蛋白的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡及增殖的變化，旨在探討Hrs對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116與SW-480購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。用含50 IU青霉素/鏈霉素、2 mmol/L L-glutamine及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，3～5 d傳代1次。

1.2 質(zhì)粒及慢病毒制備及轉(zhuǎn)染

采用pLKO.1慢病毒RNAi表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建慢病毒shRNA。本研究中所用shRNA如下：shHrs1，5′-CC GGTCGACAAGAACCCACACGTCCTCGAGGACGTG TGGGTTCTTGTCGTTTTTT-3′；shHrs2，5′-CCGGTG CACGTCTTTCCAGAATTCAACTCGAGTTGAATTCT GGAAAGACGTGCTTTTTT-3′；shGFP，5′-CCGGTAC GTCTATATCATGGCCGACAACTAGTTGTCGGCCAT GATATAGACGTTTTTTG-3′。shGFP在本研究中用做對(duì)照。

病毒包裝：將目的質(zhì)粒與pCMV-dR8.91、pCMVVSV-G通過(guò)鈣磷法共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞中，比例為10∶5∶5 μg（10 cm培養(yǎng)皿）。6 h后換液。48 h后收集含病毒的培養(yǎng)基，19 400 g離心2 h。將沉淀的病毒再懸浮，保存于-80℃。用這些病毒感染細(xì)胞48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡的計(jì)量使用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）進(jìn)行分析，細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC（BD Biosciences公司）和propidium iodide（Sigma公司）染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.4 細(xì)胞活性檢測(cè)

MTT檢測(cè)：將MTT溶于PBS中（5 mg/mL）保存。感染后細(xì)胞鋪于96孔板，培養(yǎng)48 h后加入0.5 mg/mL MTT溶液，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄MTT，每孔加入200 μL DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值。

軟瓊脂生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)：在6孔板中，將含有104個(gè)細(xì)胞的0.35%的軟瓊脂鋪于0.6%的底層瓊脂之上，細(xì)胞培養(yǎng)3～4周后，計(jì)數(shù)形成的集落數(shù)量。

Incucyte系統(tǒng)（時(shí)間動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)）：將細(xì)胞按每孔5 000個(gè)鋪于96孔版中，儀器放置在培養(yǎng)箱中，中間放置標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)容器，通過(guò)下方的顯微成像裝置進(jìn)行全自動(dòng)拍照。由系統(tǒng)軟件自動(dòng)依據(jù)飽和度和計(jì)數(shù)分析生成的基于圖像的飽和度—時(shí)間圖表。

1.5 Western blot

收集處理后的細(xì)胞，PBS清洗2次，用裂解液（150 mmol/L sodium chloride，1.0%NP-40 or Triton X-100，0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS，50 mmol/L Tris，pH8.0）裂解。經(jīng)SDS-PAGE電泳，穩(wěn)流冰浴電轉(zhuǎn)膜，應(yīng)用Li-Cor Odyssey image reader進(jìn)行Western blot檢測(cè)。所用Hrs單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用表示，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)Hrs蛋白表達(dá)抑制HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Wetern blot結(jié)果顯示：shHrs2可有效下調(diào)Hrs蛋白表達(dá)，而shHrs1未能成功下調(diào)蛋白表達(dá)（圖1A）。有效下調(diào)Hrs表達(dá)后，HCT-116生長(zhǎng)曲線（Incucyte生成飽和度—時(shí)間曲線）明顯受到抑制（圖1B）（P＜0.05）。

圖1 慢病毒感染shHrs后Wetern blot檢測(cè)Hrs蛋白表達(dá)情況及HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.1 Knocking down of Hrs expression inhibits cell growth curve of HCT-116

2.2 下調(diào)Hrs表達(dá)后HCT-116細(xì)胞凋亡增加且集落形成能力降低。

在HCT-116細(xì)胞系中，感染shHrs2病毒后細(xì)胞可穩(wěn)定低表達(dá)Hrs蛋白，應(yīng)用FACS檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示其凋亡明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）（圖2A）。軟瓊脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少（P＜0.01）（圖2B）。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 下調(diào)Hrs表達(dá)后SW-480細(xì)胞凋亡增加且細(xì)胞活性減低。

在SW-480細(xì)胞系中穩(wěn)定低表達(dá)Hrs蛋白后，其凋亡比例明顯升高（P＜0.01）（圖3A），MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性可見(jiàn)其活性較對(duì)照組明顯下降（P＜0.01）（圖3B）。

3 討論

圖2 下調(diào)Hrs表達(dá)后HCT-116細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞集落形成情況Fig.2 Apoptosis and cell colony formation change in HCT116 after knocking down of Hrs

圖3 Hrs表達(dá)下調(diào)后SW-480細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞活性改變Fig.3 Apoptosis and cell viability change in SW-480 after knocking down of Hrs

吞噬細(xì)胞將微生物吞噬固定之后，形成的吞噬小泡會(huì)與溶酶體融合，隨后被降解，這是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)里非常重要的自我保護(hù)機(jī)制。2001年Katzmann等［3］發(fā)現(xiàn)了ESCRT復(fù)合體，Hrs和STAM的作用也開(kāi)始被研究者關(guān)注。目前認(rèn)為，在細(xì)胞正常的代謝過(guò)程中，Hrs在膜蛋白泛素化后轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解，在識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白、細(xì)胞因子受體、膜蛋白分選及轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中意義重大［4］。

ESCRT復(fù)合體保守存在于真核生物中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中ESCRT系統(tǒng)由ESCRT-0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及VPS4這5種復(fù)合物及一些輔助蛋白構(gòu)成。Hrs存在于ESCRT-0中，其FIVE模序在籠形蛋白聚合中起重要作用，對(duì)泛素化的膜蛋白進(jìn)行識(shí)別和分選［5，6］。

ESCRT復(fù)合體中，Tsg101、Vps37A和Did2都是抑癌因子。研究表明，敲除小鼠的Tsg101基因，就不會(huì)表現(xiàn)出抑癌活性，但在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）體內(nèi)，ESCRT-Ⅰ復(fù)合體和ESCRT-Ⅱ復(fù)合體也起抑制腫瘤的作用。表達(dá)突變型ESCRT-Ⅰ復(fù)合體或ESCRT-Ⅱ復(fù)合體可誘發(fā)腫瘤形成，這可能與突變細(xì)胞產(chǎn)生了過(guò)量的細(xì)胞因子有關(guān)，細(xì)胞增殖受到了持續(xù)的刺激所致［7］。

本研究通過(guò)下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系中Hrs的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Hrs可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，抑制其增殖和活性，增加其凋亡，證明Hrs與結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡和增殖過(guò)程密切相關(guān)。證明低表達(dá)Hrs影響了ESCRT-0復(fù)合體對(duì)泛素化膜蛋白的分選功能，影響了其循環(huán)途徑，致使其不能回到質(zhì)膜或胞質(zhì)中。同時(shí)，Hrs的低表達(dá)影響了ESCRT-0的功能，影響了對(duì)ESCRT-Ⅰ的招募，進(jìn)而影響了ESCRT-Ⅱ的招募，影響內(nèi)體膜的內(nèi)陷與質(zhì)膜的裂解。這些過(guò)程均與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)，Hrs可能通過(guò)該機(jī)制影響了其增殖與細(xì)胞活性，對(duì)凋亡產(chǎn)生影響。但該機(jī)制具體的信號(hào)路徑尚須進(jìn)一步研究細(xì)化，以期得到詳細(xì)的分子機(jī)制。

［1］Nahas SC，Nahas CS，Bustamante-Lopez LA，et al.Prognostic factors of surgically-treated patients with cancer of the right colon：a ten years'experience of a single universitary institution［J］.Arq Bras Cir Dig，2015，28（1）：3-7.

［2］Halwani Y，Kojic LD，Chan SK，et al.Prognostic significance of autocrine motility factor receptor expression by colorectal cancer and lymph node metastases［J］.Am J Surg，2015，209（5）：884-889.

［3］Katzmann DJ，Babst M，Emr SD.Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex，ESCRT-I［J］.Cell，2001，106（2）：145-155.

［4］Edgar JR，Eden ER，F(xiàn)utter CE.Hrs-and CD63-dependent competing mechanisms make different sized endosomal intraluminal vesicles［J］.Traffic，2014，15（2）：197-211.

［5］Goliand I，Nachmias D，Gershony O，et al.Inhibition of ESCRT-Ⅱ-CHMP6 interactions impedes cytokinetic abscission and leads to cell death［J］.Mol Biol Cell，2014，25（23）：3740-3748.

［6］Adell MA，Vogel GF，Pakdel M，et al.Coordinated binding of Vps4 to ESCRT-III drives membrane neck constriction during MVB vesicle formation［J］.J Cell Biol，2014，205（1）：33-49.

［7］Raiborg C，Stenmark H.The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins［J］.Nature，2009，458（7237）：445-452.

（編輯 王又冬）

EffectsofHrson Apoptosisand CellProliferation in Colon Cancer CellLines

SUNJian-xiu，LIXuan
（DepartmentofVascularand Thyroid Surgery，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effects of Hrs on apoptosis and cell proliferation in colon cancer cell lines HCT-116 and SW-480.MethodsThe expression of Hrs in HCT-116 and SW-480 was knocking down by shRNA.Cell apoptosis was detected by FACS and cell proliferation was determined by MTT，incucyte and soft agar.ResultsThe apoptosis was significantly increased after Hrs knocking down in both HCT-116 and SW-480，and the cellproliferation was inhibited.ConclusionHrs isinvolved in the apoptosis and proliferation ofcolon cancercells.

Hrs；colon cancer cell；apoptosis；proliferation

R735

A

0258-4646（2015）07-0585-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81170295）

孫建秀（1980-），女，護(hù)師，本科.

李璇，E-mail：lxaozhsh@163.com

2015-02-22

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：