孫宇，封瑞，楊磊，毛楠，胡慧媛，孫雪菲，郝麗英

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品中心，天津 300300）

·論著·

二硫蘇糖醇提取純化Cavl.2鈣通道片段CT3蛋白

孫宇1，封瑞1，楊磊2，毛楠1，胡慧媛1，孫雪菲1，郝麗英1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品中心，天津 300300）

目的探討二硫蘇糖醇（DTT）有助于PreScission蛋白酶切除重組蛋白GST-CT3標(biāo)簽GST的方法。方法在大腸埃希菌BL21中轉(zhuǎn)化入pGEX-6P-3/CT3重組質(zhì)粒并誘導(dǎo)其表達(dá)，用B-PER提取純化重組蛋白GST-CT3，在10 mmol/L DTT存在的情況下PreScission蛋白酶切除GST標(biāo)簽得到高濃度的CT3蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定CT3蛋白。結(jié)果不含DTT情況下，PreScission蛋白酶很難切除重組蛋白GST-CT3的標(biāo)簽蛋白GST，而在10 mmol/L DTT存在的情況下，PreScission蛋白酶能夠切除重組蛋白GST-CT3的標(biāo)簽蛋白GST，得到高濃度的CT3蛋白。結(jié)論10 mmol/L DTT有助于PreScission蛋白酶切除重組蛋白GST-CT3的標(biāo)簽蛋白GST，得到高濃度的CT3蛋白。

重組蛋白；心肌細(xì)胞；鈣通道

L型鈣離子通道是存在于心肌細(xì)胞上的主要鈣通道。L型鈣通道電流參與心肌動(dòng)作電位平臺(tái)期的形成與維持，鈣離子（Ca2+）通過(guò)L型鈣通道進(jìn)入心肌細(xì)胞，從而觸發(fā)鈣，誘發(fā)鈣釋放引起興奮收縮耦聯(lián)，此過(guò)程對(duì)于心臟正常功能的發(fā)揮具有重要作用［1，2］。除此之外，L型鈣離子通道還可參與可興奮細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、釋放和自我調(diào)控轉(zhuǎn)錄［3，4］。心肌L型鈣離子通道即Cav1.2鈣通道的正常表達(dá)是心臟收縮的必要前提，Cav1.2鈣通道的缺乏導(dǎo)致血管肌源性收縮無(wú)法正常進(jìn)行，并且還可干擾激素對(duì)血壓的正常調(diào)節(jié)［5］。目前研究表明心肌Cav1.2鈣通道的表達(dá)與功能異常與多種疾病密切相關(guān)，例如已知的與Cav1.2鈣通道相關(guān)的疾病,包括Timothy綜合征、Brugada綜合征、房顫、心律失常、心力衰竭等［6，7］。

心肌Cav1.2鈣通道可直接或間接受磷酸化和氧化還原作用所調(diào)節(jié)［8，9］，也可被細(xì)胞內(nèi)激素、蛋白激酶、磷酸化蛋白酶、鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ，CaMKⅡ）等［8，10，11］多種細(xì)胞因子所調(diào)節(jié)，從而引起通道活性的變化，進(jìn)而影響通道的功能改變。心肌Cav1.2鈣通道具有較長(zhǎng)的C末端片段，此部位是通道功能調(diào)節(jié)的重要部位，在或戰(zhàn)或逃反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。而CT3（a.a.1942-2169）是位于Cav1.2鈣通道C末端遠(yuǎn)端的片段遠(yuǎn)端羧基末端（distal carboxy terminus，DCT）的一段片段，DCT在或戰(zhàn)或逃反應(yīng)中作用關(guān)鍵，對(duì)Cav1.2通道的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。有研究報(bào)道稱DCT能夠抑制通道活性［12～14］，然而，詳細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚。因此，獲得DCT上的鈣通道片段CT3蛋白對(duì)于鈣通道相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究具有重要的意義。目前，實(shí)驗(yàn)室提取鈣通道片段CT3蛋白是通過(guò)GST標(biāo)簽再經(jīng)大腸埃希菌誘導(dǎo)大量表達(dá)而形成重組蛋白GST-CT3。然而與其他GST標(biāo)簽的蛋白相互作用時(shí)，往往需要用酶切掉標(biāo)簽GST而得到純化的CT3蛋白。由于GST-CT3蛋白的特性，常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下酶無(wú)法切掉GST-CT3蛋白的標(biāo)簽GST。針對(duì)這一難題，本研究采用高濃度的還原劑二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）探尋酶切除GST-CT3蛋白的標(biāo)簽GST得到純化的CT3蛋白的方法，為Cav1.2通道調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pGEX-6P-3和BL21菌種，購(gòu)自美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司；DTT、異丙基硫代半乳糖苷、氨芐西林、溶菌酶，購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司。絲氨酸蛋白酶、GST融合蛋白純化凝膠（Glutathione-4B beads）、DNA酶（Turbo nuclease），購(gòu)自英國(guó)GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pGEX-6P-3/CT3的誘導(dǎo)及表達(dá)：將重組質(zhì)粒pGEX-6P-3/CT3化入BL21細(xì)菌中，在于含有0.1 mg/mL氨芐西林的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃水浴、100 r/min震蕩過(guò)夜。將菌液用LB培養(yǎng)液稀釋至OD 0.6～0.8范圍內(nèi)［15］，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷，37℃水浴、100 r/min震蕩5 h，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白GST-CT3。

1.2.2 DTT提取和純化無(wú)標(biāo)簽的CT3蛋白：將菌液按照6 000 r/min離心15 min，棄掉上清收集沉淀。將沉淀重懸，每克沉淀加入4 mL B-PER［16，17］、0.2 mg/mL溶菌酶、1 μL DNA酶（Turbo nuclease）和蛋白酶抑制劑，室溫震蕩30 min以促進(jìn)細(xì)菌破膜、DNA溶解及GST-CT3蛋白的釋放。16 000 r/min離心20 min，取上清置于2個(gè)15 mL EP管中，分別與PBS buffer洗過(guò)的300 μL GS-4B beeds在4℃孵育搖晃過(guò)夜。800 r/min離心棄上清，beeds分別用5 mL PBS buffer和Tris buffer各洗2次，留取少量的beeds（為GST-CT3蛋白）記為P1，取其中一管加990 μL Tris buffer和10 μL PreScission蛋白酶，標(biāo)記為Control；另一管加990 μL Tris buffer、10 μL PreScission蛋白酶和終濃度為10 mmol/L DTT標(biāo)記為DTT，分別4℃孵育搖晃6 h。

1.2.3 DTT提取和純化后CT3蛋白的鑒定：將上述PreScission蛋白酶酶切后的2管蛋白分別離心留取上清10 μL記為S，分別留取少許沉淀beeds記為P2，各留取的樣品經(jīng)1×loading緩沖液室溫處理20 min后，80℃加熱5 min，進(jìn)行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)Marker位置檢測(cè)CT3蛋白。

2 結(jié)果

2.1 單純酶切方法無(wú)法提取和純化CT3蛋白

將單純PreScission蛋白酶酶切之前的GST-CT3蛋白，即P1、PreScission蛋白酶酶切之后的上清，即S、和沉淀，即P2，分別進(jìn)行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色。如圖1所示，經(jīng)單純Pre-Scission蛋白酶酶切之后，上清無(wú)任何蛋白的存在，而沉淀蛋白仍以GST-CT3蛋白形式存在。該結(jié)果證實(shí)了GST-CT3蛋白的標(biāo)簽GST無(wú)法被PreScission蛋白酶酶切掉。

圖1 單純酶切法無(wú)法提取出CT3蛋白Fig.1 CT3 protein could not be obtained by using enzyme alone

2.2 DTT能夠提取純化出高濃度的CT3蛋白

將PreScission蛋白酶酶切之前的GST-CT3蛋白，即P1、在10 mmol/L DTT存在的情況下經(jīng)PreScission蛋白酶酶切之后的上清，即S、和沉淀，即P2，分別進(jìn)行12.5%SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色。如圖2所示，在10 mmol/L DTT存在的情況下經(jīng)PreScission蛋白酶酶切之后，上清存在較多的CT3蛋白，而沉淀則為較多的GST蛋白和極少量的CT3蛋白，幾乎不存在GST-CT3蛋白。以上結(jié)果說(shuō)明10 mmol/L DTT能夠有助于PreScission蛋白酶酶切GST -CT3蛋白的標(biāo)簽GST，且酶切效率較高。

圖2 高濃度DTT能夠提取出高純度、高濃度CT3Fig.2 The CT3 protein could be obtained with high concentration of DTT

3 討論

越來(lái)越多的研究表明，Cav1.2鈣通道的DCT在通道功能調(diào)節(jié)過(guò)程中起到重要作用。有研究報(bào)道，A激酶錨定蛋白能夠通過(guò)一修飾的亮氨酸拉鏈結(jié)合于DCT，而參與β-腎上腺素對(duì)心肌細(xì)胞Cav1.2通道的調(diào)節(jié)，從而抑制通道的活性［13］。亦有研究報(bào)道稱，DCT能夠與Cav1.2通道C末端近端上的CB/IQ區(qū)域直接結(jié)合從而掩蓋了CaM蛋白與通道的結(jié)合位點(diǎn)，抑制了CaM蛋白與通道的結(jié)合因此抑制通道的活性［14］?？梢?jiàn)，DCT在Cav1.2通道的功能調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵的作用，因此獲得DCT上的鈣通道片段CT3蛋白對(duì)于鈣通道的研究具有重要的意義。大腸埃希菌由于其操作簡(jiǎn)單、成本低、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高等特性常常用于重組蛋白的表達(dá)。GST標(biāo)簽的CT3蛋白（GST-CT3）在經(jīng)大腸埃希菌誘導(dǎo)及表達(dá)是實(shí)驗(yàn)室提取純化重組蛋白的常用方法，但由于重組蛋白結(jié)構(gòu)的差異，GST-CT3蛋白的標(biāo)簽GST很難被PreScission蛋白酶所切掉，然而由于實(shí)驗(yàn)的需求，常常需要不含標(biāo)簽GST的單純CT3蛋白。目前針對(duì)這一難題，有研究者提出在PreScission蛋白酶酶切過(guò)程中加入高鹽、甘油等方法有助于酶切，但是效果均不理想，因此需要單純CT3蛋白的相關(guān)實(shí)驗(yàn)無(wú)法開(kāi)展。DTT被報(bào)道有助于重組人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、重組牛乳鐵蛋白等多種重組蛋白的提取［18，19］，而是否能夠有助于GST-CT3重組蛋白的提取目前尚無(wú)研究報(bào)道，因此本研究在重組蛋白GST-CT3應(yīng)用高濃度DTT，探討其是否能夠有助于提取純化單純CT3蛋白。

本研究在PreScission蛋白酶酶切過(guò)程中加入高濃度DTT（10 mmol/L）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與不加DTT相比，10 mmol/L DTT能夠有助于PreScission蛋白酶酶切掉GST-CT3蛋白的標(biāo)簽GST，酶切效率很高，幾乎不存在未經(jīng)酶切的GST-CT3蛋白，并且提取純化出的單純CT3蛋白的純度和產(chǎn)量均相對(duì)較高。GSTCT3重組蛋白結(jié)構(gòu)的差異使其不易被PreScission蛋白酶切除標(biāo)簽GST，其原因可能由于在GST-CT3重組蛋白提取純化的過(guò)程中，長(zhǎng)期暴露于空氣之中，使其被空氣中的氧氣氧化而引起蛋白結(jié)構(gòu)的改變，掩蓋或改變了PreScission蛋白酶在蛋白上的作用部位，因此PreScission蛋白酶無(wú)法發(fā)揮其正常功能。而DTT是一種可滲透過(guò)細(xì)胞膜的小分子還原劑，常常用于蛋白的提取，最近有研究報(bào)道稱DTT作為還原試劑可以調(diào)控不同組織中Ca2+、Na+、KATP通道。而本實(shí)驗(yàn)中加入了高濃度的DTT，可以還原被空氣氧化的GST-CT3重組蛋白，使其結(jié)構(gòu)趨于正常，暴露出PreScission蛋白酶的作用部位。因此可以獲得高濃度的單純CT3蛋白。

綜上所述，高濃度DTT方法能夠提取純化高產(chǎn)量、高純度的Cav1.2鈣通道片段CT3蛋白，可以廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中，為Cav1.2通道的研究奠定了基礎(chǔ)。然而本實(shí)驗(yàn)仍存在不足，由于DTT（10 mmol/L）濃度較高，提取出的CT3蛋白含有較高含量的DTT，可能會(huì)對(duì)后續(xù)研究產(chǎn)生一定的影響，在有條件的情況下最好使用小分子滲透膜將小分子的DTT濾除，然后得到更為純凈的不含DTT的單純CT3蛋白。

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（編輯 陳 姜）

Purification ofCT3 FragmentofCav1.2 with Dithiothreitol

SUN Yu1，F(xiàn)ENG Rui1，YANG Lei2，MAO Nan1，HU Hui-yuan1，SUN Xue-fei1，HAO Li-ying1
（1.DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110122，China；2.IndustrialGoods Center，Entry-exitInspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300300，China）

Objective To explore whetherdithiothreitol（DTT）is helpfulfor PreScission Protease to cutoffthe GST from GST-CT3 protein.MethodsThe pGEX-6P-3/CT3 recombinant plasmid was transfected into Escherichia coli BL21，and the GST-CT3 fusion protein was purified by BPER method.PreScission Protease was applied with 10 mmol/L DTT to cut off the GST，then the SDS-PAGE was performed for identification of the CT3 protein.ResultsWithout DTT，it was very difficult for PreScission Protease to cut off the GST from GST-CT3 protein.However，in the presence of10 mmol/L DTT，PreScission Protease could cutoffthe GSTeasily as identified by SDS-PAGE.Conclusion10 mmol/L DTT can help Pre-Scission Protease to cutGSTfrom GST-CT3 protein，so as to achieve high concentration ofCT3.

fusion protein；cardiac myocytes；calcium channel

R96

A

0258-4646（2015）07-0588-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31471091，31400981）

孫宇（1989-），女，碩士研究生.

郝麗英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2015-01-13

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：