代如意，李 莉，殷中瓊，賈仁勇,b，李 曼，康 帥，彭練慈，曲 徑，侯婉晴，胡志強(qiáng)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a 動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；b 預(yù)防獸醫(yī)研究所,四川 溫江 611130)

5味中藥對雞白痢沙門氏菌的體外聯(lián)合抑菌研究

代如意a，李 莉a，殷中瓊a，賈仁勇a,b，李 曼a，康 帥a，彭練慈a，曲 徑a，侯婉晴a，胡志強(qiáng)a

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a 動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；b 預(yù)防獸醫(yī)研究所,四川 溫江 611130)

【目的】 探討訶子、虎杖、紫花地丁、夏枯草和何首烏提取物對雞白痢沙門氏菌的抑制效果?！痉椒ā?采用超聲波處理、乙醇回流、水浴加熱的方法，提取訶子、虎杖、紫花地丁、夏枯草、何首烏5味中藥的有效成分，采用二倍試管稀釋法分別測定各中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的最小抑菌質(zhì)量濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(Minimal bactericidal concentration，MBC)，并采用肉湯稀釋棋盤法，測定中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的聯(lián)合抑菌效果?！窘Y(jié)果】 訶子、虎杖、紫花地丁、夏枯草、何首烏提取物對雞白痢沙門氏菌的MIC、MBC值分別為15.60～62.50，15.60～125.00 mg/mL(以生藥計(jì)算)?；⒄?、夏枯草、紫花地丁、何首烏與訶子聯(lián)合用藥時，對雞白痢沙門氏菌的聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)均為0.25；虎杖與紫花地丁、夏枯草，紫花地丁與夏枯草聯(lián)合用藥時的FICI為1.25～2；何首烏與虎杖、紫花地丁、夏枯草聯(lián)合用藥時的FICI均大于2。【結(jié)論】 虎杖、夏枯草和訶子提取物對雞白痢沙門氏菌具有較強(qiáng)的體外抑菌活性。訶子與虎杖、紫花地丁、何首烏、夏枯草聯(lián)合應(yīng)用，其抑菌呈協(xié)同作用；虎杖與紫花地丁、夏枯草，紫花地丁與夏枯草聯(lián)合應(yīng)用，其抑菌呈無關(guān)作用；何首烏與虎杖、紫花地丁、夏枯草聯(lián)合應(yīng)用，其抑菌呈拮抗作用。

中藥提取物；雞白痢沙門氏菌；體外抑菌；聯(lián)合抑菌

雞白痢桿菌病是由沙門氏菌引起的一種多發(fā)和常發(fā)傳染病，對雛雞危害較嚴(yán)重，主要侵害2～3周齡內(nèi)的雛雞，世界各國都有發(fā)生，造成的經(jīng)濟(jì)損失慘重。該病對育成雞和成年雞呈慢性或隱性感染，特別是病愈后1個月的雞，主要損害生殖系統(tǒng)，影響生產(chǎn)性能，病愈雞可長期帶菌和經(jīng)蛋傳播感染，成為危險(xiǎn)傳染源，而且雞白痢沙門氏菌能夠在家禽腸道內(nèi)定殖，在加工家禽胴體時，污染雞肉，繼而進(jìn)入食物鏈，成為人類沙門氏菌感染的潛在來源[1-3]。而獸藥殘留于動物機(jī)體內(nèi)，在肌肉、內(nèi)臟及雞蛋中藥物殘留超標(biāo)，休藥期較短等現(xiàn)象經(jīng)常有發(fā)生。據(jù)報(bào)道，人體在長期低劑量抗生素的脅迫下，體內(nèi)的耐藥菌株增加，耐藥菌株可能產(chǎn)生超級耐藥性，對人類的健康產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅[4-5]。隨著人們對健康關(guān)注度的增加，在家禽生產(chǎn)中，綠色、無公害、無耐藥性的新抗菌中獸藥將逐步成為市場的主導(dǎo)。為尋找抗雞白痢沙門氏菌的中獸藥，本試驗(yàn)研究了訶子、虎杖、紫花地丁、夏枯草、何首烏等5味中藥對雞白痢沙門氏菌的聯(lián)合抑菌作用，篩選出聯(lián)合抑菌增強(qiáng)的中藥，為研發(fā)抗雞白痢沙門氏菌的中獸藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基 雞白痢沙門氏菌(CVCC1792)菌種，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。MH肉湯培養(yǎng)基(Meller-Hinton broth)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar)、麥康凱培養(yǎng)基(MacConkey agar)、Baird Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Baird-Parker agarbase)、SS瓊脂培養(yǎng)基(Salmomella Shigella agar)，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器 包括中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)、手提式高壓滅菌器YWQ．SG41．280(海益恒試驗(yàn)儀器有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS-40X-50(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、SW-CJ-IB型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R502B(上海亞榮生化儀器廠)、HS-120D超聲波清洗機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所)。

1.1.3 中藥材 虎杖(產(chǎn)地四川，批次081102)、訶子(產(chǎn)地云南，批次090401)、紫花地丁(產(chǎn)地四川，批次110502)均購于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司；何首烏(產(chǎn)地宜賓，批次080933)購于四川宜賓市中藥材基地；夏枯草(產(chǎn)地四川，批次112403)購于成都市荷花池中藥材市場。

1.2 方 法

1.2.1 中藥提取物的制備 參考文獻(xiàn)[6-10]的方法，采用超聲波處理、乙醇回流、水浴加熱方法制備5味中藥的提取物，最后將提取物濃縮得到的提取物浸膏，編號后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 雞白痢沙門氏菌菌懸液的制備 取9支滅菌試管，每支試管中加入4.5 mL生理鹽水，第1管加入0.5 mL在MH肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)的雞白痢沙門氏菌，之后依次10倍稀釋至第9管。用微量移液器取105～109稀釋梯度的稀釋液0.1 mL于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，用“L”棒均勻涂布，每個稀釋度涂3個平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，對菌落在30～300個的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，求平均值，以CFU/mL為單位。最后將其稀釋至106～107CFU/mL菌落。

1.2.3 中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)、最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)測定 采用二倍試管稀釋法測定：取菌液100 μL分別加入含有不同質(zhì)量濃度(以生藥計(jì)算)中藥提取物的MH肉湯培養(yǎng)基中，肉湯培養(yǎng)基中中藥提取物質(zhì)量濃度自第1試管開始依次倍比釋釋至第7試管(最終質(zhì)量濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.63，7.81和3.95 mg/mL)，以第8試管中不加中藥提取液為空白對照。各試管中MH肉湯培養(yǎng)基和藥液的量均為1 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，觀察細(xì)菌生長情況，與空白對照比較，以肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低濃度判定為中藥的最小抑菌質(zhì)量濃度。

將上述中藥組完全抑制的各管中液體涂布接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。以肉眼觀察菌落不生長視為細(xì)菌被100%殺滅，此時的最低藥物質(zhì)量濃度值為其MBC值。參考劉忠義等[11]介紹的判斷標(biāo)準(zhǔn)，按照試管中細(xì)菌的生長情況判定，當(dāng)MIC<7.80 mg/mL，為高度敏感；7.80 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL，為中度敏感；MIC>250 mg/mL，為不敏感。

1.2.4 5味中藥聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 采用肉湯稀釋棋盤法[12]，測定(3個重復(fù))5味中藥聯(lián)合作用時的體外抗菌活性，以各藥對應(yīng)MIC值的2倍、1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍等濃度分別進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果以聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)：FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.5 2為拮抗作用[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的體外抑菌活性

5味中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的體外抑菌活性見表1。由表1可知，不同中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的抑菌效果不同，其中虎杖提取物對雞白痢沙門氏菌的MIC和MBC值均為 15.60 mg/mL；夏枯草、訶子提取物的MIC和MBC均為31.25 mg/mL；何首烏、紫花地丁提取物的MIC值為62.50 mg/mL，MBC值為分別為62.50和 125.00 mg/mL。

2.2 中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的體外聯(lián)合抑菌活性

5味中藥提取物對雞白痢沙門氏菌的體外聯(lián)合抑菌活性見表2。

注：A.虎杖；B.紫花地??；C.何首烏；D.夏枯草； E.訶子。當(dāng)FICI ≤0.5 時為協(xié)同作用；0.52時為拮抗作用。

Note:A.Polygonumcuspidatum；B.Violaphilipica；C.Polygonummultiflorium；D.Prunellavulgaris；E.TerminaliachebulaRetz.FICI≤0.5,synergies effect;0.52,antagonism effect.

由表2可知，虎杖(A)、紫花地丁(B)、何首烏(C)、夏枯草(D)與訶子(E)聯(lián)合用藥對雞白痢沙門氏菌的FICI值均為0.25，表現(xiàn)為協(xié)同作用。其中紫花地丁提取物的MIC從62.50降到7.80 mg/mL，訶子提取物的MIC值從31.25降到3.90 mg/mL?；⒄扰c紫花地丁、虎杖與夏枯草、紫花地丁與夏枯草對雞白痢沙門氏菌的 FICI 值為1.25～2，表現(xiàn)為無關(guān)作用。虎杖與何首烏、紫花地丁與何首烏、何首烏與夏枯草對雞白痢沙門氏菌的 FICI 均值大于2，表現(xiàn)為拮抗作用。

3 討 論

不同中藥提取物的抑菌活性不同，大多數(shù)中藥的有效提取物對細(xì)菌、病毒等都有一定的作用。本研究結(jié)果表明，虎杖、訶子、紫花地丁、夏枯草、何首烏等5味中藥有效成分對雞白痢沙門氏菌均有一定的抑殺效果。虎杖具有廣譜的抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、甲型或乙型鏈球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、肺炎雙球菌以及綠膿桿菌等均有抑制作用[14-15]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，虎杖提取物對雞白痢沙門氏菌的體外抑菌效果明顯，其MIC值為15.60 mg/mL，說明虎杖對細(xì)菌的抗菌活性顯著。陳虹等[16]研究報(bào)道，訶子單味藥對雞白痢沙門氏菌的MIC為31.25 mg/mL，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相符，其抗菌活性成分可能為訶子多元酚類，但具體是何種成分發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。據(jù)李安林等[17]研究表明，夏枯草中總黃酮有抗菌作用，但尚未見報(bào)道其對雞白痢沙門氏菌的抑菌作用。本研究結(jié)果表明，夏枯草提取物對雞白痢沙門氏菌具有抗菌效果。

本研究結(jié)果表明，訶子與虎杖、紫花地丁、何首烏和夏枯草聯(lián)合用藥對雞白痢沙門氏菌的FICI均為0.25，表現(xiàn)為協(xié)同作用，聯(lián)合用藥后訶子提取物MIC值為3.90 mg/mL，而虎杖、紫花地丁、何首烏和夏枯草的4味中藥提取物MIC值為1.95～7.80 mg/mL，訶子和其他4味中藥提取物的MIC值都降低，說明這4味中藥與訶子聯(lián)合用藥后抑菌活性明顯增強(qiáng)，該結(jié)果可能與每味中藥的提取方法有關(guān)。

本研究中，虎杖和紫花地丁聯(lián)合用藥的FICI為1.25，表現(xiàn)為無關(guān)作用。但是紫花地丁提取物MIC值由62.50 mg/mL降為15.60 mg/mL，可知虎杖提取物增強(qiáng)了紫花地丁有效成分的作用，目前尚未見這2種中藥聯(lián)合抑菌方面的報(bào)道，為虎杖和紫花地丁藥效的進(jìn)一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究中，何首烏和虎杖、紫花地丁、夏枯草聯(lián)合用藥的FICI均大于2，表現(xiàn)為拮抗作用。何首烏提取的有效成分是二苯乙烯苷，虎杖提取的有效成分是虎杖苷，紫花地丁和夏枯草提取的有效成分是總黃酮，當(dāng)何首烏與虎杖、紫花地丁、夏枯草聯(lián)合用藥時，提取的有效成分可能發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，有效成分不能發(fā)揮其抗菌作用，因而表現(xiàn)為拮抗作用。

[1] 劉海俠,凌天星,馬國輔,等.沙門氏菌在雞群中的危害 [J].中國禽業(yè)導(dǎo)航,2008,25(8):34.

Liu H X,Ling T X,Ma G F,et al.Damage ofSalmonellain the poultry flocks [J].Guide to Chinese Poultry,2008,25(8):34.(in Chinese)

[2] 謝寶年.雞白痢的危害與控制措施 [J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問,2011(9):2-3.

Xie B N.Salmonellameasures of harm and control [J].Technical Advisor for Animal Husbandry,2011(9):2-3.(in Chinese)

[3] 宋連敏,梁立生,宋丙奎,等.雞白痢沙門氏菌病的診斷與防治 [J].家禽科學(xué),2009(12):30-31.

Song L M,Liang L S,Song B K,et al.Diagnosis and therapy ofSalmonella[J].Poultry Science,2009(12):30-31.(in Chinese)

[4] 徐成剛.獸用抗生素對公共衛(wèi)生的影響 [J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2002(6):45-48.

Xu C G.Veterinary antibiotics to public health of effects [J].Progress in Veterinary Medicine,2002(6):45-48.(in Chinese)

[5] Titus A M,Msagati,Mathew M N.Determination of β-lactam residues in foodstuffs of animal origin using supported liquid membrane extraction and liquid chromatography-mass spectrometry [J].Food Chemistry,2007,100: 836-844.

[6] 陽元娥,譚 偉.夏枯草總黃酮超聲提取工藝 [J].食品研究與開發(fā),2011,32(4):31-34.

Yang Y E,Tan W.Technics of ultrasound-assisted extraction of total flavonoids inPrunellavulgaris[J].Food Research and Development,2011,32(4):31-34.(in Chinese)

[7] 劉 丹,湯海峰,張三奇,等.虎杖中有效成分提取方法的研究 [J].中成藥,2007,29(4):516-521.

Liu D,Tang H F,Zhang S Q,et al.The optimization of extraction process for effective ingredients inPolygonumcuspidatum[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2007,29(4):516-521.(in Chinese)

[8] 徐 燕,典靈輝,陸江贏,等. 德慶首烏二苯乙烯苷提取的研究 [J].遼寧化工,2011,40(1):4-6.

Xu Y,Dian L H,Lu J Y,et al.Research of extraction aboutPolygonummultiflorumThund [J].Liaoning Chemical Industry,2011,40(1):4-6.(in Chinese)

[9] 付戈妍,付 克,王洪光,等.超聲波提取紫花地丁總黃酮及含量測定 [J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào),2008,23(5):512-513.

Fu G Y,Fu K,Wang H G,et al.Extraction and determinaation total flavone fromViolaphilippicacav by spectrzophotometry [J].Journal of Inner Mongolia University,2008,23(5):512-513.(in Chinese)[10] 王 雷,富麗靜,于 翔,等.中草藥五倍子、訶子有效成分提取工藝的研究 [J].水生態(tài)學(xué)雜志,2009,2(1):135-137.

Wang L,Fu L J,Yu X,et al.Research of extraction aboutHerbsnutgallandMyrobalanof active ingredient [J].Journal of Hydroecology,2009,2(1):135-137.(in Chinese)

[11] 劉忠義,張國威,何云志.解脲支原體中藥藥敏試驗(yàn) [J].中華皮膚科雜志,1996,29(5):349-351.

Liu Z Y,Zhang G W,He Y Z.Observation of antibacterial of Chinese medicinal herbs against ureapiasma urealyticuminvitro[J].Chinese Journal of Dermatology,1996,29(5):349-351.(in Chinese)

[12] 舒凌玲,陳 雅,吳 畏,等.奧硝唑聯(lián)用醋酸氯己定對白色念珠菌的體外抗菌活性考察 [J].中國藥業(yè),2005,14(5):27-28.

Shu L L,Chen Y,Wu W,et al.The study on antibacterial activity of ornidazole combined with chlorhexidine acetate againstCandidaalbicansinvitro[J].China Pharmaceuticals,2005,14(5):27-28.(in Chinese)

[13] 周文中,畢可東,鄒本革,等.氟苯尼考與鹽酸土霉素體外聯(lián)合抑菌效果研究 [J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(7):201-202.

Zhou W Z,Bi K D,Zou B G，et al.Effect research ofvitrocombination inhibitory florfenicol and oxytetracycline hydrochloride [J].China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2011,38(7):201-202.(in Chinese)

[14] 李菁雯,陳祥龍,孟祥智.虎杖及其提取物的研究進(jìn)展 [J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2011,39(3):103-106.

Li J W，Chen X L,Meng X Z.Advances ofPolygonumcuspidatumand extract [J].Acta Chinese Medicine and Pharmacology，2011,39(3):103-106.(in Chinese)

[15] 公衍玲,王宏波,趙文英,等.虎杖及配伍醇提液不同極性提取物的抑菌活性 [J].青島科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,29(5):419-421.

Gong Y L,Wang H B,Zhao W Y,et al.Antibacterial activities of different polarity extractsin ethonal solutions ofPolygonumcuspidatum[J].Journal of Qingdao Universtity of Science and Technology:Natural Science Edition,2008,29(5):419-421.(in Chinese)

[16] 陳 虹,劉 磊,吳 潤,等.12種中草藥對8種畜禽腸道病原菌的體外抑菌試驗(yàn) [J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009(3):26-30.

Chen H,Liu L,Wu R,et al.Bacteriostatic testinvitroof the Chinese herbal medicine against livestock and poultry pathogenic enteral bacteria [J].Journal of Gansu Agricultural University,2009(3):26-30.(in Chinese)

[17] 李安林,熊雙麗.夏枯草總黃酮的提取與抑菌活性研究 [J].食品研究與開發(fā),2011,32(5)：27-29.

Li A L,Xiong S L.Extraction and bacteriostatic activities of flavonoids fromPrunellavulgarisLinn [J].Food Research and Development,2011,32(5)：27-29.(in Chinese)

Combined anti-bacterial effects of five Chinese traditional medicines againstSalmonellapullorum

DAI RU-yia,LI Lia,YIN Zhong-qionga,JIA Ren-yonga,b,LI Mana,KANG Shuaia,PENG Lian-cia,QU Jinga,HOU Wan-qinga,HU Zhi-qianga

(aCollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China;bPreventiveVeterinaryResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang,Sichuan611130,China)

【Objective】 The combined antibacterial effects of extracts from 5 Chinese traditional medicines includingTerminaliachebulaRetz,Polygonumcuspidatum,Violaphilipica,Prunellavulgaris,andPolygonummultiflorumagainstSalmonellapullorumwere studied.【Method】 Ultrasonic processing,ethanol refluxing and water bath heating methods were used to extract the effective components ofTerminaliachebulaRetz,Polygonumcuspidatum,Violaphilipica,Prunellavulgaris,andPolygonummultiflorum.Double tube dilution method was used to determine the minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimal bactericidal concentrations (MBC) of the extracts againstSalmonellapullorum.Then broth chessboard method was used to determine the combined effect of extracts from traditional Chinese medicines onSalmonellapullorum.【Result】 The MIC and MBC ranges of the extracts ofTerminaliachebulaRetz,Polygonumcuspidatum,Violaphilipica,Prunellavulgaris,andPolygonummultifloriumagainstSalmonellapullorumwere 15.60-62.50 and 15.60-125.00 mg/mL(according to crude drugs),respectively.The FICI values of effective components ofTerminaliachebulaRetz combined withPolygonumcuspidatum,Violaphilipica,Prunellavulgaris,andPolygonummultifloriumwere all 0.25.The FICI values of effective components ofPolygonumcuspidatumcombined withViolaphilipica,Prunellavulgaris,Violaphilipicacombined withPrunellavulgariswere 1.25-2.The FICI values of effective components ofPolygonummultifloriumcombined withPolygonumcuspidatum,ViolaphilipicaandPrunellavulgariswere greater than 2.【Conclusion】 The extracts ofPolygonumcuspidatumandTerminaliachebulaRetz had strong effects againstSalmonellapulloruminvitro.TerminaliachebulaRetz combined withPolygonumcuspidatum,Violaphilipica,PrunellavulgarisandPolygonummultifloriumhad synergistic effects.Polygonumcuspidatumcombined withViolaphilipicaandPrunellavulgarishad no synergistic effects.Polygonummultifloriumcombined withTerminaliachebulaRetz,Polygonumcuspidatum,ViolaphilipicaandPrunellavulgarishad antagonism effects.

herbal extract;Salmonellapullorum;antibacterial activityinvitro;combination antibacterial

2013-10-12

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目“現(xiàn)代中獸藥研究與新藥創(chuàng)制”(2011BAD34B03-4)

代如意(1986-)，女，吉林松原人，碩士，主要從事天然藥物研究。E-mail:luoyunxiaoyi@163.com

殷中瓊(1968-)，女，重慶榮昌人，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail:yinzhongq@163.com

時間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.004

S853.72

A

1671-9387(2015)02-0034-04

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.004.html