楊海波，孟慶玲，喬 軍，才學(xué)鵬，賀志昊，劉昱成，彭葉龍，王國超，陳創(chuàng)夫，都曼·努爾坎杰

(1 石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046;3 沙灣縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 沙灣 832100)

羊口瘡病毒新疆流行株的分離鑒定及其遺傳進(jìn)化分析

楊海波1，孟慶玲1，喬 軍1，才學(xué)鵬2，賀志昊1，劉昱成1，彭葉龍1，王國超1，陳創(chuàng)夫1，都曼·努爾坎杰3

(1 石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046;3 沙灣縣畜牧獸醫(yī)站，新疆 沙灣 832100)

【目的】 研究羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)新疆流行株的遺傳變異情況。【方法】 采集新疆石河子地區(qū)疑似感染ORFV的羔羊唇部結(jié)痂病料，通過PCR擴(kuò)增、Vero傳代細(xì)胞分離培養(yǎng)、電鏡觀察、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等方法，檢測(cè)、分離和鑒定ORFV毒株，對(duì)分離鑒定的3株ORFV毒株保護(hù)性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分別進(jìn)行克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析?！窘Y(jié)果】 從病料中分離鑒定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析結(jié)果顯示，ORFV分離株保護(hù)性抗原基因B2L、F1L相對(duì)保守，B2L和F1L基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為88.6%～97.9%和86.7%～97.4%；3個(gè)毒力基因的變異相對(duì)較大，尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為91.8%～97.3%，85.2%～97.0%和71.5%～98.5%?；贐2L和VIR基因的遺傳進(jìn)化樹分析表明，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分離株均與臺(tái)灣分離株的親緣關(guān)系最近?！窘Y(jié)論】 試驗(yàn)分離的ORFV新疆流行株可能是由臺(tái)灣株與其他毒株重組后產(chǎn)生的，且其毒力基因發(fā)生了較大的變異。

羊口瘡病毒；分離鑒定；遺傳進(jìn)化分析；新疆

羊口瘡又稱羊接觸傳染性膿皰皮炎或傳染性膿瘡，是由羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)所引起的一種綿羊和山羊的接觸性傳染病。該病毒為雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約140 kb，G+C含量達(dá)64%[1]，是痘病毒科、副痘病毒屬的代表種。副痘病毒屬成員還包括小牛侵蝕性口炎病毒(Bovine pustular stomatitis virus，BPSV)、偽牛痘病毒(Pseudo-cowpox virus，PCPV)和新西蘭紅鹿副痘病毒(Parapox virus of red deer in New Zealand，PVNZ)[2-3]。

ORFV主要感染小反芻動(dòng)物如山羊和綿羊，偶爾也感染其他野生反芻動(dòng)物，如鹿、麝牛等，其中以羔羊最為易感，常引起群體發(fā)病，尤其是飼養(yǎng)密集的羊群[4]，口瘡的臨床特征是在唇部、舌、鼻端、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和痂皮。此外，本病是一種人獸共患傳染病，可通過直接接觸感染人[5]。據(jù)報(bào)道，該病發(fā)病率接近50%，敏感羊群的發(fā)病率則可接近90%，因此一旦發(fā)生該病，在給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也直接威脅著人類的健康。

疫苗接種是預(yù)防和控制口瘡病發(fā)生的有效手段。然而，近年來有研究報(bào)道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保護(hù)，出現(xiàn)免疫失敗和重復(fù)感染的現(xiàn)象，推測(cè)不同地域ORFV流行株存在遺傳變異。養(yǎng)羊業(yè)一直是新疆牧民的主要產(chǎn)業(yè)，近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和飼養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，羊口瘡在新疆各地羊群中呈暴發(fā)性流行，在易感羊群中發(fā)病率可達(dá)90%，羔羊感染后的死亡率可達(dá)30%以上[6]，給新疆養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)在新疆石河子地區(qū)分離出的3株ORFV的2個(gè)保護(hù)性抗原基因和3個(gè)毒力基因分別進(jìn)行克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析，旨在從分子水平上揭示ORFV新疆流行株的遺傳變異規(guī)律，為新疆地區(qū)ORFV的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料的采集與處理 于2012-06-2013-07在新疆石河子市周邊羊場(chǎng)采集3～4月齡疑似發(fā)生口瘡病羔羊的唇部結(jié)痂及口腔黏液備用。

對(duì)采集的山羊口唇處痂塊用無菌生理鹽水漂洗3次后剪碎、研磨并以無菌生理鹽水按體積比為 1∶10 制成懸液，加青霉素、鏈霉素各2 000 IU/mL,置4 ℃冰箱過夜,以5 000 r/min 離心10 min,取上清液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 細(xì)胞系與菌株 Vero細(xì)胞和DH5α感受態(tài)細(xì)胞均由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購自Hyclone公司，青霉素、鏈霉素、0.22 μm濾器、限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、T4 DNA 連接酶、PCR反應(yīng)試劑、pMD18-T載體、總DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和DNA Marker均購自 TaKaRa 公司。

主要儀器：PCR儀、超速離心機(jī)、超級(jí)數(shù)顯恒溫器、透射電子顯微鏡、凝膠成像儀、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床。

1.2 ORFV的PCR檢測(cè)

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank公布的ORFV保護(hù)性抗原基因B2L(GenBank登錄號(hào)：HM466933.1)的序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(表1)，引物由北京華大基因合成。

1.2.2 DNA的提取和B2L基因的PCR擴(kuò)增 用總DNA提取試劑盒抽提病毒DNA，以其為模板用B2L基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。反應(yīng)體系為:10×buffer(含MgCl2)2.0 μL，2.5 mmol/mL dNTP 0.6 μL，20 mmol/mL上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，TaqDNA 聚合酶(2.5 U/mL)0.5 mL，用DEPC處理過的雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.3 病毒分離

取1.1.1中的病料處理上清液1 mL接種于生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞，37 ℃吸附2 h，中間每隔20 min輕搖1次細(xì)胞瓶，吸附完成后棄去上清液，加入含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。如果在接種病料后4～5 d內(nèi)細(xì)胞沒有出現(xiàn)CPE，連續(xù)盲傳3代，傳至第5代還未出現(xiàn)CPE，即可判定相應(yīng)的ORFV病料為陰性。

1.4 病毒學(xué)鑒定

收集出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心20 min，取含有病毒的上清液用2%磷鎢酸溶液(2 g磷鎢酸溶于100 mL雙蒸水)負(fù)染后用電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。用純化的病毒液劃痕接種于2月齡試驗(yàn)羊唇部，每只接種0.5 mL，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，對(duì)照組以同樣的方法接種無菌PBS 0.5 mL。接種后每天對(duì)接種部位進(jìn)行病變觀察，進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)。

1.5 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的擴(kuò)增與克隆

參照GenBank公布的ORFV保護(hù)性抗原基因F1L(GenBank登錄號(hào)：AY040081.1)及毒力基因GIF(GenBank登錄號(hào)：DQ922634.1)、VIR(GenBank登錄號(hào)：AY386264.1)和VEGF(GenBank登錄號(hào)：AF106020.1)的序列，用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)合成4對(duì)特異性引物，引物序列見表1。以總DNA提取試劑盒抽提病毒基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系同1.2.2，反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，54～62 ℃(具體退火溫度以擴(kuò)增基因而定，F(xiàn)1L、VIR、GIF、VEGF和B2L基因退火溫度分別為 62，55，59，54和60 ℃)退火35 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用DNA凝膠回收試劑盒回收，然后分別與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)菌培養(yǎng)后，通過菌液PCR進(jìn)一步篩選驗(yàn)證陽性克隆。每個(gè)基因挑取鑒定正確的克隆送北京華大基因公司測(cè)序。

1.6 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析

分別從GenBank上下載已登錄的基因序列，應(yīng)用DNAStar及MEGA 5.0軟件分別對(duì)獲得的3株ORFV新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF5個(gè)基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行氨基酸同源性和遺傳進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORFV B2L基因的PCR檢測(cè)

以從病料中提取的病毒基因組DNA為模板，用B2L基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為1 137 bp的擴(kuò)增片段(圖1)，與預(yù)期的DNA片段長(zhǎng)度相符。

2.2 ORFV的分離

用Vero細(xì)胞從患病羔羊唇部痂皮中分離獲得了3株ORFV新疆流行株，分別命名為ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3。ORFV-SHZ分離株接種前5代細(xì)胞上的CPE不太明顯，盲傳至第5代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、收縮和聚堆等現(xiàn)象(圖2)，隨著連續(xù)的傳代，細(xì)胞病變?cè)絹碓矫黠@，可見細(xì)胞脫落的“拉網(wǎng)狀病變”。ORFV-SHZ1在Vero細(xì)胞上引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)見圖2。

2.3 ORFV的鑒定

通過電鏡觀察可見典型的痘病毒粒子，直徑達(dá)200 nm左右。病毒粒子外觀呈橢圓形、有囊膜，病毒粒子表面有繩索樣結(jié)構(gòu)纏繞。ORFV-SHZ1株的電鏡負(fù)染觀察結(jié)果見圖3。用0.5 mL純化病毒液劃痕接種于2月齡試驗(yàn)羊唇部，接種后1周在其口角和唇部等部位出現(xiàn)丘疹、膿皰，以后逐漸結(jié)痂愈合。接種ORFV-SHZ1的動(dòng)物臨床癥狀見圖4。對(duì)照組未見任何病變。

2.4 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF 及 VEGF基因的克隆

以從細(xì)胞收毒液中提取的ORFV-SHZ分離株的病毒基因組DNA為模板，對(duì)B2L、F1L、GIF、VIR和VEGF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度約為1 137，1 023，798，552和402 bp的擴(kuò)增片段，與預(yù)期的DNA片段長(zhǎng)度相符。ORFV-SHZ1株B2L、F1L、GIF、VIR和VEGF基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖5。測(cè)序結(jié)果顯示，以上擴(kuò)增的5個(gè)基因均為目的基因。

2.5 ORFV 新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因編碼氨基酸的同源性分析

分析結(jié)果表明，ORFV保護(hù)性抗原基因B2L、F1L相對(duì)保守，ORFVB2L和F1L基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為88.6%～97.9%和86.7%～97.4%；毒力基因VIR、GIF、VEGF的變異相對(duì)較大，尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因編碼氨基酸序列與其他參考株的同源性分別為91.8%～97.3%，85.2%～97.0%和71.5%～98.5%。ORFV-SHZ株VEGF基因氨基酸序列與ORFV-Ena、ORFV-GE、ORFV-HIS、ORFV-IJS081、ORFV-IT-C2、ORFV-IT-TO、ORFV-NA1-11、ORFV-NZ2、ORFV-Orf-119、ORFV-OVIA82、ORFV-Aichi和ORFV-D1701等12個(gè)參考株的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖6所示。

2.6 ORFV新疆流行株B2L、F1L、VIR、GIF及VEGF基因的遺傳進(jìn)化分析

基于GIF基因的遺傳進(jìn)化樹顯示，ORFV-SHZ分離株均與印度分離株(ORFV-MUK59-55)的親緣關(guān)系最近；基于VEGF的遺傳進(jìn)化樹顯示，3株ORFV-SHZ分離株均與新西蘭分離株(ORFV-NZ2)的親緣關(guān)系最近 (圖7) ；基于B2L和VIR基因的遺傳進(jìn)化樹分析表明，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2 分離株均與臺(tái)灣分離株(ORFV-Nantou/ORFV-Hoping)的親緣關(guān)系最近(圖8和圖9)；F1L基因的遺傳進(jìn)化樹顯示，分離的3株ORFV分布于2支，其中ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ3分別與意大利分離株ORFV-OV Torino和ORFV-OV-C2聚為一支，ORFV-SHZ2與美國分離株(ORFV-OV-SAOO)的親緣關(guān)系較近，聚為一支(圖9和圖10)。

3 討 論

羊口瘡是一種重要的人畜共患傳染病，可引起人和動(dòng)物發(fā)生傳染性接觸性皮炎，且傳播速度快，傳染范圍廣，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)危害最為嚴(yán)重。近年來，該病在世界各地的發(fā)生呈不斷上升趨勢(shì)，ORFV感染的宿主范圍在逐漸擴(kuò)大[7]。疫苗接種是預(yù)防和控制該病發(fā)生的有效手段。當(dāng)前國內(nèi)外主要使用常規(guī)的弱毒疫苗對(duì)該病進(jìn)行免疫防治。這些疫苗能在一定程度上降低感染率，被證實(shí)是安全有效的。然而，近年來有研究報(bào)道弱毒疫苗免疫后，不能提供有效的保護(hù)[8]，推測(cè)ORFV流行株可能發(fā)生了遺傳變異。Oem等[9]分別在2009和2012年對(duì)韓國ORFV分離株ORF/09、ORF/2011株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示B2L和VIR基因存在著變異，并指出ORFV感染宿主有從奶山羊向黑山羊過渡的趨勢(shì)；Chan等[10]對(duì)臺(tái)灣ORFV分離株的研究結(jié)果表明，ORFV-A32L基因存在有較大變異；Li等[11]對(duì)ORFV-Nongan分離株NA1/11的遺傳進(jìn)化研究結(jié)果顯示，ORFV110和ORFV132(VEGF)基因均發(fā)生了較大的變異。本試驗(yàn)分別對(duì)ORFV分離株的2個(gè)保護(hù)性抗原基因和3個(gè)毒力基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明，ORFV新疆流行株存在著變異現(xiàn)象，尤其是毒力基因VEGF的變異最大，與GenBank上公布的其他參考株的VEGF編碼氨基酸序列的同源性為71.5%～98.5%?；贐2L和VIR基因的遺傳進(jìn)化樹顯示，ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2與臺(tái)灣分離株(ORFV-Nantou/ORFV-Hoping)的親緣關(guān)系最近，因此推測(cè)ORFV新疆流行株可能是由臺(tái)灣株與其他毒株重組后產(chǎn)生的。

目前，在ORFV上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的毒力基因主要有VIR、vIL-10、GIF和VEGF。這些基因都位于ORFV基因組2個(gè)末端的反向重復(fù)序列中，屬于ORFV基因組的易變區(qū)域[12]。研究發(fā)現(xiàn)，VIR基因編碼的干擾素抑制蛋白，能抑制干擾素，在病毒感染早期發(fā)揮重要作用；vIL-10編碼蛋白可誘發(fā)不同細(xì)胞產(chǎn)生免疫刺激或免疫抑制作用，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、T細(xì)胞活化增殖及降低抗原遞呈等作用，在病毒的免疫逃避機(jī)制中發(fā)揮著重要作用；VEGF編碼的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在病毒感染的宿主中能引起血管內(nèi)皮強(qiáng)烈增生和血管高度擴(kuò)張[13]。GIF是一種特異性的雙重細(xì)胞因子結(jié)合蛋白，能夠與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)結(jié)合，并抑制二者活性，且僅有副痘病毒屬成員才具有編碼GIF基因序列的功能[14]。到目前為止，對(duì)ORFV毒力基因遺傳變異的研究報(bào)道還較少，尚不清楚這些毒力基因變異對(duì)其致病力的影響。因此，開展ORFV主要保護(hù)性抗原基因和毒力基因及其編碼蛋白的研究，不僅有助于闡明ORFV遺傳變異的規(guī)律和致病分子機(jī)理，而且可為該病的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

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Isolation,identification and phylogenetic analysis of Orf virus epidemic strains in Xinjiang

YANG Hai-bo1,MENG Qing-ling1,QIAO Jun1,CAI Xue-peng2,HE Zhi-hao1, LIU Yu-cheng1,PENG Ye-long1,WANG Guo-chao1,CHEN Chuang-fu1,NUERKANJIE Du-man3

(1KeyLaboratoryofPreventionandcontrolofAnimalDisease,DepartmentofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China;2LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046,China;3AnimalHusbandryandVeterinaryStation,Shawan,Xinjiang832100,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the genetic evolution situation of Orf virus (ORFV) epidemic strains in Xinjiang.【Method】 Samples were collected from lamb with suspected ORFV infection in Shihezi region,and the strains were identified by PCR amplification,isolation and culture in Vero cell,electron microscopy,and animal regression.The major protective antigen genesB2LandF1Land virulence genesVIR,GIFandVEGFof the three identified ORFV were cloned,sequenced,and phylogenetically analyzed.【Result】 Three ORFV isolates(ORFV-SHZ1,ORFV-SHZ2,and ORFV-SHZ3) were isolated and identified from collected samples.ORFV protective antigen genesB2LandF1Lwere relatively conservative,sharing 88.6%-97.9% and 86.7%-97.4% identities in amino acid sequence with other reference strains.The virulence gene variation was significant,especially forVEGFgene.Amino acid identities ofVIR,GIFandVEGFgenes with other reference strains were 91.8%-97.3%,85.2%-97.0%,and 71.5%-98.5%,respectively.Phylogenetic tree analysis based onB2LandVIRgenes showed that ORFV-SHZ1 and ORFV-SHZ2 strains were close to isolates from Taiwan.【Conclusion】 Recombination occurred among Shihezi isolates,Taiwan strains and other strains, causing great variation in virulence genes.

Orf virus;isolation and identification;phylogenetic analysis;Xinjiang

2013-09-29

兵團(tuán)國際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(2012BC006)；國家農(nóng)業(yè)公益行業(yè)專項(xiàng)子課題(201303037-5)

楊海波(1988-)，男，河南舞陽人，碩士，主要從事病原分子生物學(xué)研究。E-mail:yhb1988043@126.com

喬 軍(1971-)，男，陜西榆林人，教授，博士，主要從事分子病毒學(xué)研究。E-mail:qj710625@163.com

時(shí)間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.001

S852.65+4

A

1671-9387(2015)02-0014-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.001.html