高磊雷曉光1，*

(1北京大學化學與分子工程學院化學生物學系 北京100871;2北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院 北京100730;3北京生命科學研究所 北京102206)

隨著人類基因組計劃的完成，人類已經進入了后基因組時代。如何確定每個基因所對應蛋白的功能成為遺傳學家所面臨的難題。傳統(tǒng)的遺傳學研究方法主要是利用各種基因突變來改變所研究生物體的遺傳基因，從而獲得可穩(wěn)定遺傳的變異體，并利用變異體來確定基因或者蛋白的功能。雖然我們利用模式生物，通過傳統(tǒng)的遺傳學研究方法，已經確定了許多基因的功能，但這種方法也存在著許多不足［1-2］:①許多基因具有遺傳冗余性，突變其中之一并不會出現遺傳性狀的改變;②某些基因對于生物體來講非常重要，突變了該基因使得生物體無法存活;③對于繁殖速率慢，個體較大，基因組是多倍體的哺乳動物來說，得到穩(wěn)定遺傳的突變體是很困難的;④對于復雜系統(tǒng)來講，某些蛋白的功能可以通過其他方式來調控(例如磷酸化、去磷酸化)，并不能通過簡單的減少其表達來確定其功能［3］。生物活性小分子能夠與特定蛋白質相互作用，并可以條件性地改變靶標蛋白的功能和活性，所以克服了基因冗余和基因致死等難題，這種新的遺傳學研究的方法被稱為化學遺傳學(chemical genetics)［4］。由于生物活性小分子可以隨時加入或移除，這使得化學遺傳學除了克服基因冗余和基因致死等難題外，還有與生俱來的優(yōu)勢——時空可控性。正因為化學遺傳學的這些優(yōu)勢，使得它在現代藥物靶點的發(fā)現上扮演著越來越重要的角色［3］。

1 化學遺傳學的發(fā)展歷史

化學遺傳學是建立在兩個前提之上的:①生物活性小分子能夠獲得;②這些小分子能夠與生物體內的靶標蛋白(或稱為受體)結合［1］?；瘜W遺傳學概念的雛形最早可以追溯到幾百年甚至幾千年前，那時人們已經開始使用天然產物來治療一些病癥。例如，早在公元前15世紀，古埃及人就利用柳樹皮的提取物來治療頭疼、發(fā)燒或者炎癥。但在當時，人們并不清楚在柳樹皮提取物中的有效化學成分是什么，更不清楚它的作用機制。在18世紀，許多研究者開始意識到，在植物提取液中，可能是某一種單一的成分作用于動物的某個部位。1804年，第一個生物活性小分子——嗎啡被Friedrich Sertürner從罌粟中分離出來，證實了人們的猜想。在1826年前后，柳樹皮中治療頭痛的有效成分——水楊酸(著名的阿司匹林就是水楊酸的衍生物)也被分離出來。這些具有生物活性的天然產物的分離不僅推動了近現代制藥工業(yè)的發(fā)展，更重要的是奠定了化學遺傳學發(fā)展的基礎，使人們認識到，單一化合物就可以具有生物學活性。

雖然當時人們已經認識到，在柳樹皮提取液中，是水楊酸發(fā)揮著藥效，但并不清楚它的作用機制。在19世紀早期，Francois Magendie和Claude Bernard提出，這些生物活性小分子可能作用于身體的某些部位;隨后Rudolf Buchheim認識到，藥物的生物學活性可能是由于藥物分子與細胞內組分發(fā)生了生物化學反應而引起的;直到20世紀初，Paul Ehrlich才提出了受體的概念，他把受體定義為“小分子唯一的特定蛋白靶標”。對于化學遺傳學來說，受體的提出是一個重大的突破，它使人們開始重視和利用生物活性小分子與蛋白的相互作用，這使化學遺傳學研究方法逐步走向成熟。

化學遺傳學的發(fā)展是建立在有機合成特別是天然產物全合成的基礎之上的。隨著天然產物分離和有機合成技術的日趨成熟，越來越多的生物活性小分子被合成出來(例如雷帕霉素、紫杉醇等)。這些化合物往往表現出良好的生物學活性，吸引著科學家去找尋它們的受體。作為化學遺傳學的奠基人之一，哈佛大學的Stuart Schreiber教授無疑是其中的佼佼者。從他1981年獨立工作以來，他與合作者合成了許多具有非常重要生物活性的天然產物，包括FK506、lactacystin、trapoxin等。通過化學遺傳學的研究方法，1988年，Stuart Schreiber發(fā)現了FK506受體蛋白——FKBP12，闡明了免疫抑制劑FK506是通過構成FKBP12-FK506-鈣調磷酸酶三元復合體來抑制鈣調磷酸酶的活性［5］;1995年，他使用氚標記的方法，發(fā)現lactacystin可以特異性地與20S蛋白酶體結合［6］;1997年，他利用從微生物中分離出來的一種環(huán)五肽類天然產物——trapoxin，找到了一種全新功能的蛋白——組蛋白去乙?；?HDAC)［7］。組蛋白去乙?；傅陌l(fā)現不僅給抗癌藥物的研發(fā)帶來了新的思路，更對表觀遺傳學的發(fā)展有著深刻的影響。1997年，他因在化學合成方面的貢獻和對生物學及醫(yī)學的間接影響而獲得了四面體有機化學創(chuàng)新獎(Tetrahedron Prize for Creativity in Organic Chemistry)。在隨后的1998年，他發(fā)表了名為《Chemical Genetics Resulting from a Passion for Synthetic Organic Chemistry》的綜述，介紹了把這種利用有機小分子配體來研究蛋白功能的方法定義為化學遺傳學(chemical genetics)的理由和自己是如何走上化學遺傳學這條道路［8］。從此，化學遺傳學的概念越來越受到人們的關注和認同。

2 傳統(tǒng)遺傳學和化學遺傳學

在研究某一生物學系統(tǒng)的功能時，常用的方法就是通過打破該系統(tǒng)的平衡來觀察和分析該系統(tǒng)被擾動后的功能變化。而打破生物學系統(tǒng)平衡的最傳統(tǒng)的方式就是基因突變，這種遺傳學研究方法被稱為經典遺傳學(classic genetics)。經典遺傳學根據研究過程的不同可以分為兩類［9］(圖1A):①如果我們對一個已知基因的功能感興趣，我們可以對其進行突變，然后觀察突變之后的表型變化，這樣就能知道該基因的功能，這種由基因到表型的研究方法被稱為反向遺傳學(reverse genetics);②對細胞進行隨機突變，得到大量的突變體，在這些突變體中找到感興趣的表型，最后再找到對應的基因，這種由表型到基因的方法叫做正向遺傳學(forward genetics)。打破生物學系統(tǒng)平衡的另一種方式是利用生物活性小分子與其受體的相互作用來引起某個生物學系統(tǒng)改變的方式，而這種方法就是化學遺傳學。與經典遺傳學類似，化學遺傳學也可以分為正向化學遺傳學(forward chemical genetics)和反向化學遺傳學(reverse chemical genetics)，如圖1B所示［9］。一般來講，正向化學遺傳學研究過程遵循著以下步驟:①利用高通量篩選技術(HTS)對已有的化合物庫進行大規(guī)模篩選(目的與正向遺傳學中的隨機突變類似);②找到能引起感興趣表型的生物活性小分子;③利用這個分子來找到靶標蛋白。如果我們對某個已知的蛋白的功能比較感興趣，就可以利用反向遺傳學的方法來研究其功能:①利用HTS技術對已有的化合物庫進行篩選，找到能與該蛋白特異性結合的小分子;②將該小分子加入到生物體中進行共培養(yǎng)，觀察生物體表型和功能的變化;③將蛋白和表型或功能變化直接關聯起來，就能知道該蛋白的生物學功能。

圖1 經典遺傳學和化學遺傳學的實驗流程

從化學遺傳學研究方法的實驗流程可以看出，快速篩選技術(例如高通量篩選技術)的發(fā)展對于化學遺傳學的進步有著深刻的影響，它使我們能夠簡單高效地對某個表型或者實驗現象進行成百上千次的篩選。其次，化學遺傳學的發(fā)展也離不開能快速合成結構多樣、數目龐大的化合物庫的技術，例如組合化學(combinatorial synthesis)、固相合成化學(solid phase synthesis)和多樣性導向合成(diversity oriented synthesis)。這些技術使快速合成結構多樣的小分子有機化合物成為現實;而后商業(yè)用小分子化合物庫的出現，極大地促進了化學遺傳學方法的普及。再次，對于正向化學遺傳學來說，利用小分子探針從復雜的生物體系中找到其特異性靶標蛋白的技術，例如蛋白質親和層析技術，也是一個不可缺少的工具;而對于反向化學遺傳學來說，蛋白質的表達和純化技術是重中之重。此外，其他技術［10-11］也對化學遺傳學的發(fā)展起著推動作用。例如，蛋白質結晶學幫助了生物學家了解蛋白的結構和功能，而在此基礎上，化學家利用計算機模擬技術就能更準確地設計和合成該蛋白的小分子配體，極大地推動了反向遺傳學研究方法的應用。

3 化學遺傳學在藥物靶標發(fā)現上的應用

3.1 發(fā)現全新的生物靶點和生物作用機制

在真核細胞內，遺傳信息——基因存在于染色體上，而染色體主要是由組蛋白包裹著DNA折疊而成。組蛋白末端在一般情況下由于賴氨酸和精氨酸的存在而帶正電荷，正電荷會幫助組蛋白包裹帶負電的DNA。一旦賴氨酸或者精氨酸的氨基被乙?；?，那么組蛋白的正電荷消失，使得染色小體的結構變得松散，轉錄因子能夠與啟動子結合而促進某些基因的轉錄和翻譯。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)的作用就是脫去組蛋白近氨基端賴氨酸上的乙?；鶊F，使得組蛋白帶正電，這樣組蛋白就能夠與DNA更緊密結合，從而阻止了該區(qū)域基因的轉錄和翻譯。在早期研究中，曲古抑菌素和一種來源于微生物的環(huán)五肽類天然產物——trapoxin被證明可以抑制組蛋白去乙?；倪^程，但具體的機制并不是很清楚。1996年，Stuart Schreiber等人通過研究結構和活性關系(SAR)，發(fā)現親電基團環(huán)氧酮對于抑制組蛋白去乙?；潜夭豢缮俚幕钚曰鶊F。隨后，他們利用全合成的技術，合成了氚取代的trapoxin和探針分子(圖2)，利用蛋白質親和標記及親和層析的方法找到了一個全新功能的蛋白——組蛋白去乙?；福?］。至此，有機小分子trapoxin抑制組蛋白去乙酰化過程的機制不再是個謎:trapoxin和N-乙?；嚢彼釒缀跏请娮拥扰诺?，所以trapoxin可以作為一個競爭性的底物與組蛋白去乙酰化酶結合，結合之后，親電基團環(huán)氧酮能夠與組蛋白去乙?；富钚晕稽c上富含電子的氮原子反應，這樣使得組蛋白去乙?；覆豢赡娴厥セ钚浴＠谜蚧瘜W遺傳學的方法，Stuart Schreiber等人不僅發(fā)現表觀遺傳學里最重要的蛋白之一——組蛋白去乙?；福€為癌癥治療帶了新的思路。例如，2006年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準了用于治療皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)的組蛋白去乙?；敢种苿┧幬铩⒅Z他(vorinostat)。

圖2 trapoxin探針合成及其作用機理研究

3.2 發(fā)現已知生物靶點的新的調控機制或生物學功能

2009年起，本實驗室系統(tǒng)地研究了具有復雜結構的倍半萜內酯類天然產物的全合成。以相同的倍半萜內酯單體(dehydrozaluzanin C)作為合成前體，利用集成全合成策略，我們實現了對結構更加復雜的二倍體(ainsliadimers A and B)［12］和三倍體(ainsliatrimers A and B)［13］的仿生合成。在隨后的生物學活性研究上，我們發(fā)現ainsliatrimers A能通過誘導凋亡的方式殺死癌細胞，但這類天然產物的作用機理并不清楚。利用多樣化合成和生物正交反應的策略，我們實現了ainsliatrimers A在HeLa細胞內的熒光定位，發(fā)現其靶蛋白位于細胞核內(圖3)。

圖3 利用天然產物ainsliatrimers A的分子探針來探尋細胞內蛋白靶標的過程

接下來，我們將基于ainsliatrimers A的小分子探針與HeLa細胞核提取物進行共孵育，利用“pull-down”和肽質量指紋圖譜分析(peptide mass fingerprinting analysis)，我們找到了兩個最可能的核蛋白——過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)和組蛋白去乙?；?(HDAC2)。為了進一步確定ainsliatrimers A的靶標蛋白，我們利用RNA干擾技術分別對這兩個蛋白進行Knockdown實驗。實驗結果顯示，降低PPARγ的表達能夠明顯減弱ainsliatrimers A的細胞毒性;而降低HDAC2的表達并不能提高ainsliatrimers A處理下的HeLa細胞存活率。這些結果顯示，ainsliatrimers A的靶標蛋白是PPARγ而不是HDAC2［14］。

本實驗室除了利用天然產物作為生物活性小分子來探索其蛋白靶標外，也通過高通量篩選來找到有生物活性的有機小分子，并利用這類小分子來進行化學遺傳學相關研究。細胞壞死是細胞死亡的另一個途徑，但相比于“凋亡”來說，其具體的細胞學機制并不清楚。2009年，王曉東課題組［15］及另兩個課題組——Francis Ka-Ming Chan課題組［16］和韓家淮課題組［17］先后在《Cell》和《Science》上發(fā)表文章，闡明了受體相互作用蛋白3(RIP3)在受體相互作用蛋白1(RIP1)介導的細胞程序性壞死中起著重要作用，但RIP3下游的靶標蛋白卻仍是個謎。2012年，本實驗室與王曉東實驗室合作，建立了細胞壞死小分子抑制劑的高通量篩選模型，從大約有20萬個化合物的小分子庫中篩選到一個先導化合物(IC50≈1μmol/L)，隨后對其進行結構優(yōu)化，得到作用于RIP3下游通路的生物活性小分子——necrosulfonamide(NSA，IC50≤0.2μmol/L)，并將其改造成為小分子探針。通過利用免疫沉淀和質譜分析，我們發(fā)現混合連接激酶結構域樣蛋白(MLKL)可以與RIP3相互作用，隨后利用小分子探針進行“pull-down”實驗，找出的靶標蛋白正是MLKL，這說明MLKL很可能是RIP3下游的底物。我們通過研究結構和活性關系(SAR)，發(fā)現在NSA中，α，β-不飽和酮結構對于該小分子與MLKL的N端片段相互作用是必不可少的。由此，我們推測，MLKL可能通過半胱氨酸上的巰基與不飽和酮形成不可逆的共價鍵，從而抑制了細胞壞死(圖4)。通過比較人和小鼠的MLKL的N端片段，我們發(fā)現，在這一區(qū)域內，除了86位半胱氨酸外，人源MLKL的所有半胱氨酸都與小鼠相同，而該小分子僅僅能與人源MLKL結合而不能與鼠源MLKL結合，所以我們推測是86位的半胱氨酸與該分子形成了共價鍵。隨后我們把86位半胱氨酸突變成絲氨酸，發(fā)現該小分子失去了抑制細胞壞死的活性且不能與人源MLKL結合，這進一步證實了該小分子是通過與86位半胱氨酸形成共價鍵來抑制細胞壞死的。為了進一步證實MLKL是RIP3的底物，我們在體外對RIP3和MLKL進行培養(yǎng)，隨后對MLKL進行質譜分析，發(fā)現MLKL的357位的蘇氨酸和358位的絲氨酸被RIP3磷酸化。這說明MLKL就是RIP3在細胞壞死信號通路中的底物，它對于細胞壞死非常重要［18］。

圖4 利用正向化學遺傳學的方法發(fā)現RIP3下游底物蛋白——MLKL

4 總結與展望

許多生物學知識都來源于經典遺傳學，然而僅僅利用經典遺傳學方法來探索生物學系統(tǒng)的功能是不夠的?；瘜W遺傳學研究方法是利用可透過細胞膜的生物活性小分子來快速、可逆、條件性地干擾靶標蛋白的功能，從而實現對生物學系統(tǒng)功能的定量時空可控?；瘜W遺傳學作為經典遺傳學方法的補充和延伸，很好地克服了經典遺傳學研究方法所面臨的困難，進一步推動了我們對生物學的了解和認知。目前來講，化學遺傳學研究還面臨著一些挑戰(zhàn)，例如:如何高效產生結構不同且復雜的生物活性小分子;如何克服生物活性小分子在生物系統(tǒng)中存在的多效性難題(off targets效應)等。但我們相信，隨著有機合成技術的完善、蛋白結構信息的積累以及一些新技術的出現，化學遺傳學研究方法將進一步推動生物學、醫(yī)學等領域的發(fā)展，給人類社會帶來巨大的進步。

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