馬文文，姚 拓，蒲小鵬，盧 虎，張玉霞，王國基(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

東祁連山7種禾草根際溶磷菌篩選及其溶磷特性

馬文文，姚 拓，蒲小鵬，盧 虎，張玉霞，王國基
(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

采用PKO無機磷和蒙金娜有機磷選擇性培養(yǎng)基，從東祁連山(甘肅省天?？h及周邊地區(qū))天然草地上的7種禾草根際分離出溶解無機磷菌株109株，溶解有機磷菌株143株。各菌株生長速度及形態(tài)特征差異較大。7種禾草根際溶解無機和有機磷菌株數量，除醉馬草(Achnatheruminebrians)溶解無機磷呈根表土壤>根系表面>根內的分布趨勢外，其他均呈現(xiàn)出根系表面>根表土壤>根內的分布趨勢。大部分溶解無機磷菌株在10 d時溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)不再增大，而溶解有機磷菌株則在14 d時不再增大。利用鉬藍比色法測定菌株溶磷能力，結果表明，109株溶解無機磷菌株培養(yǎng)液中有效磷含量在0.47～582.46 μg·mL-1，最大為菌株PCRP5；143株溶解有機磷菌株培養(yǎng)液中有效磷含量在0.07～14.76 μg·mL-1，最大為菌株MCMRS4；蒙金娜培養(yǎng)基pH與有機磷菌株有效磷含量無顯著相關性(P>0.05)，PKO培養(yǎng)基pH與無機磷菌株有效磷含量之間呈極顯著負相關(P<0.01)。

禾草；無機溶磷菌；有機溶磷菌；溶磷性能

磷是植物生長所需的大量、重要營養(yǎng)元素。目前，我國農牧業(yè)生產中，磷肥的主要來源是化肥，化肥在作物、蔬菜、牧草的產量提高方面起到了巨大作用，同時出現(xiàn)了不少弊端[1]。如隨著化肥使用量的增加，土壤結構遭到破壞，環(huán)境受到污染，微生物多樣性下降等。我國耕地土壤74%缺磷，但土壤中95%的磷為無效形式，很難被植物直接吸收與利用，且施入磷肥中的大部分磷和土壤中的Fe2+、Fe3+、Ca2+及Al3+結合形成難溶性磷酸鹽[2-4]。因此，開發(fā)利用新興肥料替代化肥已是當務之急，微生物肥料的開發(fā)與研究在提高土壤的養(yǎng)分利用率、改善土壤狀況及調節(jié)土壤肥力方面起著巨大作用[5]。而溶磷微生物通過釋放有機酸等，溶解難溶性磷酸鹽或者分泌磷酸酶以降解有機磷，從而提高土壤中可溶性磷的濃度，使之有效地被植物吸收與利用[6]。

溶磷菌自被發(fā)現(xiàn)以來，很多學者進行了大量研究。前蘇聯(lián)學者Mehknha于1935年首次從黑鈣土壤中分離出一株形態(tài)與巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)相似的解磷細菌，能夠分解核酸和卵磷脂，施入土壤后使P2O5提高了15%以上[7]。近些年，國內外有關溶磷菌研究的報道很多[8-13]，多集中在菌株對植物的促生作用，如郜春花等[14]利用溶磷菌株B2和B67研制的菌劑，通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，施用了溶磷菌劑后，玉米(Zeamays)株高、干質量和鮮質量較對照有較大幅度的增加；張英等[15]采用溶磷復合接種劑處理紅三葉(Trifoliumpratense)種子發(fā)現(xiàn)，處理后紅三葉的株高和根長較對照增加了33.62%和46.20%。因此，從不同植物根際篩選高效的溶磷菌對植物的生長有重要作用。

目前，植物根際溶磷菌研究涉及到很多植物，如燕麥(Avenasativa)[16]、小麥(Triticumaestivum)，玉米、甘蔗(Saccharumofficinarum)[17]，水稻(Oryzasativa)[18]，國外有雀稗(Paspalumspp.)[19]、玉蜀黍[20]等，但對東祁連山天然草地禾草，如高原早熟禾(Poaalpigena)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、醉馬草(Achnatheruminebrians)、賴草(Leymussecalinus)、冰草(Agropyroncristatum)、紫花針茅(Stipapurpurea)、糙毛鵝觀草(Roegneriahirsuta)等根際溶磷菌資源的研究尚未見報道。這7種禾草是東祁連山天然草地中常見的植物，其中高原早熟禾適應性強、耐寒、耐旱、綠期長，經培育后,可作為適宜高寒氣候條件的草坪草種。垂穗披堿草具很強的可塑性，耐瘠薄，適應北方各種類型的土壤，耐牧性強，產草量高。賴草耐旱、耐寒，耐輕度鹽漬化土壤，而且適應范圍廣，從暖溫帶、中溫帶的森林草原到干草原、荒漠草原、草原化荒漠。冰草、紫花針茅及糙毛鵝觀草都有豐富的營養(yǎng)價值，家畜都喜食。醉馬草雖是有毒植物，但其營養(yǎng)價值高，若使用新疫苗免疫動物，可使動物安全地利用醉馬草，從而減少人工挖除醉馬草與化學除草等造成的環(huán)境污染、草地退化和水土流失等現(xiàn)象。本研究從東祁連山天然草地主要禾草根際分離篩選高效溶磷菌并研究其溶磷特性，以期為高寒地區(qū)研制高效復合接種劑提供菌種，同時豐富促生菌資源庫。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)自然概況

東祁連山天然草地，以甘肅省天祝縣高寒草地為主，輻射周邊地區(qū)，位于37°11′-37°13′ N，102°29′-102°33′ E。平均海拔2 700～3 300 m，氣候潮濕陰冷，空氣稀薄且紫外線輻射強烈。該區(qū)年降水量416 mm,且多為地形雨，集中于7、8和9月，年蒸發(fā)量1 592 mm；年平均溫度-0.1 ℃，1月均溫-18.3 ℃，7月均溫12.7 ℃，>0 ℃年積溫為1 380 ℃·d；水熱同期，年日照時數為2 600 h；沒有絕對無霜期，只有冷、熱兩季，春季常出現(xiàn)旱象，且有暴風雪。

1.2 研究材料與方法

2012年9月在放牧強度小的圍欄內天然草地上采樣。在7種禾草(高原早熟禾、垂穗披堿草、醉馬草、賴草、冰草、紫花針茅和糙毛鵝觀草)樣地類型內采用“S”型取樣法，設1 m×1 m樣方5個，在每個樣方內用75%乙醇消毒后的土鏟，挖取各植物根際(根系和土壤)樣品。7種禾草的5份樣品分別裝入無菌聚乙烯袋中，放入標簽，封口，置于冰筒中帶回實驗室立即進行溶磷菌分離、篩選[21]。

1.2.1 溶磷菌的篩選

1)培養(yǎng)基。分離溶解無機磷菌用PKO培養(yǎng)基[22]；分離溶解有機磷菌用蒙金娜培養(yǎng)基[23-24]；保存用LB培養(yǎng)基[25]。

2)溶磷圈法篩選溶磷菌。將采集的7種禾草根系上的虛土抖掉后，按常規(guī)細菌分離法[22]涂布樣品懸液于PKO和蒙金娜培養(yǎng)基上，待菌落長出后，挑取PKO、蒙金娜培養(yǎng)基上菌落大、生長快、具有明顯溶磷圈的單個菌落，劃線法接種于對應的培養(yǎng)基上，直至獲得純的單個菌落，再點接種于含難溶性磷酸鈣的PKO和含蛋黃卵磷脂的蒙金娜固體培養(yǎng)基上進行溶磷菌株篩選[22]。最后保存于LB斜面培養(yǎng)基中(4 ℃)。

1.2.2 溶磷菌溶磷能力測定

1)按常規(guī)法制作磷標準曲線[21]。

2)定性測定。將保存于LB斜面培養(yǎng)基中的菌株，活化后用接菌針挑取單個菌落點接種于PKO無機磷和蒙金娜有機磷平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在5、7、10、14和16 d時測量每個菌株形成的溶磷圈大小。根據溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)初步確定各菌株是否有溶磷能力。

3)定量測定。將50 mL液體PKO無機磷(或蒙金娜有機磷)培養(yǎng)基裝入150 mL三角瓶，121 ℃滅菌30 min，冷卻后，分別將0.5 mL各待測菌株懸浮液(108 cfu·mL-1)接種于裝有培養(yǎng)基的三角瓶中。每菌株分別設3個重復，以不接菌的基礎培養(yǎng)基為對照。將上述三角瓶于28 ℃、160 r·min-1搖床上培養(yǎng)10 d后，用酸度計測定各個培養(yǎng)液pH值。接著將培養(yǎng)液在轉速為10 000 r·min-1的離心機上于4 ℃離心15 min，取上清液5 mL轉入150 mL三角瓶中。用鉬藍比色法測定扣除對照后各個菌株有效磷增量(μg·mL-1)[26]，其計算公式如下。

式中，ρ為從標準曲線上查得有效磷的濃度(μg·mL-1)，Ts為分取倍數，V0為測定發(fā)酵液的體積(mL)，V為顯色時定容體積(mL)。

1.3 數據處理

基本數據分析和繪圖采用Microsoft Excel 2003軟件，方差分析和相關性分析采用SPSS軟件，成對比較采用One-way ANOVA和LSD法，菌株溶磷能力與pH之間的相關性采用Pearson相關分析。所有數值以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 不同植物根際溶磷菌株數量及分布特征

2.1.1 禾草根際溶解無機磷菌株的數量及分布特征 采用PKO選擇性培養(yǎng)基從7種供試禾草根際分離出生長較快、菌落較大、有明顯溶磷透明圈的溶解無機磷菌109株(表1)，其中，紫花針茅根際分離到的菌株最多，占總無機磷菌株的19.27%；糙毛鵝觀草根際分離到的菌株僅次于紫花針茅，占16.51%；從垂穗披堿草根際分離的菌株與糙毛鵝觀草相近，占15.60%左右；高原早熟禾分離到的菌株較少，占12.84%；醉馬草、賴草和冰草根際分離到的菌株數量相同，各占總無機磷菌株的11.93%。7種禾草根際溶解無機磷菌株數量，除醉馬草呈根表土壤>根系表面>根內的分布趨勢,冰草根表土壤和根內數量相同外，其他均呈現(xiàn)出根系表面>根表土壤>根內的分布趨勢。

2.1.2 禾草根際溶解有機磷菌株的數量及分布特征 采用蒙金娜選擇性培養(yǎng)基從7種供試植物根際分離得到具有生長較快、菌落較大、有明顯溶磷透明圈的溶解有機磷菌143株(表2)，其中，高原早熟禾根際分離得到的菌株數量最多，占總有機磷菌株的19.58%；分離自紫花針茅和糙毛鵝觀草根際的菌株數量相同，僅次于高原早熟禾，各占16.78%；垂穗披堿草根際分離到的菌株居中，占13.27%；醉馬草根際分離到的菌株數量僅比垂穗披堿草少1株，占12.59%；從賴草根際分離的菌株較少，占11.19%；冰草根際分離到的菌株數量最少，占9.79%。7種禾草根際溶解有機磷菌株數量均呈現(xiàn)出根系表面>根表土壤>根內的分布趨勢。

表1 溶解無機磷菌株來源及數量Table 1 Sources and numbers of inorganic phosphate-solubilizing bacteria

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2、表4、表5同。

Note: Different lower case letters within the same column mean significant difference at 0.05 level. The same in Table 2, Table 4 and Table 5.

表2 溶解有機磷菌株來源及數量Table 2 Sources and numbers of organic phosphate-solubilizing bacteria

2.2 菌株溶磷特征

2.2.1 分離獲得的菌株 將109株溶解無機磷菌逐一進行編號，每個編號前加大寫字母“P”，同理，將143株溶解有機磷菌編號前加大寫字母“M”(表3)；“P”和“M”后的字母“G”為高原早熟禾首字母，“C”為垂穗披堿草首字母，“Z”為醉馬草首字母，“L”為賴草首字母，“B”為冰草首字母，“ZH”為紫花針茅前兩字首字母，“CM”為糙毛鵝觀草前兩字首字母；“RS”代表根表土壤，“RP”代表根系表面，“HP”代表根內。大于3個以上的用“-”表示(表3)。

2.2.2 菌株溶磷能力的時間動態(tài)特征 利用平板溶磷圈法對平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)的供試菌株的溶磷能力進行了測定，結果表明，溶解無機磷菌和有機磷菌溶磷圈大小各異。分別在5、7、10、14、16 d時測量各菌株形成的溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)大小，計算其比值(D/d)。測得從糙毛鵝觀草中分離出的61.11%溶解無機磷菌株D/d值在10 d時不再增大(圖1)，從高原早熟禾中分離出的64.29%溶解無機磷菌株D/d值在10d時也不再增大(圖2)，從垂穗披堿草、醉馬草、賴草、冰草、紫花針茅中分別分離出52.94%、69.23%、61.54%、53.85%、61.90%的溶解無機磷菌株的D/d值都在10 d時不再增大，其余少數溶解無機磷菌株D/d值在10 d以后繼續(xù)增長，14 d后不再增大；從賴草中分離出的93.75%溶解有機磷菌株的D/d值在14 d時不再增大(圖3)，從垂穗披堿草中分離出的73.68%溶解有機磷菌株的D/d值在14 d時也不再增大(圖4)，從醉馬草、高原早熟禾、冰草、紫花針茅、糙毛鵝觀草中分別分離出的61.11%、82.35%、64.29%、79.17%、83.33%的溶解有機磷菌株的D/d在14 d時不再變大，其余少數溶解有機磷菌株的D/d值在14 d以后繼續(xù)變大。

表3 分離獲得的菌株編號Table 3 Code of the ioslated strains

圖1 糙毛鵝觀草中溶解無機磷菌株溶磷動態(tài)變化Fig.1 Changes of the inorganic phosphate-solubilization inRoegneriahirsute

2.2.3 菌株溶磷能力特征 運用鉬藍比色法對菌株的溶磷能力進行了測定，結果表明，109株溶解無機磷菌培養(yǎng)液中有效磷含量變化較大，在0.47～582.46 μg·mL-1；大于50 μg·mL-1菌株占總溶解無機磷菌株的15.60%，且菌株間差異顯著(P<0.05)，菌株PCRP5培養(yǎng)液中有效磷含量最大(表4)。143株溶解有機磷菌培養(yǎng)液中有效磷含量較低，但各菌株間差異較大，范圍在0.07～14.76 μg·mL-1；大于5 μg·mL-1菌株只占總溶解有機磷菌株的9.09%，除MGRS5和MCMRS1無顯著差異外(P>0.05)，其余菌株之間差異顯著，其中含效磷含量最高的菌株為MCMRS4(表5)。

圖3 賴草中溶解有機磷菌株溶磷動態(tài)變化Fig.3 Changes of the organic phosphate-solubilization inLeymussecalinus

圖4 垂穗披堿草中溶解有機磷菌株溶磷動態(tài)變化Fig.4 Changes of the organic phosphate-solubilization inElymusnutans

表4 部分菌株處理溶磷量與pH值(PKO)Table 4 P solubilization and pH of some strains(PKO)

2.2.4 菌株溶磷能力與pH的相關性 溶解無機磷和溶解有機磷菌株培養(yǎng)液中pH較對照(不接菌的基礎培養(yǎng)液)都有所降低，運用相關性回歸分析培養(yǎng)液中有效磷含量與pH的相關性，發(fā)現(xiàn)蒙金娜培養(yǎng)基中pH與有機磷菌株有效磷含量無顯著相關性(P>0.05)，PKO培養(yǎng)基中pH與無機磷菌株有效磷含量之間呈極顯著負相關(P<0.01)，線性回歸方程為：y=-285.76x+1 768.03，R2=0.734。

表5 部分菌株處理溶磷量與pH值(蒙金娜)Table 5 P solubilization and pH of some strains(Mehknha)

2.3 優(yōu)良溶磷菌株的菌落特征

通過溶磷圈法和鉬藍比色法篩選出具有明顯溶磷圈且溶磷能力較高的優(yōu)良菌株在LB培養(yǎng)基上純培養(yǎng)，觀察、記錄菌落的特征發(fā)現(xiàn)，各個菌株特性生長速度、顏色、形狀、邊緣完整度、隆起度以及表面狀況表現(xiàn)出不同的差異性。菌株顏色除PCRP8為黃色、PBRP5為栗色外，其他基本為米黃色、灰白色及乳白色3種顏色；表面狀況除PLRP2微干外，其他菌株大體保持濕潤狀；菌落形狀為圓形、近圓形和橢圓形；邊緣大都為完整、波浪狀或鋸齒狀3種類型；隆起度也僅為凸起、微凸和平坦。

3 討論與結論

3.1 不同植物根際溶磷菌數量及分布

7種禾草根際溶解無機和有機磷菌株數量差異較大，與各植物所處區(qū)域土壤肥力、水熱狀況及植物本身有關[27]。細菌所需營養(yǎng)主要來源于植物殘體，不同的植物必然導致細菌在各植物中分布的不均一性[28]。從7種禾草根際分離出的溶解無機和有機磷菌株的數量，除醉馬草根際溶解無機磷菌呈根表土壤>根系表面>根內，冰草根表土壤和根內數量相同外，其他均呈現(xiàn)根系表面>根表土壤>根內的分布趨勢，這與張英等[15]、姚拓[16]的研究結果大體一致，在土壤表層和植物根系表層土壤細菌分布密集，積累的枯枝落葉和根系分泌物也多，可為細菌生長提供豐富的營養(yǎng)[29]。醉馬草中分離出的溶解無機磷菌的數量在根表土壤中分布最多，可能與根表土壤中微生物分泌的有機酸(如甲酸、醋酸、羥基乙酸、丙酸、乙醇酸、延胡索酸、乳酸、丁二酸等)種類、數量有關，有機酸可與土壤中的Ca、Mg、Fe、Al等元素的陽離子進行螯合作用，從而減少了可固定磷酸根的陽離子，增加了土壤磷酸根離子的活性，使難溶性磷酸鹽溶解。具體原因有待進一步的研究。

3.2 不同植物根際溶磷特征

平板溶磷圈法測定菌株的溶磷能力，發(fā)現(xiàn)溶解無機磷和有機磷菌株的溶磷圈大小各異。溶磷圈與菌落直徑大小的比值(D/d)隨著時間變化而變化，大多數溶解無機磷菌株的D/d值在10 d 時處于穩(wěn)定狀態(tài)，絕大多數溶解有機磷菌株的在14 d 時趨于穩(wěn)定，出現(xiàn)這種結果的原因，一方面與培養(yǎng)基中所含的磷酸鈣和蛋黃卵磷脂多少有密切關系[30-31]，另一方面可能與試驗中無法保證每個培養(yǎng)皿中均含有相同體積的培養(yǎng)基有關。鉬藍比色法測得不同菌株的溶磷能力差異較大，與菌株自身分泌物質的多少有關[30-31]。

該研究中大部分無機磷可被轉化成可溶性磷被植物吸收，而絕大部分有機磷不能完全被轉化為有效磷被植物吸收利用。這可作為今后研究的重點之一，因為土壤中不僅有無機磷的存在，還有大量的有機磷，如果不能被植物充分利用，相當于丟棄了大量的磷資源。篩選高效溶解磷能力的菌株為今后微生物肥料的制作提供了優(yōu)勢菌株資源。

溶磷微生物在呼吸過程中釋放出大量的CO2，CO2溶于水中變?yōu)樘妓幔谷芙鉄o機磷菌和溶解有機磷菌的培養(yǎng)液中pH 值較對照(不接菌的基礎培養(yǎng)液)降低。蒙金娜培養(yǎng)基pH 與溶解有機磷菌株培養(yǎng)液中有效磷含量無顯著相關性(P>0.05)，該結果與林啟美等[32]的研究一致；而PKO培養(yǎng)基pH 與溶解無機磷菌株培養(yǎng)液中有效磷含量之間極顯著負相關(P<0.01)，這與張英[33]的測定結果一致。說明培養(yǎng)液中pH值的下降，并不是溶磷菌溶磷的唯一條件。

本研究從7種供試植物根際分離出溶解無機磷菌109株和溶解有機磷菌143株。其中109株無機磷菌株培養(yǎng)液中有效磷含量在0.47～582.46 μg·mL-1，最大有效磷含量菌株為PCRP5；143株溶解有機磷菌株培養(yǎng)液中有效磷含量較低，在0.07～14.76 μg·mL-1，最大有效磷含量菌株為MCMRS4；溶解無機磷菌株相對于溶解有機磷菌株，有效磷含量較大。菌株溶磷特征差異較大。篩選出的部分菌株具有較大研究和開發(fā)潛力。

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(責任編輯 王芳)

Screening and characteristics of phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere of 7 grasses on eastern Qilian Mountains

MA Wen-wen, YAO Tuo, PU Xiao-peng, LU Hu, ZHANG Yu-xia, WANG Guo-ji
(Pratacultural College, Gansu Agricultural University; Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education, Lanzhou 730070, China)

Phosphate dissolving bacteria had been isolated from rhizosphere of 7 kinds of grasses based on PKO and Mehknha culture media. The results showed that there were different colony characteristics in growth rate, color, shape, edge integrity, as well as the surface condition of the ridge in different bacteria strains. The number of inorganic phosphate solubilizing strains from rhizosphere ofAchnatheruminebriansshowed that soil adhering to roots>rhizoplan or surface of roots>histoplan or interior of roots, strains from others grasses were rhizoplan or surface of roots>soil adhering to roots>histoplan or interior of roots distribution trend. In the first 10 days, most of the dissolved inorganic phosphorus strain’s D/d stabilized, but most of the dissolved organic phosphorus strain stabilized in the first 14 d. Phosphorus solubilizing capability of the strains were determined by the molybdenum blue spectrophotometry, the results indicated that there were lager differences in 109 phosphate-dissolving microorganisms capability, phosphate concentration was between 0.47～582.46 μg·mL-1, of which strain PCRP5 had the highest phosphate solubilization capacity. For the 143 strains organic phosphate dissolving bacteria, the ability to dissolve organic phosphorus was large (concentration was 0.07～14.76 μg·mL-1), the highest P concentrations was strains MCMRS4. There were no obvious relationship between the organic phosphorus strains solubilization capacity and pH (P>0.05), however pH of PKO showed significant negative relationship with the organic phosphorus strains P concentration (P<0.01).

grasses; inorganic phosphate solubilizing bacteria; organic phosphate solubilizing bacteria; capacity of dissolving phosphate

YAO Tuo E-mail：yaotuo@gsau.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0163

2014-04-09 接受日期：2014-10-27

國家自然基金(31360584)；國家科技支撐計劃(2012BAC01B02-4)

馬文文(1988-)，女，甘肅甘谷人，在讀碩士生，主要從事草地微生物生態(tài)研究。E-mail：834582161@qq.com

姚拓(1968-)，男，甘肅鎮(zhèn)原人，教授，博士，主要從事草地微生物生態(tài)和草地微生物資源利用研究。E-mail：yaotuo@gsau.edu.cn

S544.01;Q945.12

A

1001-0629(2015)04-0515-09*

馬文文,姚拓,蒲小鵬,盧虎,張玉霞,王國基.東祁連山7種禾草根際溶磷菌篩選及其溶磷特性[J].草業(yè)科學,2015,32(4):515-523.

MA Wen-wen,YAO Tuo,PU Xiao-peng,LU Hu,ZHANG Yu-xia,WANG Guo-ji.Screening and characteristics of phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere of 7 grasses on eastern Qilian Mountains[J].Pratacultural Science，2015,32(4)：515-523.