黃文達(dá)，趙學(xué)勇，李玉霖，羅亞勇，王少昆，潘成臣(.中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所奈曼沙漠化研究站， 甘肅 蘭州 730000; 2. 甘肅省寒區(qū)旱區(qū)逆境生理與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

植物生產(chǎn)層

不同海拔梯度下小葉錦雞兒的居群遺傳多樣性響

黃文達(dá)1，2，趙學(xué)勇1，李玉霖1，羅亞勇1，王少昆1，潘成臣1
(1.中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所奈曼沙漠化研究站， 甘肅 蘭州 730000; 2. 甘肅省寒區(qū)旱區(qū)逆境生理與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

以小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)為研究對(duì)象，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)不同海拔梯度下小葉錦雞兒6個(gè)居群遺傳多樣性進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn),8條ISSR擴(kuò)增引物得到142條清晰的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶為126條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為88.73%。用POPGENE軟件計(jì)算不同海拔梯度下各居群間和居群內(nèi)的遺傳參數(shù)，結(jié)果表明， Nei’s基因多樣性為0.292 9，香農(nóng)信息指數(shù)為0.441 7，表明在物種水平上小葉錦雞兒居群具有較高的遺傳多樣性；低海拔區(qū)域居群的所有遺傳多樣性高于高海拔區(qū)域居群，表明海拔高度增加阻礙了居群間的基因交流，導(dǎo)致小葉錦雞兒居群遺傳多樣性水平降低。

小葉錦雞兒；海拔梯度；ISSR

小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)屬豆科錦雞兒屬多年生灌木，在我國(guó)多分布于海拔介于200～1 500 m的東北及內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西等地的固定和半固定沙地[1]。具有較強(qiáng)的抗風(fēng)蝕和固氮能力，在植被恢復(fù)過(guò)程中具有重要作用[2]。ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記通常用于估算植物種群的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，尤其對(duì)基因組序列還不清楚的物種特別有用[3-4]。截至目前，關(guān)于小葉錦雞兒遺傳多樣性的研究主要集中在以下幾個(gè)方面： 1)小葉錦雞兒作為錦雞兒屬的一種植物，研究其種間遺傳差異[5-9]； 2)種質(zhì)資源遺傳多樣性[10]； 3)形態(tài)學(xué)性狀遺傳多樣性[11]；4)內(nèi)蒙古草原區(qū)小葉錦雞兒遺傳多樣性和遺傳分化[12-13]； 5)SSR-PCR體系優(yōu)化及應(yīng)用[14]。但是針對(duì)不同海拔梯度下小葉錦雞兒居群的遺傳多樣性研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了小葉錦雞兒居群在不同海拔梯度下的遺傳差異，以期揭示小葉錦雞兒居群間和居群內(nèi)的遺傳多樣性水平，分析其遺傳多樣性與海拔梯度之間的相互關(guān)系，闡明該物種的生態(tài)學(xué)適應(yīng)過(guò)程，從而為干旱-半干旱地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的持續(xù)穩(wěn)定恢復(fù)提供遺傳學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣包括6個(gè)居群，67個(gè)個(gè)體，每一居群的樣本量為10～12，居群內(nèi)個(gè)體與個(gè)體之間至少間隔30 m(表1)。樣本具有代表性，在每一個(gè)呈島嶼狀不連續(xù)分布的居群中，取樣個(gè)體代表該地區(qū)所有分布的個(gè)體。每個(gè)居群的海拔和經(jīng)緯度在采集地中心使用GIS儀(Garmin)測(cè)定。

采集每個(gè)個(gè)體的幼嫩葉片10 g以上，用變色硅膠迅速干燥后，裝入密封塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室，放于-20 ℃冰箱中保存。

表1 小葉錦雞兒6個(gè)居群的個(gè)體數(shù)、生境類型及地理分布Table 1 Location, number of plants and habitats of 6 populations ofCaraganamicrophylla

1.2 總DNA提取

采用常規(guī)試劑盒AxyPrep Genomic DNA Mini Kits對(duì)所有小葉錦雞兒個(gè)體進(jìn)行總DNA提取。

1.3 PCR擴(kuò)增、純化及序列測(cè)定

從100條ISSR擴(kuò)增引物(加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC Primer Set No.9, http://www.biotech.ubc.ca/services/NAPS/Primer_Set/Primers.pdf)中篩選出8條條帶清晰、重復(fù)性和穩(wěn)定性好且多態(tài)性條帶相對(duì)較多的引物用于全部DNA樣品的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，以100 bp Ladder marker做參照，用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳(含EB 0.5 μg·mol-1)分離，穩(wěn)壓100 V，電泳時(shí)間2 h, 凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物中有條帶的記做“1”，無(wú)條帶的記做“0”，只記載清晰易辨的擴(kuò)增帶，數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)矩陣，應(yīng)用POPGENE 1.32軟件，假定這些小葉錦雞兒居群在這些ISSR標(biāo)記位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，對(duì)全部居群和不同海拔梯度下的群體分別計(jì)算下列遺傳參數(shù)：多態(tài)位點(diǎn)百分率；觀測(cè)等位基因數(shù)；有效等位基因數(shù)；Nei’s基因多樣性；香農(nóng)信息指數(shù)(1972)[15]；總基因多樣性；群體內(nèi)基因多樣性；基因分化系數(shù)；基因流；遺傳一致度和Nei’s遺傳距離[15]。應(yīng)用SPSS 17.0 軟件分析居群內(nèi)的遺傳多樣性水平與海拔梯度之間的相關(guān)關(guān)系。應(yīng)用ARLEQUIN軟件包分析低海拔區(qū)域、高海拔區(qū)域和區(qū)域內(nèi)居群內(nèi)的遺傳變異[16]。應(yīng)用NTSYS pc 2.02軟件構(gòu)建小葉錦雞兒居群的聚類圖[17]。

2 結(jié)果

2.1 多態(tài)位點(diǎn)比率

通過(guò)ISSR擴(kuò)增，從100條引物中篩選出8條擴(kuò)增條帶多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰且重復(fù)性好的引物用于ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，這8條擴(kuò)增引物得到142條清晰的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶為126條，所占的百分比是88.73%，擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度介于150～2 000 bp。8條引物擴(kuò)增的DNA條帶數(shù)平均為17.75條。引物857所產(chǎn)生的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶最多，分別為22條和21條。引物826所產(chǎn)生的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶最少，分別為12條和10條。引物864的多態(tài)百分率最高，達(dá)100.00%。引物842的多態(tài)百分率最低，為80.00%(表2)。

2.2 遺傳多樣性和遺傳分化

不同海拔區(qū)域6個(gè)小葉錦雞兒居群的遺傳多樣性結(jié)果(表3)表明，8條引物在6個(gè)居群所產(chǎn)生的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為8～61條；多態(tài)位點(diǎn)百分率為5.63%～42.96%；觀測(cè)等位基因數(shù)為1.056 3～1.429 6；有效等位基因數(shù)為1.036 1～1.305 0；Nei’s基因多樣性為0.021 4～0.173 3；香農(nóng)信息指數(shù)為0.031 8～0.253 3。其中居群2的所有遺傳多樣性參數(shù)(多態(tài)位點(diǎn)百分率、觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性和香農(nóng)信息指數(shù))都明顯高于其他居群，居群1的所有遺傳多樣性參數(shù)均低于其他居群。在物種水平上，多態(tài)位點(diǎn)百分率為88.73%，觀察等位基因數(shù)為1.887 3，有效等位基因數(shù)為1.496 7，Nei’s基因多樣性為0.292 9，香農(nóng)信息指數(shù)為0.441 7，該結(jié)果揭示了小葉錦雞兒居群具有豐富的遺傳多樣性。在海拔梯度上，低海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群的所有遺傳多樣性參數(shù)都高于高海拔區(qū)域居群，其中重要的遺傳多樣性參數(shù)Nei’s基因多樣性和香農(nóng)信息指數(shù)差異最為明顯。低海拔區(qū)域Nei’s基因多樣性和香農(nóng)信息指數(shù)均明顯高于多年生植物的平均值0.25和0.35，分別為0.280 6和0.415 8。而高海拔區(qū)域Nei’s基因多樣性和香農(nóng)信息指數(shù)均低于多年生植物的平均值，分別為0.193 0和0.288 6。

表2 用于小葉錦雞兒ISSR擴(kuò)增的引物及其退火溫度和多態(tài)位點(diǎn)百分率Table 2 Primers sequence, melting temperature and percentage of polymorphism in ISSR analysis ofCaraganamicrophylla

表3 小葉錦雞兒居群遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity indices ofCaraganamicrophyllapopulations

本試驗(yàn)研究居群為隨機(jī)交配群體，因此，可以假定為Hardy-Weinberg平衡群體。根據(jù)Hardy- Weinberg平衡定律，采用Nei’s基因多樣性指數(shù)對(duì)6個(gè)小葉錦雞兒居群間基因多樣性和遺傳分化進(jìn)行比較(表4)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，海拔梯度對(duì)小葉錦雞兒居群的遺傳變異產(chǎn)生了一定程度的影響。低海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群大部分遺傳分化參數(shù)都高于高海拔區(qū)域居群。在低海拔區(qū)域，小葉錦雞兒居群的總基因多樣性為0.278 3；群體內(nèi)基因多樣性為0.112 2；在同一區(qū)域中不同居群間的基因分化系數(shù)為0.596 6，即小葉錦雞兒在不同居群間產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化，居群間的遺傳變異占總變異的59.66%；居群間的基因流為0.338 0(表4)。高海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群的基因流為0.391 0，高于低海拔區(qū)域居群。在居群水平上，小葉錦雞兒居群的總基因多樣性為0.287 6，高于區(qū)域水平上；群體內(nèi)基因多樣性和基因分化系數(shù)分別為0.098 5和0.582 1，都低于低水熱區(qū)域居群(表4)。AMOVA 分析結(jié)果顯示(表5)，小葉錦雞兒居群的主要遺傳變異來(lái)自于居群間，居群間的遺傳差異百分率達(dá)到72.79%(P<0.001)，居群內(nèi)遺傳差異百分率為27.21%。

為了進(jìn)一步說(shuō)明小葉錦雞兒各居群間的分化程度，用Popgen 1.32軟件計(jì)算了居群間的遺傳距離(表6)，發(fā)現(xiàn)居群5和居群4之間的遺傳相似度最大，為0.844 1，遺傳距離最小，為0.169 5。居群1和居群4之間的遺傳相似度最小，為0.646 6，遺傳距離最大，為0.436 0。從UPGMA聚類圖可以看出(圖1)，高海拔區(qū)域的小葉錦雞兒居群4、5和6聚為一支，低海拔區(qū)域的居群各聚一支。相關(guān)性分析表明，小葉錦雞兒居群的海拔高度與觀察等位基因的相關(guān)系數(shù)為-0.027，與有效等位基因的相關(guān)系數(shù)為-0.014，與Nei’s基因多樣性的相關(guān)系數(shù)為-0.003，與香農(nóng)指數(shù)的相關(guān)系數(shù)為-0.001，這些遺傳多樣性參數(shù)與海拔均呈負(fù)相關(guān),但均未達(dá)到顯著水平。

表4 海拔梯度對(duì)小葉錦雞兒居群遺傳分化的影響Table 4 Effects of altitude gradient on the genetic differentiation ofCaraganamicrophyllapopulations

表5 小葉錦雞兒居群分子變異分析Table 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) forCaraganamicrophyllapopulations

表6 小葉錦雞兒各居群遺傳相似度(對(duì)角線以上)和遺傳距離(對(duì)角線以下)Table 6 Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) betweenCaraganamicrophyllapopulations

圖1 基于Nei’s (1972)遺傳距離的小葉錦雞兒居群UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram ofCaraganamicrophyllapopulations based on Nei’s (1972) genetic distances from ISSR data

3 討論與結(jié)論

物種的遺傳多樣性與其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性緊密相關(guān),估測(cè)遺傳差異是物種保護(hù)和生態(tài)恢復(fù)的重要步驟,通過(guò)估測(cè)遺傳多樣性指數(shù)(如多態(tài)位點(diǎn)百分率等)來(lái)衡量物種的遺傳豐富度。本研究結(jié)果顯示，在物種水平上，小葉錦雞兒居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率為88.73%，這個(gè)值與3種錦雞兒的平均多態(tài)位點(diǎn)百分率(87%)相近[8]，說(shuō)明不同海拔區(qū)域的小葉錦雞兒居群具有較高水平的遺傳多樣性，這與以往的研究結(jié)果一致[5,7,10]。相對(duì)于多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)來(lái)說(shuō)，Nei’s基因多樣性和香農(nóng)信息指數(shù)能更好地反映條帶的豐富度和均勻程度，而豐富度和均勻度是衡量多樣性的兩個(gè)重要指標(biāo)，Nei’s基因多樣性還與物種的生物學(xué)特性緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，物種水平上小葉錦雞兒居群的Nei’s基因多樣性是0.292 9，香農(nóng)信息指數(shù)為0.441 7，結(jié)果與楊明博等[18]利用ISSR分子標(biāo)記研究中間錦雞兒(C.davazamcii)的值相近(Nei’s基因多樣性為0.296 3，香農(nóng)信息指數(shù)為0.454 2)，而明顯高于郭宏宇等[12]利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)內(nèi)蒙古草原區(qū)小葉錦雞兒的研究結(jié)果(Nei’s基因多樣性為0.184 5，香農(nóng)信息指數(shù)為0.394 2)。這可能是分子標(biāo)記技術(shù)的不同所導(dǎo)致的。Hamrick和Godt[19]、Nybom和Bartish[20]認(rèn)為植物的遺傳多樣性水平雖依賴物種的生活史特征，例如繁殖系統(tǒng)、種子擴(kuò)散機(jī)制、地理分布和生活型，但主要受環(huán)境因子的影響[21-22]。小葉錦雞兒是靠蟲媒傳粉的多年生灌木，具有廣泛的生態(tài)幅，除了能異花授粉外，還可以進(jìn)行自花授粉，具有極強(qiáng)的生命力與競(jìng)爭(zhēng)力，這些生物學(xué)特征都可以使小葉錦雞兒獲得高水平的遺傳多樣性[23-25]；從而使得小葉錦雞兒成為中國(guó)北方的廣布種和優(yōu)勢(shì)種。Ayala和Keger[26]指出，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程，物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性主要依靠其種內(nèi)的遺傳變異水平。

在海拔梯度上，低海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群的所有遺傳多樣性參數(shù)都高于高海拔區(qū)域居群，這表明海拔增加阻礙了小葉錦雞兒居群間的基因交流，原因可能是高海拔地區(qū)溫度低，降水豐富，在一定程度上限制了花粉及果實(shí)的散布，導(dǎo)致遺傳多樣性水平降低，這與馬丹煒等[27]對(duì)巖生植物金發(fā)草(Pogonatherumpaniceum)的遺傳多樣性研究一致。低海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群總基因多樣性、群體內(nèi)基因多樣性和基因分化系數(shù)都高于高海拔區(qū)域居群，而居群間的基因流低于高海拔區(qū)域居群, 這說(shuō)明低海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群的遺傳分化程度高于高海拔區(qū)域居群。這主要是因?yàn)榈秃０螀^(qū)域?yàn)樯衬莸?，生境的片段化?dǎo)致小葉錦雞兒居群間產(chǎn)生較大的遺傳漂變，這與Huang等[13]對(duì)科爾沁沙地小葉錦雞兒居群的研究結(jié)果一致。也有研究證明，生境片段化會(huì)影響植物居群間的遺傳多樣性[28-33]。在海拔水平上，低海拔區(qū)域和高海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群間的遺傳變異都占總變異的50%以上，其群體內(nèi)分化系數(shù)分別為0.596 6和0.561 2, 這說(shuō)明海拔梯度對(duì)小葉錦雞兒居群的遺傳分化有一定影響。顯著性檢測(cè)也顯示小葉錦雞兒居群間的變異所占比例較大，且對(duì)總體遺傳變異有顯著影響(P<0.001)，說(shuō)明各地理居群間有一定程度的分化，這與郭宏宇等[12]對(duì)小葉錦雞兒和楊明博等[18]對(duì)中間錦雞兒遺傳分化的研究不一致，這可能是由物種差異和采樣地的地理差異引起的。本研究發(fā)現(xiàn)，居群4和居群5之間的遺傳相似度最大，遺傳距離最小, 這是由于居群4和居群5都處于高海拔區(qū)域，居群間的地理距離較小，居群間會(huì)有基因流動(dòng)。有研究表明，小尺度范圍內(nèi)物種的遺傳多樣性指數(shù)和地理距離之間沒(méi)有相關(guān)性[34-35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，居群1和居群4之間的遺傳相似度最小，遺傳距離最大，這主要因?yàn)樯巢町?，居?來(lái)自于丘間低地，其微生境條件比流動(dòng)沙地好[36-44]，而且居群1和居群4之間存在一定的地理距離。根據(jù)UPGMA聚類，小葉錦雞兒居群的遺傳多樣性呈現(xiàn)出一定的分布規(guī)律，聚類結(jié)果將高海拔區(qū)域居群聚在一起。相關(guān)性分析表明，小葉錦雞兒居群的遺傳多樣性參數(shù)與海拔呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明海拔高度的變化對(duì)小葉錦雞兒的遺傳分化產(chǎn)生了一定的影響,但結(jié)果未達(dá)到顯著水平，這與王贊和高洪文[10]對(duì)檸條錦雞兒(C.korshinskii)表型性狀與地理因子的相關(guān)性研究結(jié)果一致。

概而言之，不同海拔梯度影響了小葉錦雞兒居群的遺傳多樣性，而且低海拔區(qū)域小葉錦雞兒居群的遺傳多樣性參數(shù)高于高海拔區(qū)域居群。隨著海拔高度的增加，小葉錦雞兒居群產(chǎn)生了一定的遺傳分化，這表明海拔增加阻礙了居群間的基因交流，導(dǎo)致其遺傳多樣性水平降低[27]。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Genetic diversity analysis ofCaraganamicrophyllapopulation in different altitude gradients

HUANG Wen-da1，2, ZHAO Xue-yong1, LI Yu-lin1, LUO Ya-yong1, WANG Shao-kun1, PAN Cheng-chen1
(1.Naiman Desertification Research Station, Cold and Arid Region Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China;2.Key Laboratory of Stress Physiology and Ecology in Cold and Arid Regions, Lanzhou 730000；China)

Caraganamicrophyllais the most dominant and constructive shrub species. We evaluated the level of genetic variation within and among populations sampled from two different altitude gradients using inter-simple sequence repeat polymorphism (ISSR) molecular markers. The results showed that eight ISSR primers generated 142 bands, of which 126 (88.73%) were polymorphic. Based on Nei’s Gst value calculated by POPGENE, the gene diversity (h) and Shannon’s information index (I) was 0.292 9 and 0.441 7, respectively indicating considerable genetic variations at the species level. At the altitude gradients, the genetic diversity index in populations from low altitude region was higher than from high altitude region, shows that the gene exchange between populations was blocked by the increase of altitude.

Caraganamicrophylla; altitude gradients; ISSR

HUANG Wen-da E-mail:huangwenda2008@163.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0379

2014-08-13 接受日期：2014-01-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41201561)；中科院寒旱所人才基金項(xiàng)目(Y351151001)；甘肅省自然科學(xué)基金(145RJYA269)

黃文達(dá)(1980-)，女，甘肅平川人，助理研究員，博士，主要從事干旱區(qū)植物分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail:huangwenda2008@163.com

Q943;S542+.903

A

1001-0629(2015)04-0552-08*

黃文達(dá)，趙學(xué)勇，李玉霖，羅亞勇，王少昆，潘成臣.不同海拔梯度下小葉錦雞兒的居群遺傳多樣性[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(4):552-559.

HUANG Wen-da,ZHAO Xue-yong,LI Yu-lin,LUO Ya-yong,WANG Shao-kun,PAN Cheng-chen.Genetic diversity analysis ofCaraganamicrophyllapopulation in different altitude gradients[J].Pratacultural Science，2015,32(4)：552-559.