董曉茜，陳 賀，戚哲源，朱婉玲，張振秋*

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苦芪滴丸中氧化槐果堿在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)研究

董曉茜1，陳 賀1，戚哲源1，朱婉玲2，張振秋2*

目的 建立測(cè)定血漿中氧化槐果堿濃度的高效液相色譜法，并用此方法進(jìn)行苦芪滴丸中氧化槐果堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究。方法色譜柱為Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸水(86∶8∶6)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果血漿中氧化槐果堿的線性范圍：0.20～20 μg/mL，r=0.993，最低檢測(cè)限為0.20 μg/mL。日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度、提取回收率符合要求。6只大鼠灌胃給藥8.5 mg/kg苦芪滴丸后，血漿中氧化槐果堿Tmax為(4.03±0.72)h，Cmax為(4.00±0.54)ng/mL，t1/2為(0.05±0.66)h，采用梯形法計(jì)算，AUC0-t為(30.70±0.54)μg·h/mL，AUC0-∞為(30.8±0.32)ng·h/mL。結(jié)論本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于苦芪滴丸中氧化槐果堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

高效液相色譜；黃芪；苦參；氧化槐果堿；藥代動(dòng)力學(xué)

0 引言

中藥藥對(duì)是中醫(yī)辨證論治理論精髓的具體體現(xiàn)，處方或配伍的細(xì)微變化往往表現(xiàn)出藥效和適應(yīng)證的顯著差異。近幾年，對(duì)組成較小或較簡(jiǎn)單的復(fù)方-藥對(duì)的研究較多，但大多是在化學(xué)成分的含量和變化、藥理作用等方面，對(duì)藥對(duì)在動(dòng)物體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究還較少。

苦芪滴丸是黃芪和苦參藥材以1∶2配比經(jīng)醇提后制得，主要含皂苷類和生物堿類物質(zhì)。兩藥配伍，藥味雖少，卻寒熱并用，補(bǔ)瀉同施，升降相隨，共奏健脾益氣，清心解毒之功。適用于病毒性心肌炎氣虛濕毒內(nèi)侵之虛實(shí)夾雜證。氧化槐果堿是苦芪滴丸的主要功效成分之一，本文采用高效液相色譜法測(cè)定6只大鼠給藥后血漿中氧化槐果堿的濃度，考察了方法的線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、回收率和穩(wěn)定性等效能指標(biāo)。血漿樣品處理采用液-液萃取，考察了提取回收率，并計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備 日本島津N2000高效液相色譜系統(tǒng)(配有一元泵，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，脫氣機(jī)，柱溫箱和N2000工作站)；電子分析天平，傲豪斯公司；TGL-16C高速離心機(jī)，海安亭科學(xué)儀器廠；微量移液器，上海求精玻璃儀器廠；WX-80A微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠。

1.2 藥品與試劑 黃芪、苦參藥材均購(gòu)自河北安國(guó)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王冰教授鑒定黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hisao的干燥根，苦參為豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根；氧化槐果堿對(duì)照品(批號(hào)：111652-200301)和士的寧(批號(hào)：0705-200306)對(duì)照品，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈及無(wú)水乙醇均為色譜純，購(gòu)自天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；磷酸、氯仿均為分析純，購(gòu)自華北地區(qū)特種化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心(天津)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 血漿中氧化槐果堿分析方法

2.1 色譜條件 分析柱：Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸水(86∶8∶6)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品系列濃度溶液 精密稱取氧化槐果堿適量，用甲醇溶解制成1.00 mg/mL的儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，置4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取士的寧適量，用甲醇溶解制成245 μg/mL的儲(chǔ)備液。取0.5 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成2.5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置4 ℃冰箱中保存。

2.3 血漿樣品的處理 取血漿500 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋混合1 min，加水飽和碳酸鈉100 μL，渦旋混合1 min，加乙腈200 μL，渦旋混合1 min，加氯仿1.3 mL，渦旋混合5 min，離心(3 000 r/min)5 min，取下層有機(jī)相置另一試管中，空氣流下(40 ℃)吹干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相50 μL溶解，進(jìn)樣20 μL。

2.4 分析方法考察

2.4.1 方法的專屬性 血漿樣品測(cè)定色譜圖表明，空白血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氧化槐果堿的測(cè)定，空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖表明，氧化槐果堿色譜峰tR為17.5 min，內(nèi)標(biāo)士的寧tR為10.7 min，如圖1所示。

圖1 方法專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取大鼠空白血漿500 μL，各加入氧化槐果堿標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL，制成相當(dāng)于氧化槐果堿濃度為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL的模擬血漿樣品，按“血漿樣品的分析方法”操作，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w=1/χ2)最小二乘法進(jìn)行回歸分析，求得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：A=0.589 C+0.089 8，r=0.976 4

2.4.3 方法精密度與準(zhǔn)確度 取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制成低、高兩個(gè)濃度(氧化槐果堿濃度分別為0.5、16.0 μg/mL)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品測(cè)得濃度，根據(jù)QC樣品測(cè)定結(jié)果計(jì)算本法的精密度與準(zhǔn)確度。氧化槐果堿在低、高濃度的日間RSD分別為6.38%、4.7%，日內(nèi)RSD分別為6.43%、4.39%，回收率分別為101.3%、90.9%。

2.4.4 提取回收率和溶液穩(wěn)定性 取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備低、高兩個(gè)濃度(氧化槐果堿濃度分別為0.5、16.0 μg/mL)模擬血漿樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，并與配制的相應(yīng)濃度未被處理溶液比較，以每一濃度兩種處理方法峰面積比值計(jì)算本方法提取回收率。內(nèi)標(biāo)物(0.024 5 mg/mL)提取回收率試驗(yàn)方法相同。見(jiàn)表1。

表1 氧化槐果堿和內(nèi)標(biāo)物(士的寧)的提取回收率

取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備氧化槐果堿低、高兩個(gè)濃度QC樣品(每濃度3樣本分析)，在室溫下于不同時(shí)間測(cè)定。結(jié)果表明，處理后的氧化槐果堿樣品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。取空白血漿500 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備氧化槐果堿低、高兩個(gè)濃度QC樣品(每濃度3樣本分析)，凍融2循環(huán)穩(wěn)定性考察。見(jiàn)表2。

表2 模擬血漿樣品室溫放置12 h及凍融2循環(huán)穩(wěn)定性考察結(jié)果(μg/mL)

2.4.5 未知樣品的測(cè)定與質(zhì)量控制 未知血漿樣品測(cè)定時(shí)，每天建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨行測(cè)定低、高連個(gè)濃度(雙樣本)QC樣品。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品和未知樣品的濃度，當(dāng)QC樣品RSD≤15%時(shí)，當(dāng)日數(shù)據(jù)方可接受。

2.5 大鼠藥物動(dòng)力學(xué)研究 取健康雌、雄大鼠各3只，隨機(jī)分為2組。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水，取空白血0.5 mL后，按8.5 mg/kg大鼠體重灌胃給予苦芪滴丸(相當(dāng)于氧化槐果堿含量14.5 mg/g)，于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24 h眼眶取血0.5 mL，置于預(yù)先肝素化的離心管中，離心5 min(10 000 r/min)，得血漿。

3 結(jié)果

對(duì)6只健康Wistar大鼠給予灌胃氧化槐果堿0.014 5 mg/kg，之后采用HPLC法測(cè)定6只健康Wistar大鼠灌胃給藥后的血漿藥物濃度，根據(jù)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算主要藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表3，藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

表3 6只健康Wistar大鼠灌胃給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 6只大鼠灌胃給藥后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

4 討論

4.1 流動(dòng)相的影響 本文采用士的寧做內(nèi)標(biāo)，在方法的建立過(guò)程中，考察了不同流動(dòng)相配比對(duì)峰形和分離度的影響[1-3]。曾采用乙腈-0.1%甲酸、甲醇-乙腈-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-無(wú)水乙醇-磷酸溶液為流動(dòng)相，結(jié)果乙腈-無(wú)水乙醇-磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)分離效果較好。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，磷酸溶液的酸度對(duì)分離效果有較大影響。因此試用了各種配比的乙腈-無(wú)水乙醇-磷酸溶液，最終確定用乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸水溶液(86∶8∶6)作為流動(dòng)相。

4.2 堿化試劑的選擇 本文考察了用強(qiáng)堿進(jìn)行堿化，提取回收率低。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水飽和碳酸鈉堿化后提取回收率最高，使用其他堿提取回收率有所降低，因此最終選擇用水飽和碳酸鈉堿化。

4.3 提取劑的選擇 本文參照文獻(xiàn)考察了乙醚-氯仿和乙腈-氯仿對(duì)氧化槐果堿樣品提取的影響[4-6],發(fā)現(xiàn)樣品在乙腈-氯仿中的溶解度大于在乙醚-氯仿中的溶解度，用乙腈-氯仿作為提取劑提取回收率高于用乙醚-氯仿作為提取劑的提取回收率，所以選擇乙腈-氯仿作為提取劑。

[1] 冷曉紅，陳海燕，郭鴻雁，等.不同提取方法對(duì)苦豆子中氧化槐果堿與槐果堿含量的影響[J].西北藥學(xué)雜志,2013,28(5):457-458.

[2] 呂佳,王丹,張振秋,等.HPLC同時(shí)測(cè)定苦參藥材中5種生物堿含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2013,29(9):61-62.

[3] 蔡凡,張芳向,鄒振紅,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定三物黃芩湯中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿[J].航空航天醫(yī)學(xué)雜志,2012,23(11):1333-1334.

[4] 張蕾,王志偉,廉建偉，等.HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿的濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,43(8):843-847.

[5] 路洪,黃圣凱,王曉洪，等.血漿中氧化槐果堿的氣相色譜測(cè)定及其在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1991,22(1):36-38.

[6] 王曉洪,黃圣凱.槐果堿,氧化槐果堿的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,23(3):161-164.

Pharmacokinetic study on oxymatrine in Kuqi drop pills in rat′s plasma

DONG Xiao-qian1,CHEN He1,QI Zhe-yuan1,ZHU Wan-ling2,ZHANG Zhen-qiu2*

(1.Laboratory of Clinical Pharmacy，Academy of Traditional Chinese Medicine of Liaoning Province，Shenyang 110034，China; 2.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To establish an HPLC method for the determination of oxysophocarpin in rat plasma,and study the pharmacokinetics of oxysophocarpin in Kuqi drop pills.MethodsThe analytical column was Inertsil-NH2(150 mm×4.6 mm,5 μm); mobile phase: acetonitrile-ethanol-3% phosphoric acid water (86∶8∶6); flow rate: 1.0 mL/min; detection wavelength: 220 nm; injection volume: 20 μL.ResultsThe linear concentration range of plasma oxysophocarpin was 0.20～20 μg/mL,r=0.993,the lower limits of quantificati were 0.20 μg/mL.The intra-day and inter-day precision,accuracy,extraction recoveries met the requirement.Six rats were fed by gavage administration of 8.5 mg/kg Kuqi drop pills,the plasma oxysophocarpin Tmaxwas (4.03±0.72)h,Cmaxwas (4.00±0.54)ng/mL,t1/2was (0.053±0.66)h,AUC0-twas (30.70±0.54)μg·h/mL,AUC0-∞was (30.8±0.32)ng·h/mL.ConclusionThe method is simple,rapid,accurate,specific,it can be used for the pharmacokinetic study of oxysophocarpin in Kuqi drop pills.

HPLC; Radix astragali; Radix flavescentis ait; Oxysophocarpin; Pharmacokinetics

2014-09-29

1.遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽(yáng) 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201505021