周善學(xué)，葉小磊，趙亞榮，應(yīng)福明，馮雪峰，范天逸，李賢杰

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索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布在體外對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響

周善學(xué)1，葉小磊2，趙亞榮2，應(yīng)福明1，馮雪峰1，范天逸1，李賢杰1

目的 研究索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布在體外對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響。方法以不同濃度索拉非尼和塞來(lái)昔布分別組成單藥組和聯(lián)合用藥組作用于HepG2細(xì)胞，MTT法檢測(cè)增殖抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。Western blot檢測(cè)Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4蛋白的表達(dá)。結(jié)果索拉非尼、塞來(lái)昔布單藥與聯(lián)用均能抑制HepG2細(xì)胞增殖，呈時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)，兩藥聯(lián)用有協(xié)同效應(yīng)(P<0.05)。藥物組與空白組相比，G0/G1期細(xì)胞比例增高，聯(lián)合用藥組最高。聯(lián)合用藥組與單藥及空白對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin D3蛋白的表達(dá)顯著降低。結(jié)論索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布可能通過(guò)下調(diào)Cyclin D1、Cyclin D3表達(dá)，增強(qiáng)G0/G1期阻滯，發(fā)揮協(xié)同抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用。

索拉非尼；塞來(lái)昔布；肝癌細(xì)胞

0 引言

肝癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與多種基因的突變、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和新生血管增生異常等密切相關(guān)，其中存在著多個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。索拉非尼(Sorafenib)是口服多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑，具有同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成的雙重作用[1-2]。COX-2蛋白在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，而正常肝組織中多無(wú)表達(dá)[3]；COX-2蛋白與癌細(xì)胞的分化程度、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)[4]，有望成為預(yù)防、治療腫瘤的靶點(diǎn)。塞來(lái)昔布是美國(guó)FDA第一個(gè)批準(zhǔn)的選擇性COX-2抑制劑，可有效地抑制腫瘤引起的輕中度疼痛，對(duì)消化道毒副反應(yīng)小、安全性好[5]。聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼及塞來(lái)昔布有望更加有效地抑制肝癌的進(jìn)展，同時(shí)緩解癌性疼痛。因此，我們通過(guò)索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布作用肝癌細(xì)胞的研究探討：①兩藥聯(lián)用在體外是否存在協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用；②兩藥聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與培養(yǎng) 人類肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞(購(gòu)自中科院生化所)，在寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)科液氮凍存。使用前復(fù)蘇并常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃恒溫、5% CO2飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 索拉菲尼(德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健公司產(chǎn)品，商品名:Nexavar，多吉美)，塞來(lái)昔布(輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品，商品名:Celecoxib，西樂(lè)葆)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，100 μL/孔。37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含有不同濃度索拉菲尼(0、5、10、20 μmol/L)和塞來(lái)西布(0、25、50、100、200 μmol/L)的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，終體積200 μL/孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，檢測(cè)570 nm處的吸光度值(OD值)，并用630 nm處進(jìn)行校正。細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將HepG2細(xì)胞分10 cm dish，培養(yǎng)24 h后，50 μmol/L塞來(lái)昔布、10 μmol/L索拉非尼分別以及兩者聯(lián)合作用48 h。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。用PBS洗1遍，然后加入1 mL預(yù)冷70%乙醇，4 ℃固定30 min。用PBS洗1遍，加入500 μL PBS及10 μL RNase(1 mg/mL)，置于37 ℃，30 min。加入500 μL PBS以及20 μL PI染色液(2.5 mg/mL)，避光染色30 min。細(xì)胞上機(jī)之前過(guò)300目篩網(wǎng)，然后檢測(cè)。

1.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白 將HepG2細(xì)胞分6孔板，培養(yǎng)24 h后，50 μmol/L塞來(lái)昔布、10 μmol/L索拉非尼分別及兩者聯(lián)合作用48 h。提取蛋白后，檢測(cè)Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4蛋白表達(dá)情況。具體操作如下：取25 μg細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育。使用ECL發(fā)光液，壓片。條帶使用IMAGE J處理，并使用內(nèi)參β-tubulin進(jìn)行校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示。均數(shù)比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)。交互效應(yīng)分析采用兩因素多水平的析因設(shè)計(jì)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。協(xié)同性分析用金正均q值法[6]判斷，q=實(shí)際聯(lián)合藥效R′(A+B)/理論聯(lián)合藥效R(A+B)，R(A+B)=RA+RB-RA×RB，RA、RB為單獨(dú)用藥藥效。q<0.85為拮抗，0.85≤q<1.15為相加，q≥1.15為協(xié)同。所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察(×100) 對(duì)照組細(xì)胞：呈延展扁平，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞間排列緊密，密度均勻(見(jiàn)圖1a)。單藥處理組細(xì)胞：形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞間接觸變松，部分貼壁細(xì)胞變圓、漂浮(圖1b、圖1c)。聯(lián)合藥物處理組細(xì)胞：形態(tài)變化，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞體積變小、變圓，漂浮的比例增大，細(xì)胞周圍碎片增多，細(xì)胞數(shù)目減少(圖1d)。

圖1 顯微鏡形態(tài)學(xué)(×100)

2.2 MTT試驗(yàn) 塞來(lái)昔布與索拉非尼單藥及聯(lián)用各組均能抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，表現(xiàn)為時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。聯(lián)用組細(xì)胞抑制率較單藥組明顯增強(qiáng)。見(jiàn)表1～表3。

統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布和索拉非尼不同劑量抑制效果不同，兩種藥物間存在交互作用(P<0.01)。以金正鈞公式計(jì)算不同劑量聯(lián)合用藥時(shí)的q值，塞來(lái)昔布和索拉非尼聯(lián)合作用24 h主要表現(xiàn)為相加作用，而聯(lián)合作用48及72 h表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。見(jiàn)表4。

表1 塞來(lái)昔布聯(lián)合索拉非尼作用HepG2細(xì)胞24 h抑制率(%)

表2 塞來(lái)昔布聯(lián)合索拉非尼作用HepG2細(xì)胞48 h抑制率(%)

表3 塞來(lái)昔布聯(lián)合索拉非尼作用HepG2細(xì)胞72 h抑制率(%)

表4 不同濃度塞來(lái)昔布與索拉非尼聯(lián)合作用的q值

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組細(xì)胞周期 與空白對(duì)照組比較，各藥物組細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例增多，G2/M期細(xì)胞比例減少。與其他三組比較，聯(lián)合用藥組G0/G1期細(xì)胞比例最高，G2/M期細(xì)胞比例最低。提示聯(lián)合用藥主要增加了G0/G1期細(xì)胞阻滯(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 塞來(lái)昔布，索拉非尼及聯(lián)合用藥48 h后HepG2細(xì)胞周期比例

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白 聯(lián)合用藥組Cyclin D1、Cyclin D3蛋白表達(dá)水平較其他組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組CDK4的表達(dá)無(wú)顯著改變。見(jiàn)圖3。表明塞來(lái)昔布聯(lián)合索拉菲尼能顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞中Cyclin D1、Cyclin D3表達(dá)。

圖3 塞來(lái)昔布和索拉菲尼單藥與聯(lián)合作用于HepG2細(xì)胞后Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4的表達(dá)

索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有協(xié)同抑制作用。聯(lián)合用藥與單藥相比細(xì)胞周期阻滯有顯著差異。聯(lián)合用藥組與單藥及對(duì)照組相比，Cyclin D1、Cyclin D3蛋白的表達(dá)下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

索拉非尼通過(guò)抑制受體酪氨酸激酶KIT、FLT23以及Raf/MEK/ERK途徑中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制腫瘤細(xì)胞增生[7]；同時(shí)通過(guò)上游抑制受體酪氨酸激酶VEGFR、PDGFR及下游抑制Raf/MEK/ERK途徑中絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制腫瘤新生血管形成;起到抗腫瘤細(xì)胞增殖和抗血管生成的雙重作用[8]。

COX-2蛋白可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性，抑制凋亡，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)[9]，促進(jìn)血管和淋巴管生成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。選擇性COX-2抑制劑主要通過(guò)抑制COX-2的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，抑制腫瘤新生血管生成[11]。研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布可以抑制COX-2的合成，阻滯肝癌QGY-7701細(xì)胞G1-S期的轉(zhuǎn)化[12]；也可以抑制HepG2細(xì)胞NF-κB因子DNA結(jié)合活性和NF-κB因子P65蛋白的表達(dá)[13]。因此，塞來(lái)昔布的抗腫瘤能力并不完全取決于是否抑制COX-2的表達(dá)[14]。

索拉非尼和塞來(lái)昔布聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制爭(zhēng)論較多。有研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布聯(lián)合索拉非尼在體外能夠明顯抑制肝癌SNU-449細(xì)胞增殖，機(jī)制可能是塞來(lái)昔布通過(guò)抑制IL-6/STAT3通路，減少STAT3下游表達(dá)基因，如Bcl-2、Bcl-XL和Survivin等，從而增強(qiáng)與其他抗癌藥物聯(lián)用時(shí)的效果[15]。也有研究認(rèn)為，索拉非尼和塞來(lái)昔布聯(lián)合能增強(qiáng)對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7的毒性，使細(xì)胞凋亡增加；機(jī)制可能是通過(guò)PI3K-AKT抑制途徑和RAS/RAF/MEK抑制途徑相互作用[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布能協(xié)同抑制HepG2細(xì)胞增殖。從細(xì)胞周期分布來(lái)看，塞來(lái)昔布、索拉非尼抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，使細(xì)胞停滯在G0/G1期；聯(lián)合用藥后HepG2細(xì)胞G0/G1期阻滯更加明顯。索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布可能通過(guò)抑制HepG2中Cyclin D1、D3表達(dá)，增強(qiáng)G0/G1期細(xì)胞阻滯，抑制細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期的正常進(jìn)行有賴于CDK與細(xì)胞周期蛋白Cyclin組成的一類蛋白復(fù)合物的調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期蛋白D(Cyclin D)是G1/S期轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)控因子，是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白[17]，包括3個(gè)亞型:Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中Cyclin D1顯著高于正常肝組織及癌旁硬化肝組織，Cyclin D1的表達(dá)與腫瘤包膜的完整性、分化程度，腫瘤的臨床分期及預(yù)后相關(guān)[18]。Cyclin D1過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，引起癌變[19]。Cyclin D3通過(guò)與CDK4或CDK6結(jié)合，使Rb蛋白發(fā)生磷酸化，促進(jìn)與DNA合成有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞周期[20]。Cyclin D3/CDK4或CDK6復(fù)合體和Rb蛋白的磷酸化失活可能不僅僅是細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期運(yùn)行的必要因素，同時(shí)也是決定細(xì)胞凋亡是否能發(fā)生的關(guān)鍵。因此，Cyclin D1、D3表達(dá)下調(diào)，可能是索拉非尼聯(lián)合塞來(lái)昔布協(xié)同抑制HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。索拉非尼和塞來(lái)昔布在肝癌細(xì)胞之間的協(xié)同作用有望減少索拉非尼的高額成本，降低手足綜合征、血壓升高、脫發(fā)、腹瀉、疲乏、骨髓抑制及腎功能損害等潛在的不良事件發(fā)生率。

本研究提示，塞來(lái)昔布能協(xié)同增加索拉非尼的抗肝癌效果，減少索拉非尼劑量并減輕其毒副作用。但是兩藥聯(lián)合的協(xié)同作用的具體機(jī)制仍在深入研究，臨床應(yīng)用前仍需有待進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確應(yīng)用范圍及安全劑量。

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Effect of sorafenib and celecoxib combination therapy on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2invitro

ZHOU Shan-xue1，YE Xiao-lei2，ZHAO Ya-rong2，YING Fu-ming1，F(xiàn)ENG Xue-feng1，F(xiàn)AN Tian-yi1，LI Xian-jie1

(1.Department of Hepatobiliary Surgery,The Affiliated Hospital of School of Medicine of Ningbo University，Ningbo 315020,China; 2.Ningbo Institute of Medical Sciences，Ningbo 315020，China)

Objective To investigate the effect of sorafenib and celecoxib combination therapy on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2.MethodsHepG2 cells were treated with different concertrations of sorafenib or celecoxib alone or their combination.The inhibitory effects were detected by MTT assay.Cell cycles were analyzed by flow cytometry in different groups.The expressions of cell cycle related proteins Cyclin D1,Cyclin D3,CDK4 were evaluated by Western blot.ResultsSorafenib or celecoxib used alone or combination inhibited the proliferation of HepG2 cells in a time- and dose-dependent manner,and a synergistic effects was observed in their combined action (P<0.05).G0/G1phase cell proportion in medication groups was higher than that in blank group,and G0/G1phase cell proportion in combination group was the highest.Compared with single drug or blank control group,the combination use could significantly inhibit Cyclin D1 and Cyclin D3 expression in HepG2 cell.ConclusionThe combination of sorafenib with celecoxib can inhibit Cyclin D1 and Cyclin D3 expression,increase the G0/G1phase retardation,and play a synergistic inhibitory effect for HepG2 cells.

Sorafenib; Celecoxib; Hepatoma cell

2014-09-21

1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，浙江 寧波 315020；2.寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，浙江 寧波 315020

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目(xyy11021)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505005