馬衛(wèi)國(guó)，王家敏，馬桂蘭，馮玉萍，馬 花，馬忠仁，喬自林*

(1．西北民族大學(xué)甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州730010)

我國(guó)新生牛血清60Coγ-射線照射技術(shù)的研究現(xiàn)狀

馬衛(wèi)國(guó)1，王家敏1，馬桂蘭2，馮玉萍1，馬 花1，馬忠仁1，喬自林1*

(1．西北民族大學(xué)甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州730010)

新生牛血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品重要的原輔材料，其質(zhì)量是生物制品質(zhì)量保證的重要環(huán)節(jié)，國(guó)內(nèi)的新生牛血清用60Coγ-射線照射已有多年，但還沒有形成統(tǒng)一的操作規(guī)范和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn).文章對(duì)我國(guó)新生牛血清60Coγ-射線照射的現(xiàn)況進(jìn)行了分析總結(jié)，同時(shí)呼吁有關(guān)部門加強(qiáng)監(jiān)督管理和技術(shù)指導(dǎo)，使60Coγ-射線照射技術(shù)在新生牛血清中得到更規(guī)范的應(yīng)用.

新生牛血清；60Coγ-射線；研究現(xiàn)狀

新生牛血清(newborn calf serum NBCS)是指出生14小時(shí)內(nèi)未進(jìn)食的健康新生牛采集分離的血清原料經(jīng)進(jìn)一步精制而成，主要用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，與基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等技術(shù)有著密切的關(guān)系，是生物醫(yī)藥技術(shù)產(chǎn)品的重要原輔材料之一[1，2].在細(xì)胞培養(yǎng)中使用新生牛血清可以供給細(xì)胞增殖和維持生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分和生物因子，但是新生牛血清來源于自然生物體新生牛，牛本身攜帶和采集加工過程有污染外源微生物和致病因子的可能，因此，使用新生牛血清存在生物安全風(fēng)險(xiǎn).在保證細(xì)胞培養(yǎng)效果的前提下，現(xiàn)階段普遍采用的多級(jí)高效膜過濾系統(tǒng)能有效攔截新生牛血清中的細(xì)菌、真菌和支原體等微生物，但對(duì)病毒等更小的致病因子仍無法完全去除.為此，美國(guó)藥典和歐洲法典要求對(duì)牛血清(包括胎牛血清和小牛血清)用56 ℃30 min滅活或30～45 kGy劑量的γ-射線照射，而且認(rèn)為這個(gè)劑量的γ-射線照射可消除外源性有害生物，但不會(huì)改變血清的理化性質(zhì)和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響[3～6].由于我國(guó)新生牛血清在采集牛齡、牛源品種、營(yíng)養(yǎng)狀況以及血清的包裝物與美國(guó)和歐洲有差別，輻照的劑量不應(yīng)與其完全一致.為建立符合我國(guó)實(shí)際的輻照參數(shù)，國(guó)內(nèi)新生牛血清生產(chǎn)廠家和使用單位從上世紀(jì)90年代就開始了輻照與滅菌、外源物消除、細(xì)胞培養(yǎng)效果等方面的研究工作，并取得大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為新生牛血清的輻照工藝提供了參考依據(jù).

1 60Co γ-輻照滅菌的機(jī)制和應(yīng)用范圍

60Co γ-輻照滅菌由來已久，是由Mink在1896年提出來的，輻照滅菌最早用于保藏食品，1930年在美國(guó)就有相關(guān)專利獲批.60Coγ-射線輻照滅菌是利用電離輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)微生物的一種有效方法，用于滅菌的射線有電子束、X-射線和γ-射線等.X-射線和γ-射線能使其他物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基(OH·H)，再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打斷氫鍵、使雙鍵氧化、破壞環(huán)狀結(jié)構(gòu)或使某些分子聚合等方式，破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，從而抑制或殺死微生物[7].輻照滅菌技術(shù)為冷滅菌，已日益廣泛地應(yīng)用于食品保鮮、衛(wèi)生材料和手術(shù)器械滅菌.20世紀(jì)70年代，60Coγ-輻照滅菌技術(shù)被引進(jìn)到我國(guó)，很快被應(yīng)用于中西藥制劑和醫(yī)療器械的滅菌.在20世紀(jì)90年代得到更廣泛和深入的研究，在輻照的劑量及輻照對(duì)制品的質(zhì)量和作用的影響做了量化的研究，如1997年衛(wèi)生部發(fā)布了中藥《60Co輻照滅菌標(biāo)準(zhǔn)》，使這項(xiàng)技術(shù)更好地為生產(chǎn)生活服務(wù)[8].

2 60Coγ-射線輻照新生牛血清的優(yōu)勢(shì)

60Coγ-射線輻照冷滅菌，對(duì)冷凍狀態(tài)存貯的新生牛血清不需要加溫和加壓等過程，既達(dá)到了滅菌和破壞病毒原微生物的目的，又最大限度地保留了血清中培養(yǎng)細(xì)胞所需的蛋白質(zhì)、多肽、激素、生長(zhǎng)因子和其他有益成份不受破壞.60Coγ-射線的穿透力強(qiáng)、消毒均勻、殺菌徹底，能夠達(dá)到產(chǎn)品深處及大包裝產(chǎn)品內(nèi)部，不受產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和包裝的影響[9～10]，特別適宜對(duì)已密封包裝的新生牛血清進(jìn)行最后處理工序，避免了生產(chǎn)過程中的二次污染，方法快捷方便，這是普通滅菌法無法達(dá)到的.60Coγ-射線輻照適合批量連續(xù)作業(yè)，無殘留、能耗少、成本低、速度快、操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn).

3 研究現(xiàn)狀

我國(guó)新生牛血清60Coγ-射線輻照應(yīng)用最早為傅牧等[11]，用劑量300萬rad(約29.4 kGy)60Coγ-射線輻照后配制成牛睪丸細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞苗的維持液，并生產(chǎn)了5批產(chǎn)品，用未照射的同批次血清作對(duì)照，進(jìn)行了收液效力、疫苗效力和保存期效檢等檢驗(yàn).結(jié)果顯示，收液效力與對(duì)照組差異不明顯(P>0.05)，疫苗效力和保存期效檢均達(dá)到當(dāng)時(shí)的《規(guī)程》要求.解決了當(dāng)時(shí)困擾新生牛血清中有零星微生物污染而正常抽檢不易檢出造成影響最終產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的問題，也為我國(guó)新生牛血清γ-射線輻照技術(shù)的應(yīng)用提供了實(shí)踐證明，使一部分新生牛血清生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品出廠時(shí)就經(jīng)過γ-射線輻照處理，從源頭上保證了生物制品生產(chǎn)中最難控制的原輔材料的無菌.1991年劉桂芳等[12]對(duì)6批無菌、BVDV和BT細(xì)胞CPE陽性的新生牛血清用不同劑量的60Coγ-射線輻照后檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)劑量為4.642 kGy時(shí)，細(xì)菌和霉菌仍為陽性，劑量上升到5.972 kGy 時(shí)，其中3批細(xì)菌和霉菌由陽性變成陰性，劑量達(dá)8.145 kGy時(shí)全部為陰性，且在這個(gè)劑量時(shí)6批新生牛血清的BT細(xì)胞CPE和BVDV均變?yōu)殛幮?；?2.5 kGy輻照后的新生牛血清對(duì)VERO細(xì)胞培養(yǎng)沒有影響，對(duì)BHK21細(xì)胞生長(zhǎng)影響較大.

進(jìn)入21世紀(jì)以來，輻照劑量控制技術(shù)日趨成熟，60Coγ-射線輻照新生牛血清研究工作趨于完善，新生牛血清的膜過濾技術(shù)也完全成熟，成品新生牛血清中無菌基本控制到了零污染，新生牛血清射線輻照的目的是去除噬菌體、支原體和病毒等更小的致病因子，以及對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)功能影響的研究.姚偉等[13]用20、30和40 kGy60Coγ-射線照射新生牛血清，并以加熱滅活的新生牛血清為對(duì)照培養(yǎng)了CHO-C28細(xì)胞.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)前期輻照組的細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)增殖效果均優(yōu)于對(duì)照組.在培養(yǎng)中期，輻照劑量為20 kGy的新生牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和分泌HBsAg與對(duì)照組接近，兩者無明顯差異(P>0.05).當(dāng)照射劑量≥30 kGy時(shí)，則抑制細(xì)胞分泌HBsAg，與對(duì)照組相比有明顯差異(P<0.05).而且還發(fā)現(xiàn)輻照三個(gè)劑量能消除新生牛血清中的熱原，但熱滅活的對(duì)照組熱原并沒有消除.李明生等[1]將已知大腸桿菌噬菌體為陽性的同批新生牛血清用4、8、12、18、24、28、32、40、44和48 kGy的60Coγ-射線輻照后檢測(cè)，結(jié)果顯示，輻照對(duì)總蛋白含量無顯著性差異(P>0.05)，當(dāng)劑量≥8 kGy時(shí)，噬菌體變?yōu)殛幮?；?dāng)劑量≥18 kGy時(shí)培養(yǎng)Vero細(xì)胞的最大增殖濃度隨劑量的增大而降低.李玉凡等[15]對(duì)8批初制新生牛血清用5、10和15 kGy60Coγ-射線輻照后檢測(cè)，結(jié)果顯示，內(nèi)毒素定性檢測(cè)輻照前后一致.噬菌體定性檢測(cè)在劑量5 kGy輻照前后一致，劑量達(dá)到10 kGy時(shí)噬菌體變?yōu)殛幮?，培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞的倍增時(shí)間輻照前后無顯著性差異(P>0.05).李福安等[16]將檢測(cè)牛腹瀉病毒和大腸桿菌噬菌體陽性且細(xì)菌內(nèi)毒素>10 EU/mL的10批新生牛血清用5、10 和15 kGy劑量60Coγ-射線輻照人后檢測(cè)，結(jié)果表明，輻照劑量為5 kGy時(shí)仍有8批牛腹泄病毒陽性及6批大腸桿菌噬菌體陽性.10 kGy時(shí)牛腹瀉病毒和大腸桿菌噬菌體均變?yōu)殛幮裕?5 kGy時(shí)細(xì)菌內(nèi)毒素仍全部>10 EU/mL.2011年李福安等[17]又對(duì)檢測(cè)牛腹瀉病毒陽性的8批新生牛血清用10 kGy劑量60Coγ-輻照后檢測(cè)病毒，并與沒有輻照處理的同批次血清對(duì)照進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)驗(yàn)證.結(jié)果表明，在10 kGy時(shí)牛腹瀉病毒全部殺滅，輻照前后培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞的倍增時(shí)間均數(shù)無顯著性差異(P>0.05).2013年王杰等[18]對(duì)4批新生牛血清分別用 8、10、15、20、25、30和40 kGy60Coγ-射線輻照后檢測(cè)，結(jié)果顯示所有批次處理后細(xì)菌、霉菌和支原體均呈陰性.當(dāng)輻照劑量25 kGy 及以下時(shí),原代CEF 細(xì)胞、Marc- 145細(xì)胞和ST細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，劑量25 kGy以上時(shí),細(xì)胞就開始脫落，并且隨著劑量升高，脫落更嚴(yán)重；當(dāng)輻照劑量20 kGy時(shí),對(duì)偽狂犬病毒繁殖無顯著影響，但對(duì)藍(lán)耳病病毒繁殖有影響.2015年武漢生物制品研究所趙新華等[19]對(duì)供應(yīng)商提供的成品新生牛血清用8和16 kGy60Coγ-射線輻照，與56 ℃30 min熱滅活的和未做處理的同批次新生牛血培養(yǎng)VERO和MRC-5細(xì)胞，從細(xì)胞形態(tài)、倍增時(shí)間和維持細(xì)胞存活時(shí)間等三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢查.結(jié)果表明，未處理的血清最好，熱滅活的最差，輻照處理的在兩者之間，而且輻照劑量高的不如劑量低的.

4 結(jié)論

60Coγ-射線輻照對(duì)新生牛血清的滅菌效果，尤其是對(duì)噬菌體、病毒、支原體及外源因子的去除，表現(xiàn)出了它的優(yōu)越性，已經(jīng)在新生牛血清生產(chǎn)技術(shù)上起到重要補(bǔ)充和完善作用.現(xiàn)階段新生牛血清生產(chǎn)企業(yè)為提高產(chǎn)品的質(zhì)量和消除生物安全風(fēng)險(xiǎn)，供應(yīng)給用于人用生物制品生產(chǎn)的新生牛血清大多數(shù)是經(jīng)過輻照的，各生產(chǎn)企業(yè)輻照的劑量沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而且產(chǎn)品上普遍沒有明示是否經(jīng)過輻照，也有可能在不知情的情況下,造成重復(fù)輻照后用物研究和生產(chǎn)的情況，使之輻照過量而引起品質(zhì)下降和資源浪費(fèi).新生牛血清為《藥典》收錄的原輔料品種，希望有關(guān)部門牽頭為該品種制訂輻照要求和技術(shù)指南，使60Coγ-射線照射技術(shù)在新生牛血清中得到更規(guī)范的應(yīng)用.

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2015-11-10

蘭州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013-4-101)；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(GNSW-2014-24)；西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(31920150029，zyp2015).

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馬衛(wèi)國(guó)(1989—)，男(回族)，寧夏固原市人，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)方面的研究.

S85

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1009-2102(2015)04-0054-03