*基金項(xiàng)目: 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102644)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2100533)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科(針灸學(xué))建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號(hào))；浙江省“重中之重”學(xué)科(針灸推拿學(xué))建設(shè)項(xiàng)目(浙教高科[2008]255號(hào))。

電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法對(duì)急性脊髓損傷大鼠Cdc42因子表達(dá)的研究*

*基金項(xiàng)目: 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102644)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2100533)；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科(針灸學(xué))建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號(hào))；浙江省“重中之重”學(xué)科(針灸推拿學(xué))建設(shè)項(xiàng)目(浙教高科[2008]255號(hào))。

★張柳娟1何克林1馬睿杰1,2**(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院杭州 310053)

摘要：目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)脊髓損傷后Cdc42的蛋白表達(dá)來(lái)探討電針結(jié)合減重步行訓(xùn)練療(BWSTT)法的治療機(jī)制。方法：選用健康成年雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組(B組)、夾脊電針觀察組(C組)、夾脊電針結(jié)合減重步行訓(xùn)練觀察組(D組)、藥物組(E組)。急性脊髓損傷(SCI)模型采用美國(guó)NYU脊椎沖擊損傷儀致大鼠T9-T10段脊髓急性中度損傷。采用免疫印跡和免疫組化技術(shù)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)損傷段脊髓Cdc42的表達(dá)。結(jié)果：在兩項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)中，假手術(shù)對(duì)照組的蛋白表達(dá)一直處于穩(wěn)定低水平狀態(tài)。SCI術(shù)后表達(dá)呈逐漸增加的趨勢(shì),28d時(shí)達(dá)到高峰，兩組觀察組及藥物組與模型組相比在7d、14d、28d均有顯著性差異(P<0.05)，兩組觀察組之間在28d時(shí)具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：電針結(jié)合BWSTT療法可能通過(guò)增加Rho/ROCK激酶信號(hào)通路中下游因子Cdc42的表達(dá)，促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)；從損傷后長(zhǎng)久的復(fù)健來(lái)看，電針結(jié)合BWSTT療法對(duì)SCI后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)上優(yōu)于電針觀察組。

關(guān)鍵詞：電針；運(yùn)動(dòng)療法；脊髓損傷；Cdc42

脊髓損傷發(fā)生率隨著汽車(chē)產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，而脊髓一旦損傷往往導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的功能障礙，給患者、家屬、社會(huì)帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)。脊髓損傷與中樞神經(jīng)具有密切關(guān)系。據(jù)報(bào)道，抑制因子的存在以及促進(jìn)性環(huán)境的缺失是阻礙中樞神經(jīng)再生的眾多因素之一。并發(fā)現(xiàn)髓磷脂相關(guān)抑制因子Nogo、MAG、OMgp( Oligdendrocyte-associated myelin glycoprotein)具有激活Rho/Rock激酶信號(hào)通路的作用。有研究發(fā)現(xiàn)電針作用于脊髓損傷后的大鼠能抑制這些因子表達(dá)，而運(yùn)用Rho抑制劑如鹽酸法舒地爾可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用抑制該通路[1]，從而促進(jìn)軸突再生[2-3]。課題組的前期研究已證實(shí)夾脊電針對(duì)脊髓損傷后的大鼠在行為學(xué)以及與神經(jīng)再生功能相關(guān)的蛋白表達(dá)中具有良性干預(yù)作用[4-5]。本研究欲從Rho/ROCK激酶信號(hào)通路入手，觀察電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法對(duì)該通路上的Cdc42的蛋白表達(dá)影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康成年雄性SD大鼠90只，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重180～200g。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，采用SPSS軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字給予染色標(biāo)記編號(hào)，將其隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(A組)，造模后再將其余大鼠隨機(jī)分組為模型對(duì)照組(B組)、夾脊電針觀察組(C組)和夾脊電針結(jié)合BWSTT觀察組(D組)、藥物組(E組)。每組在7d、14d、28d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取6只。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器Cdc42一抗(abcam，1∶1000)；SP-9001免疫組化試劑盒(博海生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋)；鹽酸法舒地爾(天津紅日藥業(yè)股份有限公司)；佗牌0.5寸無(wú)菌針灸針(0.30mm×13mm)；韓氏(HANS)電針儀(HANS-100)；NYU脊椎沖擊損傷儀(美國(guó)，NYU-2)。

1.3脊髓損傷模型的制備腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)進(jìn)行麻醉，背部暴露T9-T10段脊髓，運(yùn)用NYU脊椎沖擊損傷儀以5cm/10g的勢(shì)能撞擊暴露段脊髓，造成該區(qū)域急性中度脊髓損傷，然后沖洗傷口后逐層縫合。假手術(shù)對(duì)照組僅切除椎板。三個(gè)征象出現(xiàn)其中兩個(gè)即為造模成功：①身體痙攣性顫動(dòng)；②尾巴痙攣性搖動(dòng)；③硬脊膜內(nèi)充血或血腫。術(shù)后腹腔注射青霉素抗感染，按摩膀胱幫助排尿。

各組大鼠造模后分別進(jìn)行BBB評(píng)分，2分以上剔除并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的增補(bǔ)。術(shù)后分別在7d、14d、28d各時(shí)間點(diǎn)記錄BBB評(píng)分以觀察運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)狀況后處死取損傷節(jié)段脊髓進(jìn)行檢測(cè)。

1.4治療方法模型對(duì)照組：給予腹腔注射生理鹽水(量同藥物組注射的藥物)，每日一次；電針組：于造模成功后給予夾脊電針治療。在損傷椎體的棘突旁開(kāi)距后正中線3～4mm處取穴，垂直進(jìn)針約3～4mm，針尖觸及椎板，將HANS-100的導(dǎo)線正負(fù)極夾在同側(cè)的毫針針柄上，頻率2/100Hz[6]，電流1mA，20min/日；電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)組：在夾脊電針治療的基礎(chǔ)上，術(shù)后第七天時(shí)進(jìn)行減重步行法康復(fù)訓(xùn)練。訓(xùn)練裝置以大鼠跑步機(jī)為運(yùn)動(dòng)平板，然后將一根帶夾子的短鐵絲夾住大鼠的項(xiàng)背部皮膚，再用一根帶夾子的可調(diào)節(jié)長(zhǎng)度的銅線夾住大鼠背側(cè)靠近尾部的皮膚，訓(xùn)練平板的速度為8m/min，減重量為大鼠體重的70%、60%、30%，分別維持一星期。訓(xùn)練時(shí)間為每日2次，每次5min。

1.5檢測(cè)方法

1.5.1Western blot 檢測(cè)取出標(biāo)本，提取蛋白，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定標(biāo)本的蛋白濃度，以總蛋白量為30ug計(jì)算上樣體積。一抗?jié)舛?Cdc42 1∶1000，內(nèi)參β-actin 1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜，二抗以1:5000溶于T-TBS，室溫孵育1h。暗盒中放上X-ray fiLm曝光5～10min后進(jìn)行顯影和定影，采用ImageJ軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量(蛋白相對(duì)表達(dá)量=蛋白表達(dá)量/內(nèi)參β-actin表達(dá)量)。

1.5.2 免疫組化檢測(cè)樣本通過(guò)多聚甲醛固定后保存于-80℃冰箱，OCT制作凍頭，切片厚度為14微米，貼片法，每張片5個(gè)樣本，切五取一。37℃復(fù)溫后PBS洗去OCT，3%雙氧水浸泡15min，封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜，濃度(Cdc42 1∶1000)。二抗37℃孵育1h，辣根過(guò)氧化物酶浸泡15min，DAB試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后封片。光鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞。

2結(jié)果

2.1免疫印跡法結(jié)果所示，Cdc42各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量在假手術(shù)組中保持在較低水平，在模型組中表達(dá)增多。電針組、藥物組、電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)組在7、14、28d時(shí)Cdc42的表達(dá)均比模型組有不同程度的增加，差異均具有顯著性。在電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)組中，Cdc42的表達(dá)量在28d有明顯升高，與電針組相比具有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見(jiàn)表1、圖1)

組別7d14d28d假手術(shù)組0.10±0.040.09±0.030.12±0.08模型組0.36±0.070.44±0.120.62±0.18電針組0.78±0.03*1.10±0.28*1.54±0.32*FasudiL組1.06±0.25*1.64±0.0*#1.95±0.25*#電針+運(yùn)動(dòng)0.81±0.10*1.19±0.24*▲2.06±0.24*#

注：與模型組相比，*P<0.05；與電針組相比，#P<0.05；與藥物組相比，▲P<0.05。

加的趨勢(shì)，說(shuō)明神經(jīng)損傷具有一定的自愈性。觀察組與模型組相比在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)組與單純電針組相比僅在7d時(shí)差異不明顯，其余兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)組與藥物組相比，僅在7d時(shí)差異較明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在14d和28d時(shí)，藥物組雖然計(jì)數(shù)較電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)組多，但是差異不大，且差距隨著時(shí)間減少。因此從長(zhǎng)期的康復(fù)來(lái)說(shuō)，電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)該治療方案甚至?xí)?yōu)于藥物治療。

組別7d14d28d假手術(shù)組7.17±2.567.00±1.418.00±2.28模型組13.33±3.1418.00±1.4120.67±3.01電針組19.50±1.87*23.50±4.13*33.83±5.12*藥物組26.50±4.28*#33.83±5.12*#37.83±6.11*#電針+運(yùn)動(dòng)19.17±2.48*﹡▲31.67±2.80*#36.50±4.51*#

注：與模型組相比，*P<0.05；與電針組相比，#P<0.05 ；與藥物組相比，▲P<0.05。

3討論

3.1Rho/ROCK激酶信號(hào)通路Rho/ROCK是組織中普遍存在的一條參與細(xì)胞的收縮、黏附、遷移、增殖、細(xì)胞骨架的形成等生理功能的信號(hào)通路[7-8]，其關(guān)鍵分子包括Rho GTP酶，Rho激酶(Rho associated kinase ROCK)及其作用底物。髓鞘相關(guān)抑制因子(Nogo、MAG、OMgp等)激活Rho蛋白，從而啟動(dòng)該信號(hào)通路。Rho/ROCK被激活后，影響肌動(dòng)肌球蛋白的聚合而阻礙軸突再生[9-10]。因此抑制Rho/ROCk的信號(hào)傳導(dǎo)通路可能成為促進(jìn)軸突再生的一種途徑。

圖1　7天，14天組WB條帶

圖2　28天組WB條帶

圖3免疫組化組圖A：假手術(shù)組；B：模型組；C：電針組；D：藥物組；E：電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)組。圖中茶色即為陽(yáng)性細(xì)胞。

3.2Cdc42細(xì)胞分裂周期蛋白(cell division cycle)Cdc42是Rho GTPase蛋白家族的成員之一[11]。該家族蛋白具有重組細(xì)胞骨架、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)等生理功能[12-13]。Luo等[14-15]在果蠅以及神經(jīng)母細(xì)胞系上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中證實(shí)Cdc42具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞遷移及軸突樹(shù)突的生長(zhǎng)作用。研究表明RhoA和RacL、Cdc42在樹(shù)突棘延伸上存在著相互拮抗的作用，RhoA可以抑制樹(shù)突棘的延伸和生長(zhǎng)，而RacL、Cdc42促進(jìn)樹(shù)突棘的生長(zhǎng)和延伸，而在Rho/ROCK激酶信號(hào)通路激活途徑中，RhoA與激活該通路存在正相關(guān)[16]。因此，Cdc42可能具有抑制該信號(hào)通路，從而起到促進(jìn)軸突再生的作用。本課題組也證實(shí)單純夾脊電針以及電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法能夠促進(jìn)Cdc42的蛋白表達(dá)，這可能與該治療方法作用于此通路相關(guān)。

3.3減重步行訓(xùn)練(body weight support treadmill training, BWSTT)減重步行訓(xùn)練是由Barbeau等[17]于1987年在前人的理論基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的運(yùn)用于截癱患者康復(fù)治療的訓(xùn)練方法。它由一個(gè)速度可控的電動(dòng)跑臺(tái)以及上方可以對(duì)患者進(jìn)行減重的輪滑吊帶組成。這一裝置不斷改良，有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在超微環(huán)境下，BWSTT能夠促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)[18]。

BWSTT主要針對(duì)顱腦損傷、脊髓損傷等引起的下肢運(yùn)動(dòng)功能異常的患者，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床康復(fù)治療。李華等[14]將42例不完全脊髓損傷患者隨機(jī)分為BWSTT組與對(duì)照組，患者均接受常規(guī)截癱康復(fù)治療，BWSTT組在此基礎(chǔ)上，每日加減重步行訓(xùn)練1次，治療1個(gè)月后，患者的步長(zhǎng)、步速和功能性步行分級(jí)較治療前有明顯改善，且與對(duì)照組之間相比具有顯著性差異。李惠蘭等[15]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)督脈電針與減重步行訓(xùn)練在促進(jìn)橫斷性脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)以及NGF、GAP-43的蛋白表達(dá)中效果顯著，且督脈電針優(yōu)于BWSTT。

以上學(xué)者從不同的角度證明減重步行訓(xùn)練對(duì)于脊髓損傷(包括橫斷性以及不完全)的后期康復(fù)意義深重，而本課題組通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出脊髓損傷大鼠在電針與減重步行訓(xùn)練相結(jié)合的治療作用下，效果更是優(yōu)于單純電針，這一發(fā)現(xiàn)為脊髓損傷患者的臨床康復(fù)治療提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1]Ito T, Ohtori S, Hata K, et al. Rho kinase inhibitor improves motor dysfunction and Rho-associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase in mice[J].FEBS Lett, 1996,392 (2) :189-193.

[2]李振鵬，孔抗美，陳育春，等. 電針治療對(duì)大鼠脊髓損傷后Nogo-A蛋白表達(dá)的影響[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,21(3): 129-137.

[3]汪吉明，孔抗美，崔華中，等.電針對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2007,28(1) :40-41.

[4]馬睿杰，張柳娟，孫連珠，等.夾脊電針干預(yù)脊髓損傷大鼠OMgp表達(dá)的研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014.32(6):1 283-1 285.

[5]孫連珠，馬睿杰，張柳娟，等.夾脊電針干預(yù)脊髓損傷大鼠再髓鞘化的研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)刊，2014.38(5):626-630.

[6]張堯，邱有波，楊拯，等.不同波形電針對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2012,12(27): 1 097-1 101.

[7]Ren J, Fang CX. Small guanine nucleotide-binding protein Rho and myocardial function[J]. Acta Pharmacologica. Sinica. 2005,26(3):279-285.

[8]Lorand G, Guerin P, Pacaud P. Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology[J].Cire Res, 2006,98(3):322-334.

[9]Gghler S, Gallo G, Veien E. P75 neurotrophin receptor signaling regulates growth cone filopodial dynamics through modulating RhoA activity[J].Neurosci, 2004, 24(8):4 363-4 372.

[10]Salhia B, Rutten F, Nakada M, et al. Inhibition of Rho-kinase affects astrocytoma morphology, motility, and invasion through activation of Racl[J].Cancer Res, 2005, 65(19):8 792-8 800.

[11]Manneville SE, Hall A, et al. Rho GTPases in cell biology[J].Nature, 2002, 420(6916):629-635.

[12]Catherine D, Nobes, Alan H, et al. Rho, Rac, and Cdc42 GTPases Regulate the Assembly of Multimolecular Focal Complexes Associated with Actin Stress Fibers, Lamellipodia, and Filopodia[J].Cell.1995,81(1):53-62.

[13]Kozma R, Sarner S, Ahmed S, et al. Rho family GTPases and neuronal growth cone remodelling: relationship between in creased complexity in duced by Cdc42Hs, Rac1, and acetylcholine and collapse in duced by RhoA and Lysophosphatidic acid[J].Mol Cell Biol.1997,17(3):1 201-1 211.

[14]Luo L, Liao YJ, Jan YN. Distinct morphogenetic functions of similar small GTPases: Drosophila Drac1 is involved in axonal out growth and myoblast fusion. Genes[J]. Genes & development, 1994 (8) : 1 787-1 802.

[15]Kozma R, Sarner S, Ahmed S, et al. Rho famiLy GTPases and neuronal growth cone remodelling: relationship between increased complexity induced by Cdc42Hs, Rac1, and acetylcholine and collapse induced by RhoA and Lysophosphatidic acid[J].Mol and Cell Biol, 1997(17) : 1 201-1 211.

[16]Lichius A, Goryachev AB, Fricker MD, et al. CDC-42 and RAC-1 regulate opposite chemotropisms in Neurospora crassa[J].J Cell Sci.2014,127(9):1 953-1 965.

[17]Barbeau H, Rossignol S. Recovery of locomotion after chronic spinalization in the adult cat[J].Brain Res, 1987, 412 (1):84-95.

[18]張纓，紀(jì)樹(shù)榮，孫異臨，等.胸髓橫斷大鼠減重平板步行訓(xùn)練后腰髓前角神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的可塑性變化[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009,24(4):306-308.

[19]李華，李小萍，王玉龍，等.減重步行訓(xùn)練對(duì)不完全脊髓損傷患者步行能力的影響[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008.7(7):69-73.

[20]李惠蘭，劉蘭群，盧虎英，等.減重步行訓(xùn)練和督脈電針對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2012.18(10):930-933.

Effects of EA and BWSTT on The Expression of Cdc42 in SCI Model Rats

ZHANG Liu-juan1, HE Ke-lin1, MA Rui-jie1,2

1.TheThirdClinicalMedicalCollegeofZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China;

2.TheThirdAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310053,China.

Abstract:Objective: To investigate the electric-acupunture(EA) combined with BWSTT by evaluating the expression of Cdc42. Method: 90 adult maLe SD rats were randomized into the sham group (A group), the model group (B group), Jia-Ji EA group (C group) ，EA with BWSTT group (D group) and Fausidil group(E group). Spinal cords injury was made by NYU impactor on T9-T10 spinal segment. Immunohistochemical techniques detect the expression of Cdc42 in lesion segment at each time points.Results: Cdc42 expression stayed a low-level in the sham group. Expression after SCI was gradually increased, and reached a peak at 28d. The two treatment groups and drug group compared with the model group had a significant differences at 7d, 14d, 28d (P<0.05). The difference between the two treatment groups was significant at 28d (P<0.05). Conclusions: EA and BWSTT therapy may be increase the expression of Cdc42 to promote the recovery of motor function in rats by Rho / ROCK signaLing pathway. For the long-term rehabilitation after SCI, the EA combined with BWSTT superior than EA group on the recovery of motor function after SCI.

Key words:EA;BWSTT; SCI;Cdc42

收稿日期：(2015-03-28)編輯：翟興英

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

通信作者：**馬睿杰(1978—)，女，副主任中醫(yī)師，副教授。研究方向：針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。E-mail：maria7878@sina.com。