呂穎瑩 王吉鳴 李均 馮靖祎

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)工科，浙江杭州310003

流式微球分析技術(shù)檢測重組人干擾素α-2b治療的慢性乙肝患者血清干擾素-α濃度

呂穎瑩 王吉鳴 李均 馮靖祎▲

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)工科，浙江杭州310003

目的探討流式微球分析技術(shù)檢測重組人干擾素α-2b（安福?。┲委煹穆砸腋位颊哐甯蓴_素-α濃度的可行性。方法采集2012年6月～2014年10月的健康體檢者和安福隆治療的慢性乙肝患者血清及臨床資料，采用流式微球分析技術(shù)檢測慢性乙肝患者治療組和健康體檢人群血清干擾素-α濃度，并與ELISA方法進(jìn)行比較。結(jié)果重組人干擾素α-2b治療的慢性乙肝患者血清標(biāo)本中，CBA法檢測血清IFN-α的含量范圍為15.85～641.40 pg/mL，其濃度為（145.65±35.42）pg/mL；而ELISA法檢測IFN-α的含量范圍為10.43～495.90 pg/mL，其濃度為（113.73± 26.47）pg/mL；CBA法檢測慢性乙肝治療組IFN-α的含量略優(yōu)于ELISA法（t=5.137，P=0.0065）。CBA法和ELISA法檢測健康對(duì)照組中血清IFN-α的含量分別為（3.56±0.96）pg/mL和（3.49±0.92）pg/mL。結(jié)論流式微球分析技術(shù)能夠很好檢測血清中的干擾素-α的濃度，為臨床上監(jiān)測IFN-α治療的慢性乙肝患者血清中的IFN-α的濃度提供參考價(jià)值。

流式微球分析技術(shù)；干擾素-α；ELISA

目前，干擾素-α（IFN-α）在治療感染性疾病特別是慢性乙肝患者中發(fā)揮著重要的作用，不僅能夠有效地阻斷病毒繁殖和復(fù)制，降低肝癌和肝纖維化的發(fā)生，而且干擾素-α有效地促進(jìn)機(jī)體的免疫功能，起到抗病毒的作用[1-3]。此外干擾素-α的血清濃度與治療的效果密切相關(guān)[3-5]，因此選擇合適的方法準(zhǔn)確可靠地檢測干擾素-α的濃度是提高患者治療效果的關(guān)鍵。目前流式微球分析技術(shù)（CBA）逐漸用于檢測血清中的細(xì)胞因子[6，7]，而對(duì)干擾素-α濃度的方法研究相對(duì)較少，本研究通過比較分析流式微球分析技術(shù)檢測慢性乙肝患者和健康體檢者血清干擾素-α的濃度，并與ELISA方法進(jìn)行比較，為臨床上合理地檢測IFN-α治療的慢性乙肝患者血清中的干擾素-α濃度提供參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年6月~2014年10月30例健康體檢者，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院提供，35例重組人干擾素α-2b（安福?。┲委熉砸腋位颊叩难鍢?biāo)本由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和湖州市中心醫(yī)院提供。慢性乙肝患者中男24例，女11例，年齡21～52歲，平均（33.2±9.1）歲；健康體檢者中男22例，女8例，年齡20～51歲，平均（34.7±10.2）歲。

1.2 材料

血清IFN-α流式微球檢測試劑盒（No.560379）、FACSCalibur流式細(xì)胞儀和熒光校準(zhǔn)微球，均購于BD公司；血清IFN-α ELISA檢測試劑盒（No.BMS216）購于eBioscience公司；酶標(biāo)儀（iMark）購于BIO-RAD公司。1.3方法

1.3.1 流式微球分析技術(shù)①空白對(duì)照1孔，加樣本稀釋液50 μL；②樣本孔各1孔，取1∶4稀釋的樣本50 μL加入到孔中；③樣本孔和對(duì)照孔中分別加入50 μL的捕獲磁珠，混勻后室溫孵育1 h；④每孔加入50 μL的PE標(biāo)記檢測抗體，室溫避光孵育2 h；⑤每孔加入1 mL洗滌液，200 g離心5 min，并棄去上清；⑥每管加入300 μL洗滌液后混勻并上機(jī)檢測。標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度為2500 pg/mL，通過倍比稀釋為：1250.0、625.0、312.5、156.0、80.0、40.0、20.0、10.0 pg/mL。計(jì)數(shù)>500個(gè)，得到每個(gè)測定樣本的熒光強(qiáng)度。

1.3.2 ELISA方法①空白對(duì)照2孔，加樣本稀釋液100 μL；②樣本孔各2孔，80 μL稀釋液和20 μL樣本到樣本孔；③樣本孔和對(duì)照孔中分別加入50 μL HRP標(biāo)記的酶結(jié)合物，室溫孵育2 h；④用洗液洗板3次；⑤每孔加入TMB底物顯色液100 μL，室溫孵育10 min；⑥加入100 μL終止液，于1 h內(nèi)用450 nm波長的酶標(biāo)儀檢測分析。標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度為1000 pg/mL，通過倍比稀釋為：500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6、7.8 pg/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graph Pad統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩種方法檢測結(jié)果的比價(jià)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，年齡比較采用非參數(shù)U檢驗(yàn)，性別采用四格表的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CBA與ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

血清IFN-α濃度的檢測，首先要建立良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，CBA法中標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度為2500 pg/mL，通過倍比稀釋為：1250.0、625.0、312.5、156.0、80.0、40.0、20.0、10.0 pg/mL。計(jì)數(shù)>500個(gè)，得到每個(gè)測定樣本的熒光強(qiáng)度（圖1A）；ELISA法中標(biāo)準(zhǔn)品初始濃度為1000 pg/mL，通過倍比稀釋為：500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6、7.8 pg/mL，用450 nm波長的酶標(biāo)儀檢測分析（圖1B）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果顯示兩種方法的線性均較好（R2=0.999），但CBA的線性范圍更大，為3.9～1250.0 pg/mL；而ELISA法的范圍僅為7.8～500.0 pg/mL。

圖1 IFN-α標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立A.CBA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；B.ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 CBA與ELISA方法檢測血清IFN-α的表達(dá)量

健康體檢組和慢性乙肝組的年齡（U=484.5，P= 0.5983）和性別（χ2=0.1771，P=0.6739）均匹配。安福隆IFN-α治療慢性乙肝患者的血清標(biāo)本中，CBA法能夠檢測出血清中IFN-α的含量（圖2）。35例慢性乙肝患者治療前，CBA法檢測的濃度分別為（2.95±0.76）pg/mL，安福隆IFN-α治療患者的血清標(biāo)本中，CBA法檢測血清IFN-α的含量范圍為15.85～641.40 pg/mL，平均濃度為（145.65±35.42）pg/mL；而ELISA法檢測治療前IFN-α的濃度為（2.85±0.54）pg/mL，治療后IFN-α含量范圍為10.43～495.90 pg/mL，平均濃度為（113.73± 26.47）pg/mL；流式微球分析技術(shù)和ELISA方法分別檢測30例健康對(duì)照組中血清IFN-α的含量分別為（3.56±0.96）和（3.49±0.92）pg/mL。見表1。

圖2 CBA法檢測血清中IFN-α的表達(dá)量

表1 CBA與ELISA法檢測血清IFN-α的含量（s，pg/mL）

表1 CBA與ELISA法檢測血清IFN-α的含量（s，pg/mL）

方法健康對(duì)照組慢性乙肝組治療前治療后C B A E L I S A t值P值2 . 9 5 ± 0 . 7 6 2 . 8 5 ± 0 . 5 4 1 . 3 1 4 0 . 2 3 2 5 1 4 5 . 6 5 ± 3 5 . 4 2 1 1 3 . 7 3 ± 2 6 . 4 7 5 . 1 3 7 0 . 0 0 6 5 3 . 5 6 ± 0 . 9 6 3 . 4 9 ± 0 . 9 2 1 . 2 7 8 0 . 2 1 1 5

3 討論

流式微球分析技術(shù)（cytometric beads array，CBA）是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，它是流式細(xì)胞術(shù)與熒光微球相結(jié)合的成果。其實(shí)驗(yàn)或檢測中的數(shù)據(jù)收集和分析是通過聚苯乙烯熒光微球上鎖攜帶的信號(hào)來完成，而不再是細(xì)胞。流式微球分析技術(shù)是將聚苯乙烯微球、熒光染料標(biāo)記系統(tǒng)、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、數(shù)據(jù)分析軟件及流式細(xì)胞儀有機(jī)地整合在一起而產(chǎn)生的新技術(shù)，又被稱為“液態(tài)生物芯片”[6-8]。

流式微球分析技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA基本一致，主要采用雙抗體夾心的免疫檢測模式，但有ELISA無法比擬的優(yōu)越性。比如通量大：一次可同時(shí)分析多種不同的細(xì)胞因子，而ELISA每次只能分析單一成分；此外還具有樣本用量少，特異性強(qiáng)，敏感度高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此流式微球分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床及生物樣品的蛋白檢測中，如細(xì)胞因子的檢測（IL-4、IL-6、IL-10等）、組織配型及自身抗體的檢測等[7-10]。

目前，國內(nèi)外對(duì)于血清中IFN-α的檢測主要應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），放射免疫法及免疫印跡法（Western blot）等，由于其檢測結(jié)果的重復(fù)性差，方法的本身缺陷，且需要的樣本量較大等缺點(diǎn)，導(dǎo)致臨床應(yīng)用較少。因此流式微球分析技術(shù)在檢測血清學(xué)中細(xì)胞因子（IFN-α）等可溶性蛋白中，將有非常廣闊的研究和應(yīng)用價(jià)值[9，10]。我國是一個(gè)乙肝大國，IFN-α的治療目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，相關(guān)藥物濃度的檢測和監(jiān)測研究相對(duì)較少[11-14]。

本研究中，我們應(yīng)用流式微球分析技術(shù)和ELISA方法分別檢測IFN-α的濃度，其標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示其線性均較好（R2=0.999），但CBA法比ELISA法的線性范圍更大，提示CBA法的敏感性較ELISA發(fā)更高。此外，兩種方法分別檢測健康體檢者和慢性乙肝患者治療前和安福隆治療后血清中IFN-α的濃度，結(jié)果顯示，CBA法檢測治療組血清IFN-α的含量范圍（15.85～641.40 pg/mL）比ELISA法檢測治療組IFN-α的含量范圍（10.43～495.90 pg/mL）更大（t=5.137，P=0.0065），提示ELISA法對(duì)高濃度的IFN-α含量檢測存在局限性。此外兩種方法對(duì)健康對(duì)照組（t=1.278，P=0.2115）和治療前（t=1.314，P=0.2325）血清IFN-α的含量分別沒有明顯差異，提示健康體檢者和慢性乙肝患者血清中的IFN-α含量均較低，其檢測的結(jié)果與靈敏度有關(guān)，與其他研究結(jié)果基本一致[1，3]。

總之，應(yīng)用流式微球分析技術(shù)檢測安福隆等藥物治療的慢性乙肝患者血清中IFN-α的濃度，略優(yōu)于ELISA法，為建立合理的干擾素-α治療濃度體系奠定基礎(chǔ)，為臨床合理應(yīng)用干擾素治療慢性乙肝患者提供新的思路，對(duì)提高患者的療效和減少其經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)具有重要的推廣價(jià)值。

[1]Yeh ML，Peng CY，Dai CY，et al.Pegylated-interferon alpha therapy for treatment-experienced chronic hepatitis B patients[J].PLoS One，2015，10（4）：e0122259.

[2]Mihm S.Activation of Type I and TypeⅢInterferons in Chronic Hepatitis C[J].J Innate Immun，2015，7（3）：251-259.

[3]Zhang YL，Zhang J，Cui LY.Interferon-α combined with lamivudine versus lamivudine monotherapy for the emergence of YMDD mutations inchronic hepatitis B infection：A meta-analysis of randomized controlled trials[J].Hepatogastroenterology，2015，62（137）：133-139.

[4]Guo P.Suppression of interferon-mediated antiviral immunity by hepatitis B virus：An overview of research progress[J].Scand J Immunol，2013，78（3）：230-237.

[5]Brunetto MR，Bonino F.Interferon therapy of chronic hepatitis B[J].Intervirology，2014，57（3-4）：163-170.

[6]Zhang F，Zou M，Li J，et al.Cytometric microsphere array for subtyping avian influenza virus[J].Viral Immunol，2011，24（5）：403-407.

[7]Mayali X，Palenik B，Burton RS.Dynamics of marine bacterial and phytoplankton populations using multiplex liquid bead array technology[J].Environ Microbiol，2010，12（4）：975-989.

[8]Fujiwara K，Shimano K，Tanaka H，et al.Application of bead array technology to simultaneous detection of human leucocyte antigen and human platelet antigen antibodies[J]. Vox Sang，2009，96（3）：244-251.

[9]張潔，林遠(yuǎn)，金伯泉.流式微球載體技術(shù)在檢測腎綜合征出血熱患者血清特異性抗體和細(xì)胞因子中的應(yīng)用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25（3）：245-247.

[10]李金霖，黃艷，張瓊麗，等.流式微球技術(shù)檢測血小板膜糖蛋白自身抗體的方法建立及臨床價(jià)值[J].臨床血液學(xué)雜志，2010，23（3）：285-288.

[11]黃湛鐮，趙志新，鄧洪，等.聚乙二醇干擾素-2a聯(lián)合短程拉米夫定治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎的療效[J].中華肝臟病雜志，2010，18（6）：419-422.

[12]王蜀強(qiáng)，徐開菊，吳家，等.不同療程干擾素聯(lián)合核苷（酸）類似物治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎的療效[J].中華肝臟病雜志，2011，19（10）：785-786.

[13]李茂莢，袁學(xué)蘭，張丸惠.聚乙二醇干擾素單用或聯(lián)合核苷（酸）類似物治療慢性乙型肝炎療效與安全性的薈萃分析[J].中華肝臟病雜志，2012，20（6）：442-447.

[14]劉漢屈，秦波.干擾素治療慢性乙型肝炎的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2009，17（18）：1803-1808.

The detection of serum IFN-α concentration in the of hepatitis B patients treated with recombinant interferon α-2b by cytometric bead array

LV YingyingWANG JimingLI JunFENG Jingyi
Department of Medical Engineering,the First Affiliated Hospital,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310003,China

Objective To explore the feasibility of the cytometric bead array(CBA)in detecting concentration of interferon-alpha(IFN-α)in the serum of chronic hepatitis B(CHB)patients treated with recombinant interferon α-2b(Anferon). Methods The sera and clinical data of the healthy controls and the CHB patients treated with Anferon were collected from Jun 2012 to Oct 2014,IFN-α concentration was detected in the sera of healthy controls and CHB patients treated with Anferon by CBA method,comparing with ELISA method.Results In the serum of CHB patients treated with recombinant interferon α-2b,the IFN-α concentration tested with CBA method ranged from 15.85 to 641.40 pg/mL,was (145.65±35.42)pg/mL;concentration detected with ELISA method was(113.73±26.47)pg/mL,ranged from 10.43 to 495.90 pg/mL.The CBA method was slightly better than that of ELISA method in detecting the serum IFN-α concentration from CHB patients after treatment(t=5.137，P=0.0065).The concentration of IFN-α serum in healthy controls tested by CBA and ELISA method was(3.56±0.96)and(3.49±0.92)pg/mL,respectively.Conclusion The CBA method can detect serum IFN-α concentration,which provides reference value for clinical monitoring of IFN-α in the serum of CHB patients treated with interferon-alpha.

Cytometric bead array;Interferon-alpha;ELISA

R512.6

A

1673-9701（2015）24-0011-03

2015-05-21）

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C37049）

▲通訊作者