張婭潔，陳應之，楊志民，黃永焯*

（1.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203；2.天津醫(yī)科大學藥學院天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津 300070；3.美國密西根大學藥學院，密西根州 安娜堡48109）

·生物制藥論壇· BIOPHARMACEUTICAL FORUM

細胞穿膜肽介導蛋白/多肽類藥物輸送的研究進展

張婭潔1，2，陳應之1，楊志民2，3，黃永焯1*

（1.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203；2.天津醫(yī)科大學藥學院天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津 300070；3.美國密西根大學藥學院，密西根州 安娜堡48109）

編者按：2014年11月，由國家自然科學基金委員會主辦，中國藥科大學生命科學與技術學院、中國藥科大學科技處、《藥物生物技術》、《藥學進展》、常州千紅生化制藥股份有限公司、江蘇省生物化學與分子生物學學會等協(xié)辦的“生物藥物研發(fā)與創(chuàng)新青年學者高峰論壇”在中國藥科大學召開，為廣大醫(yī)藥領域研究人員特別是青年學者搭建了交流學術觀點、分享研究成果的寶貴平臺。會議期間，來自中科院、第四軍醫(yī)大學、北京大學、復旦大學等多家具有國內頂尖生物制藥研究實力的科研機構的專家學者們圍繞“生物藥物領域的發(fā)展趨勢、前景預測和展望”、“生物藥物研發(fā)與產業(yè)中的新思路、新技術、新方法”、“生物藥物成藥性研究”等主題展開了充分交流與探討。醫(yī)藥產業(yè)關系國計民生，在國家經(jīng)濟發(fā)展中具有舉足輕重的地位，而生物制藥更是具有巨大的發(fā)展前景。本刊編輯部特邀部分專家作客本期“生物制藥論壇”欄目，與讀者分享他們在該領域的科研思路和精彩觀點，為生物藥物的研發(fā)提供參考。

在當前藥物研發(fā)中，蛋白/多肽類藥物占據(jù)著重要地位。然而，此類藥物大多需進入細胞內才能發(fā)揮作用，故細胞攝取率低的問題成為制約其發(fā)展的關鍵因素。細胞穿膜肽是一類富含精氨酸的短肽，自身具有較強的生物膜穿透能力，可攜帶多種大分子甚至是納米粒入胞。因此，穿膜肽被廣泛應用于藥物輸送，且基于穿膜肽介導藥物胞內輸送，成為解決蛋白/多肽類藥物入胞問題的優(yōu)選策略。主要綜述穿膜肽介導蛋白/多肽類藥物輸送用于不同疾病治療的研究進展。

細胞穿膜肽；蛋白；多肽；胞內輸送

近30年來，隨著人類對生命科學探知的逐漸深入，以基因工程、酶工程等為代表的生物技術得到了前所未有的突破和進步，生物藥物的研發(fā)也隨之得到長足發(fā)展，高速遞增的研發(fā)投入促進了眾多生物藥物的問世。在1989年，治療藥物市場上只有13種生物藥物，而到2012年，這一數(shù)字增長了16倍，達210種[1]。

憑籍令人滿意的臨床效果，生物制藥在醫(yī)藥領域中起著越來越重要的作用?，F(xiàn)階段生物藥物的研發(fā)與臨床

應用以蛋白/多肽類藥物為主，此類藥物具有以下優(yōu)勢：1）相較于傳統(tǒng)小分子藥物而言，此類藥物靶向性更好，因而對正常組織和器官的毒性較低；2）由于此類藥物大多來源于人體，故生物相容性較好，不易引起機體免疫應答，對正常生理過程的影響甚少；3）此類藥物可以作為基因藥物的下游替代藥物，能避免基因藥物脫靶的潛在風險。然而，作為生物大分子藥物，蛋白/多肽類藥物存在著缺乏主動跨膜轉運機制、難以有效地被細胞攝取等缺點，這對于需要進入細胞內才能發(fā)揮作用的此類生物藥物來說，極大地影響了其生物利用度。

因此，利用細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPP）介導生物大分子藥物的體內輸送，成為近年來研究熱點。CPP是一類富含精氨酸或賴氨酸的多肽，其序列長度一般少于20個氨基酸。上世紀八九十年代，便有研究發(fā)現(xiàn)來自于HIV-1病毒的Tat蛋白及其功能結構域可以高效穿越細胞膜進入細胞（Frankel等,Cell, 1988年; Green等,Dis Markers, 1990年)，從而開啟了CPP的應用研究。隨后，F(xiàn)awell等（Proc Natl Acad Sci USA, 1994年）通過化學偶聯(lián)的方法，將CPP Tat共價修飾于模型蛋白藥物（如β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、RNA酶等）上，并成功地利用CPP介導這些活性生物大分子進入細胞內，且發(fā)現(xiàn)CPP介導大分子藥物進入細胞的行為不受細胞類型的影響。這揭示了CPP的穿膜功能具有普適性，極大地促進了CPP在藥物輸送（drug delivery）領域的應用。后來，又有研究者將Tat片段的基因序列插入到含有目的蛋白序列的質粒中，利用細菌表達系統(tǒng)，成功表達出融合有CPP的目的蛋白（Ezhevsk等,Proc Natl Acad Sci USA, 1997年;Nagahara等, Nat Med, 1998年）。Dowdy研究團隊也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腹腔注射的CPP-β-半乳糖苷酶融合蛋白能夠有效地穿越血腦屏障，進入腦組織（Schwarze等,Science, 1999年)。這些奠基性的研究工作，極大地促進了對CPP介導大分子藥物輸送的廣泛研究與應用。CPP不僅可以攜帶化學小分子藥物入胞，還可介導核酸、蛋白、脂質體、高分子聚合物和無機納米材料等穿越細胞膜而進入細胞[2]。因此，CPP技術被形象地比喻為“特洛伊木馬”[3]。

然而，由于具有強大的穿越生物膜能力，CPP可能會顯著改變所攜蛋白/多肽類藥物的體內分布，導致藥物廣泛的組織分布。為了減少CPP介導的藥物非特異性分布，實現(xiàn)靶向給藥，Yang研究小組設計了一種抗體靶向的觸發(fā)式前藥型CPP介導給藥系統(tǒng)，并命名為 ATTEMPTS（Antibody Targeted, [protamine] Triggered, Electrically, Modified Prodrug-Type Strategy)。如圖1所示，該系統(tǒng)包括兩個模塊：CPP修飾的藥物和肝素修飾的抗體，其設計原理是，利用肝素與CPP的靜電及親和作用，通過非共價方式將蛋白藥物和抗體連接成一個具有靶向作用的給藥系統(tǒng)。其中，抗體介導為蛋白藥物賦予了靶向性，使其能更好地在腫瘤部位富集；當注射魚精蛋白時，由于魚精蛋白與肝素具有更強的親和力，從而將CPP修飾的藥物置換并釋放出來；隨后，藥物在CPP介導下進入靶細胞發(fā)揮作用[4-7]。

圖1 ATTEMPTS 系統(tǒng)介導抗腫瘤藥物輸送示意圖Figure 1 Schematic illustration of anticancer drug delivery mediated by ATTEMPTS system

此外，人們還針對其他一些基于腫瘤微環(huán)境激活（如pH敏感/腫瘤酶敏感等）的穿膜輸送策略，開展了一系列研究，其目的都是為了讓CPP的膜穿透作用僅限于靶向特定組織[7]。

CPP與蛋白的連接方式主要有化學偶聯(lián)（即共價連接）、基因重組、靜電吸附（即非共價連接）和蛋白載體表面修飾等[7]。所連接的蛋白種類也十分廣泛，包括生長因子、胰島素、酶類、細胞毒素等[3]。本文主要針對CPP介導蛋白/多肽類藥物輸送用于不同疾病治療作一綜述。

1 用于腫瘤治療

相較于阿霉素、紫杉醇等小分子抗腫瘤藥物，以蛋白/多肽類藥物為代表的大分子抗腫瘤藥物有著極高的生物活性。

1.1 穿膜肽-蛋白毒素

一些來源于植物的蛋白毒素可以起到很好的殺死腫瘤細胞的作用。例如，核糖體失活蛋白（ribosome inactivating proteins, RIP）可以作用于真核細胞核糖體，抑制核糖體功能，從而通過阻礙腫瘤細胞中蛋白質的合成來殺死細胞。一旦進入腫瘤細胞，一個蛋白毒素（如RIP）分子就足以殺死一個腫瘤細胞，而小分子藥物要達到同樣的腫瘤細胞殺滅效果，則至少需要104～105個分子[8]。不過，針對腫瘤細胞核糖體發(fā)揮作用的蛋白毒素藥物需要進入細胞才能發(fā)揮作用，而CPP介導給藥技術則為解決這一問題提供了一個極具前景的重要手段。Yang研究團隊分別通過化學偶聯(lián)和蛋白融合的方式，成功獲得了連接有CPP Tat或低分子質量魚精蛋白（LMWP）的RIP Gelonin，其具有較好的體內外腫瘤抑制活性。酶活性實驗顯示，經(jīng)CPP修飾和無修飾的Gelonin其N-糖苷酶活性相當，表明CPP的引入并不影響蛋白藥物的固有活性。細胞實驗顯示，CPP修飾的Gelonin其細胞毒性較未修飾的Gelonin高100多倍，表明CPP能顯著提高蛋白藥物的入胞效率。體內實驗也顯示，CPP能攜帶Gelonin進入腫瘤組織，發(fā)揮抑瘤作用；與無修飾的Gelonin相比，連接有CPP的Gelonin不僅在同等劑量下抑瘤作用顯著，在更低劑量下亦具有明顯的抑瘤優(yōu)勢[9-11]。另外，Shin等[4,9]將ATTEMPTS系統(tǒng)經(jīng)一系列修飾后，成功地應用于RIP的輸送。該研究團隊將肝素修飾的癌胚抗原單克隆抗體與CPP修飾的Gelonin通過靜電吸附作用構建了藥物復合物，并將其用于小鼠皮下移植腫瘤模型。結果發(fā)現(xiàn)，藥物復合物中的抗體可發(fā)揮靶向功能，介導復合物輸送至腫瘤部位；然后在魚精蛋白作用下，CPP修飾的Gelonin從復合物中解離釋放，令暴露的CPP成功地介導Gelonin輸送入腫瘤組織/細胞，發(fā)揮抑瘤作用。

1.2 穿膜肽-抗體

在腫瘤治療領域，抗體藥物占據(jù)越來越重要的地位，且已有多個該類重磅藥物被開發(fā)出來?？贵w藥物通過拮抗相應的受體或抗原，抑制腫瘤生長的信號通路，從而發(fā)揮治療作用，如抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體[12]和抗人表皮生長因子受體-2（HER2）抗體[13]。然而，由于存在“結合位點屏障”（binding-site barrier），即抗體與腫瘤組織表面抗原或受體結合后會形成一層物理屏障，從而阻礙后續(xù)抗體的進入；并且抗體在腫瘤組織中擴散緩慢，難以有效進入到腫瘤組織的深部（Fujimori等,J Nucl Med, 1990年)。而CPP的連接修飾可有效提高抗體在腫瘤內部的穿透能力，改善抗體類蛋白藥物的腫瘤治療效果。

實驗研究顯示，將HIV-Tat 的37 ～ 62位氨基酸肽段與抗腫瘤抗體Fab片段連接后，可明顯提高抗體片段的細胞攝取量（Anderson等,Biochem Biophys Res Commun, 1993年)；抗Akt單鏈抗體多變區(qū)與來源于Kaposi成纖維細胞生長因子的CPP相連接后，抑瘤效果得到很大提升[14]；CPP的連接修飾可顯著延長單鏈抗體在腫瘤中的滯留，從而增強抗體對腫瘤的殺傷力[15]。

此外，CPP與抗體的連接還可以應用于腫瘤的診斷。如，Reilly團隊將Tat與抗表皮生長因子（EGF）誘導的p21抗體相連接，用于乳腺腫瘤的診斷[16-18]。而且，該團隊還將這個方法用于探測放射性免疫偶聯(lián)物(radioimmunoconjugate, RIC)對曲妥珠單抗誘導的p27蛋白表達水平，實驗結果顯示，連接有CPP的111In-antip27-TAT在細胞中的滯留時間相對延長，從而可以更準確有效地檢測到p27(kip1)蛋白表達水平[19]。

1.3 穿膜肽-促凋亡因子

實體腫瘤中存在著低氧區(qū)域，這些區(qū)域對化療和放療不敏感。腫瘤組織通常富含缺氧誘導因子 (hypoxia-

induced factor, HIF)（Huang等 ,Proc Natl Acad Sci USA, 1998年)，HIF-1α 結構中具有一個氧依賴性降解域（oxygen-dependent degradation domain, ODD）， 該 氨基酸序列遇氧會發(fā)生降解。據(jù)此，Harada等[20]構建了一種由Tat、ODD和凋亡酶原pro-Caspase-3構成的融合蛋白Tat-ODD-pro-Caspase-3，這種蛋白在缺氧條件下（如腫瘤組織中）具有穩(wěn)定性，而pro-Caspase-3可被激活成Caspase-3，從而激活細胞凋亡程序；但在含氧環(huán)境（如正常組織）中，由于融合蛋白所含的ODD會被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)迅速降解，導致Tat與pro-Caspase-3分離而無法將其帶入細胞中發(fā)揮作用。荷瘤小鼠實驗顯示，Tat-ODD-pro-Caspase-3的靜注可產生很好的腫瘤殺傷效果。此外，還有研究者采用同樣技術構建了Tat-ODD-p53融合蛋白，用于輸送腫瘤抑制蛋白p53。體外實驗顯示，Tat-ODD-p53可促進H1299細胞凋亡。荷瘤小鼠實驗也表明，此融合蛋白具有明顯的抑瘤作用[21-22]。

1.4 穿膜肽-熱激蛋白

熱激蛋白又稱熱休克蛋白（heat shock proteins, HSP），是一種在高溫或低溫、高鹽、缺水等微環(huán)境中生物體內正常蛋白的合成受到抑制時誘導合成的新的或功能增強的應激蛋白，它可通過泛素-蛋白酶體通路清除嚴重受損的蛋白質，幫助新合成的蛋白質正確折疊，提高細胞對應激原的耐受性[23]。在腫瘤免疫中，HSP70充當多重角色：一方面，它可以作為“分子伴侶”參與腫瘤細胞的功能代謝，保護腫瘤細胞免受損害；另一方面，它可以與腫瘤特異性多肽相結合，并將其遞送到抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells, APC），從而激活T細胞，在參與腫瘤抗原的免疫反應中發(fā)揮著重要作用[24]。因此，HSP作為腫瘤疫苗可以刺激腫瘤特異性免疫反應，激發(fā)腫瘤特異性CD8+T細胞的增殖和殺傷作用，從而抑制腫瘤的生長。另外，HSP對抗腫瘤的作用還體現(xiàn)在，它可以通過提高分子伴侶疫苗的抗原結合能力、對抗免疫抑制性腫瘤微環(huán)境等作用來促進細胞毒淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）進入腫瘤并發(fā)揮作用[25]。

有研究者將HSP70與CPP Tat進行融合，結果發(fā)現(xiàn)，Tat-HSP70融合蛋白可提高HSP70的穿膜能力，并在細胞內聚積，從而顯著增強HSP的細胞保護作用及其他功能[25]。

2 用于糖尿病治療

胰島素是臨床上治療糖尿病的首選藥物。然而，受限于在無創(chuàng)性給藥方式中較差的藥代動力學表現(xiàn)和作為蛋白藥物的低穩(wěn)定性等詬病，目前臨床使用的胰島素只能以注射為給藥方式，因而患者依從性差。所以，非注射途徑給藥劑型，如可口服、經(jīng)皮或鼻腔給藥等新的胰島素制劑的研究與開發(fā)，一直是制藥領域的重點與熱點。其中，胰島素口服給藥劑型研究得最多。然而，胰島素在胃腸道不僅不易吸收，還極易被酶解，且跨越生理屏障時其穩(wěn)定性會受到極大影響[26]。

CPP介導給藥技術為提高口服胰島素的吸收提供了一個極具潛力的策略。例如，有研究者采用化學偶聯(lián)方法將胰島素與Tat連接，結果，體外實驗顯示，Tat-胰島素的腸道吸收效率是未修飾胰島素的6～8倍，同時它保留了胰島素的完整活性[27]。在另一項研究中，研究人員使用聚乙二醇（PEG）作為連接臂，將CPP LMWP與胰島素進行偶聯(lián)，結果，體外實驗顯示，相較于無修飾胰島素，胰島素-PEG-LMWP對腸黏膜單層細胞的穿越能力提高了5倍；且動物實驗也證實CPP的修飾可以顯著提高胰島素的生物利用度[28]。

3 用于腦部疾病治療

血腦屏障能夠選擇性阻止某些外源性物質（如病原體和治療藥物）從血液循環(huán)系統(tǒng)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而阻礙藥物在腦部發(fā)揮作用，成為腦部疾病治療的一大瓶頸。20世紀末，Dowdy研究團隊便發(fā)表論文揭示，CPP可攜帶蛋白穿過致密的完整血腦屏障（Schwarze等,Science, 1999年)。這是蛋白/多肽類藥物腦部輸送研究的突破性進展。其后，CPP介導腦部給藥的研究獲得了進一步的顯著發(fā)展。例如，將Tat連接于功能性蛋白（如Bcl-xL、D-JNKI1等），用于治療缺血性神經(jīng)壞死，結果顯示，Tat的修飾可提高這些蛋白藥物在腦部的濃度，顯著減少卒中模型小鼠腦部缺血性神經(jīng)細胞的凋亡，從而減少腦部梗死體積和神經(jīng)損傷[29-30]。還有研究人員將一種由39個氨基酸組成的CPP分別融合到β-半乳糖

苷酶和腦源性神經(jīng)因子（BDNF）上，從而提高了這兩種蛋白進入神經(jīng)中樞的效率[31]。

鼻腔和中樞神經(jīng)系統(tǒng)間在解剖生理上存在著嗅神經(jīng)通路，所以鼻腔給藥可成為克服血腦屏障進行藥物輸送的途徑之一。但是，蛋白藥物很難穿過鼻黏膜，這使得通過鼻腔給藥途徑輸送蛋白藥物的生物利用度很低。而利用CPP介導給藥技術，可以有效解決這一問題。胰島素在抵抗神經(jīng)退行性疾病中具有重要的作用，因此，腦部輸送胰島素藥物，可能為此類疾病提供極具潛力的治療手段。有研究表明，采用Tat修飾裝載有胰島素的聚乳酸聚乙醇酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic)acid, PLGA]，可有效地將胰島素經(jīng)鼻-腦通路輸送至腦內[32]。

4 用于心臟疾病治療

心肌細胞上表達有一種名為GaTa4的轉錄因子，在發(fā)生缺血性心肌病時，心肌細胞會上調GaTa4因子，該因子可以上調降壓基因，使細胞代償性肥大，從而降低心肌損傷，調節(jié)心臟的壓力性反射[33]。Bian等[34]建立了成纖維細胞穩(wěn)轉株，可表達GaTa4因子和CPP VP22的融合蛋白GaTa4-VP22，并將這種成纖維細胞與間充質干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，MSC中GaTa4誘導性基因troponin1的表達量升高；同時，研究還發(fā)現(xiàn)，GaTa4-VP22進入細胞后可以改善心肌梗死模型鼠的血管重塑，并增強其心臟功能。

5 用于疫苗輸送

抗原進入體內后，會被相應的免疫細胞捕獲、呈遞及加工。采用化學偶聯(lián)或基因重組的方法使CPP與抗原結合，可提高抗原進入免疫細胞的效率，從而提高該抗原的免疫效果[35]。

Justesen等[36]將Tat與p53的融合蛋白rTat-p53輸送到樹突狀細胞，以此激發(fā)小鼠p53特異性的T細胞免疫。且有研究顯示，小泰勒蟲抗原Tp2與Tat重組得到的融合蛋白Tat-Tp2，能增強CD8+T細胞反應的興奮性[37]；CPP Tat在明顯促進T細胞對HSP gp96攝取的同時，還能輕微減少gp96自身相互聚集，從而增強gp96介導的乙肝病毒特異性T細胞免疫反應及其抗病毒功效[38]。此外，CPP Tat與Ag85B的連接產物也被用作針對結核分枝桿菌的疫苗[39]。

透皮免疫（transcutaneous immunization, TCI）是一種新型免疫給藥方式，具有接種效率高、安全性高、耐受性好等優(yōu)點。然而，角質層屏障、大分子疫苗在表皮組織內的擴散及靶向于樹突狀細胞（dendritic cells, DC），是TCI所面臨的難題。筆者所在課題組將甘露糖基化低分子聚乙烯亞胺（PEI）共價連接CPP，并將其用作靶向高表達甘露糖受體的DC的DNA疫苗輸送載體，通過微針免疫技術，成功地應用于黑色素瘤的TCI治療。該項研究表明，PEI-CPP作為載體可顯著提高基因疫苗復合物的免疫效果：針對Trp-2的細胞特異性免疫反應得以增強，并有效激活CD8+細胞毒T淋巴細胞，同時促進CD4+T細胞分泌γ干擾素和白細胞介素-12，且此TCI治療成功抑制了腫瘤的生長，延長了荷瘤小鼠的存活時間[40]。

6 結語

CPP序列中富含精氨酸，例如最常用的Tat，其序列為GGGYGRKKRRQRRR。目前，針對CPP介導藥物入胞的機制研究已有許多，一般認為CPP介導藥物入胞的方式有多種，如與細胞表面分子結合后以內吞途徑入胞，或通過靜電作用直接跨膜入胞，或與細胞膜靜電結合后誘導脂質分子形成瞬時通路入胞。這些機制有的是能量依賴型，有的是非能量依賴型。CPP介導蛋白/多肽類藥物輸送系統(tǒng)正在從基礎研發(fā)向臨床轉化，現(xiàn)有多個基于CPP穿給藥技術的大分子藥物，如KAI-9803、XG-102、AZX100等，已進入臨床試驗。

然而，CPP強大的穿膜作用是一把雙刃劍，既能幫助藥物克服體內輸送的生理屏障，同時亦帶來了新的問題：由于它的穿透作用缺乏特異性，因此全身給藥時會導致其所攜藥物的廣泛分布，從而增加藥物在正常臟器的暴露量，加大了潛在的毒副作用風險。所以，在保持CPP穿膜功能的同時，提高其對病理組織的靶向性，是影響CPP技術臨床應用的關鍵問題，也是今后CPP技術臨床應用研究的重要方向。

[1]Tufts Center for the Study of Drug Development.Biotech products in big pharma clinical pipelines have grown dramatically[R]//Tufts Center for the Study of Drug Development Impact Reports.Boston: Tufts Center for the Study of Drug Development, 2013.

[2]ülo Langel.Cell-Penetrating Peptides: Methods and Protocols[M].New York: Humana Press, 2011.

[3]Dietz G P, B?hr M.Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach[J].Mol Cell Neurosci, 2004, 27(2): 85-131.

[4]Huang Y, Jiang Y, Wang H,et al.Curb challenges of the "Trojan Horse" approach: smart strategies in achieving effective yet safe cell-penetrating peptide-based drug delivery[J].Adv Drug Deliv Rev, 2013, 65(10): 1299-1315.

[5]Huang Y, Park Y S, Wang J,et al.ATTEMPTS system: a macromolecular prodrug strategy for cancer drug delivery[J].Curr Pharm Des, 2010, 16(21): 2369-2376.

[6]Ye J, Shin M C, Liang Q,et al.15 years of ATTEMPTS: a macromolecular drug delivery system based on the CPP-mediated intracellular drug delivery and antibody targeting[J].J Control Release, 2015, 205: 58-69.

[7]Shin M C, Zhang J, Min K A,et al.Combination of antibody targeting and PTD-mediated intracellular toxin delivery for colorectal cancer therapy[J].J Control Release, 2014, 194: 197-210.

[8]Hall W A.Immunotoxin treatment of brain tumors[J].Methods Mol Biol, 2001, 166: 139-154.

[9]Shin M C, Zhao J, Zhang J,et al.Recombinant TAT-gelonin fusion toxin: synthesis and characterization of heparin/protamine-regulated cell transduction[J].J Biomed Mater Res A, 2015, 103(1): 409-419.

[10]Shin M C, Zhang J, David A E,et al.Chemically and biologically synthesized CPP-modifed gelonin for enhanced anti-tumor activity[J].J Control Release, 2013, 172: 169-178.

[11]Park Y J, Chang L C, Liang J F,et al.Nontoxic membrane translocation peptide from protamine, low molecular weight protamine (LMWP), for enhanced intracellular protein delivery:in vitroandin vivostudy[J].FASEB J, 2005, 19(11) 1555-1557.

[12]Lien S, Lowman H B.Therapeutic anti-VEGF antibodies[J].Handb Exp Pharmacol, 2008, (181): 131-150.

[13]Pedersen M W, Jacobsen H J, Koefoed K,et al.Targeting three distinct HER2 domains with a recombinant antibody mixture overcomes trastuzumab resistance[J].Mol Cancer Ther, 2015, 14(3): 669-680

[14]Shin I, Edl J, Biswas S,et al.Proapoptotic activity of cell-permeable anti-Akt single-chain antibodies[J].Cancer Res, 2005, 65(7): 2815-2824.

[15]Jain M, Chauhan S C, Singh A P,et al.Penetratin improves tumor retention of single-chain antibodies: a novel step toward optimization of radioimmunotherapy of solid tumors[J].Cancer Res, 2005, 65(17): 7840-7846.

[16]Hu M, Chen P, Wang J,et al.Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2006, 33(3): 301-310.

[17]Hu M, Wang J, Chen P,et al.HIV-1 Tat peptide immunoconjugates differentially sensitize breast cancer cells to selected antiproliferative agents that induce the cyclin-dependent kinase inhibitor p21WAF-1/ CIP-1[J].Bioconjug Chem, 2006, 17(5): 1280-1287.

[18]Hu M, Chen P, Wang J,et al.123I-labeled HIV-1 tat peptide radioimmunoconjugates are imported into the nucleus of human breast cancer cells and functionally interactin vitroandin vivowith the cyclin-dependent kinase inhibitor, p21(WAF-1/Cip-1)[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2007, 34(3): 368-377.

[19]Cornelissen B, Kersemans V, McLarty K,et al.In vivomonitoring of intranuclear p27(kip1) protein expression in breast cancer cells during trastuzumab (Herceptin) therapy[J].Nucl Med Biol, 2009, 36(7): 811-819.

[20]Harada H, Hiraoka M, Kizaka-Kondoh S.Antitumor effect of TAT-oxygen-dependent degradation-caspase-3 fusion protein specifically stabilized and activated in hypoxic tumor cells[J].Cancer Res, 2002, 62(7): 2013-2018.

[21]Yu Z, Wu J, Wu S,et al.A recombinant cell-permeable p53 fusion protein is selectively stabilized under hypoxia and inhibits tumor cell growth[J].Cancer Lett, 2009, 279(1): 101-107.

[22]Lee J H, Lu H.Chimeric p53 as an alternative therapy for hypoxic tumors[J].Cancer Biol Ther, 2011, 11(1): 108-110.

[23]De Maio A.Extracellular heat shock proteins, cellular export vesicles, and the Stress Observation System: a form of communication during injury, infection, and cell damage.It is never known how far a contro-

versial finding will go! Dedicated to Ferruccio Ritossa[J].Cell Stress Chaperones, 2011, 16(3): 235-249.

[24]Rappa F, Farina F, Zummo G,et al.HSP-molecular chaperones in cancer biogenesis and tumor therapy: an overview[J].Anticancer Res, 2012, 32(12): 5139-5150.

[25]Calderwood S K, Stevenson M A, Murshid A.Heat shock proteins, autoimmunity, and cancer treatment[J].Autoimmune Dis, 2012, 2012: 486069.

[26]Khafagy el-S, Morishita M, Onuki Y,et al.Current challenges in noninvasive insulin delivery systems: a comparative review[J].Adv Drug Deliv Rev, 2007, 59(15): 1521-1546.

[27]Liang J F, Yang V C.Insulin-cell penetrating peptide hybrids with improved intestinal absorption efficiency[J].Biochem Biophys Res Commun, 2005, 335(3): 734-738.

[28]He H, Sheng J, David A E,et al.The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption[J].Biomaterials, 2013, 34(31): 7733-7743.

[29]Cao G, Pei W, Ge H,et al.In vivodelivery of a Bcl-xL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis[J].J Neurosci, 2002, 22(13): 5423-5431.

[30]Hirt L, Badaut J, Thevenet J,et al.D-JNKI1, a cell-penetrating c-Jun-N-terminal kinase inhibitor, protects against cell death in severe cerebral ischemia[J].Stroke, 2004, 35(7): 1738-1743.

[31]Fu A, Wang Y, Zhan L,et al.Targeted delivery of proteins into the central nervous system mediated by rabies virus glycoprotein-derived peptide[J].Pharm Res, 2012, 29(6): 1562-1569.

[32]Yan L, Wang H Y, Jiang Y F,et al.Cell-penetrating peptide-modifed PLGA nanoparticles for enhanced nose-to-brain macromolecular delivery[J].Macromol Res, 2013, 21: 435-441.

[33]Bisping E, Ikeda S, Kong S W,et al.Gata4 is required for maintenance of postnatal cardiac function and protection from pressure overloadinduced heart failure[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(39): 14471-14476.

[34]Bian J, Popovic Z B, Benejam C,et al.Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy[J].Circ Res, 2007, 100(11): 1626-1633.

[35]Jiang Y, Li M, Zhang Z,et al.Cell-penetrating peptides as delivery enhancers for vaccine[J].Curr Pharm Biotechnol, 2014, 15(3): 256-266.

[36]Justesen S, Buus S, Claesson M H,et al.Addition of TAT protein transduction domain and GrpE to human p53 provides soluble fusion proteins that can be transduced into dendritic cells and elicit p53-specifc T-cell responses in HLA-A*0201 transgenic mice[J].Immunology, 2007, 122(3): 326-334.

[37]Tinega A N, Pellé R, Kang'a S,et al.Fusion of a cell penetrating peptide from HIV-1 TAT to the Theileria parva antigen Tp2 enhances the stimulation of bovine CD8+T cell responses[J].Vet Immunol Immunopathol, 2009, 130(1/2): 107-113.

[38]Zhao B, Wang Y, Zhang Y,et al.TAT-mediated gp96 transduction to APCs enhances gp96-induced antiviral and antitumor T cell responses[J].Vaccine, 2013, 31(3): 545-552.

[39]張榮波, 王文洋, 胡東, 等.TAT-Ag85B蛋白疫苗的制備和抗結核分枝桿菌效果評價[J], 細胞與分子免疫學雜志, 2015, 31(1): 49-53.

[40]Hu Y, Xu B, Xu J,et al.Microneedle-assisted dendritic cell-targeted nanoparticles for transcutaneous DNA immunization[J].Polym Chem, 2015, 6(3): 373-379.

[專家介紹] 黃永焯：研究員，博士生導師。1999年和2002年在廣州中醫(yī)藥大學分別獲學士和碩士，2005年于浙江大學獲博士學位，2005-2010年在美國密歇根大學藥學院進行博士后研究。2010年入選中國科學院百人計劃，同年7月進入中國科學院上海藥物研究所工作，任研究員，課題組長。2011年入選上海市浦江人才計劃，2013年獲中國藥學會-賽諾菲青年生物藥物獎，2014年獲國家自然科學基金優(yōu)秀青年基金?，F(xiàn)任上海市藥劑專業(yè)委員會委員、世中聯(lián)中藥藥理專業(yè)委員會委員，并擔任Heliyon、中國現(xiàn)代應用藥學、中藥新藥與臨床藥理雜志等刊物的編委。近5年在Angew Chem Int Ed、Adv Mater、Adv Func Mater、Adv Drug Deliv Rev、J Control Release、Biomaterials、Theranostics、J Mater Chem、Polym Chem等雜志發(fā)表SCI論文40篇。研究方向包括：1）經(jīng)皮新劑型與新技術；2）生物技術藥物輸送系統(tǒng)研究；3）新型藥物給藥技術克服多藥耐藥腫瘤。

Recent Developments in Cell-penetrating Peptidemediated Protein/Peptide Drug Delivery

ZHANG Yajie1,2, CHEN Yingzhi1, YANG Victor C.2,3, HUANG Yongzhuo1
(1.Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China; 2.Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnosis, School of Pharmacy, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 3.College of Pharmacy, University of Michigan, Ann Arbor 48109, USA)

Protein/peptide drugs have received great attention and recognition, and taken a growing share in drug development.However, intracellular delivery has become an essential issue for many protein/peptide drugs that need to enter the cells for achieving pharmacological actions.Cell-penetrating peptides (CPPs) are rich in arginine, which enables them not only to penetrate cell membrane effciently, but also to carry a variety of macromolecules into cells.Therefore, CPPs have been widely applied in drug delivery, and especially, CPP-based technique is considered as the promising solution to overcome the barriers against effective intracellular protein delivery.This article provided emphatically an overview on recent development in CPP-mediated protein/peptide drug delivery for treatment of various diseases.

cell-penetrating peptide; protein; peptide; intracellular delivery

R943

A

1001-5094（2015）04-0270-07

接受日期：2015-02-17

項目資助：國家自然科學基金(No.81373357, 81422048, 81172996, 81361140344)

*通訊作者：黃永焯，研究員，博士生導師；

研究方向：經(jīng)皮新劑型與新技術，生物技術藥物輸送系統(tǒng)研究，新型藥物給藥技術克服多藥耐藥腫瘤；

Tel：021-20231000-1401；E-mail：yzhuang@mail.shcnc.ac.cn