王美娟，王 洋，申澤丹，馬旭君，撒 剛，鄧澍榮，劉丹丹，張玉紅，沈 昕，陳少良

(1 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2 房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)大陶村委會(huì)，北京 102403)

胡楊PeSOS1對(duì)擬南芥鹽誘導(dǎo)H2O2信號(hào)途徑的調(diào)控

王美娟1，王 洋1，申澤丹1，馬旭君1，撒 剛1，鄧澍榮1，劉丹丹2，張玉紅1，沈 昕1，陳少良1

(1 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2 房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)大陶村委會(huì)，北京 102403)

【目的】 研究胡楊質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)通過(guò)H2O2信號(hào)途徑對(duì)鹽脅迫的感知和適應(yīng)作用。【方法】 克隆胡楊質(zhì)膜SOS1基因(PeSOS1)，并將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中，比較野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在100 mmol/L NaCl脅迫下的萌發(fā)率，根長(zhǎng)，干質(zhì)量，K+、Na+和Ca2+含量，活體植株根尖離子流(K+、Na+和 H+)的流動(dòng)情況，H2O2的產(chǎn)生和抗氧化酶活性的變化以及抑制劑對(duì)根尖離子流的影響，分析100 mmol/L NaCl脅迫下異源表達(dá)PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥耐鹽性的差異。【結(jié)果】 在NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥株系的萌發(fā)率、根長(zhǎng)和干質(zhì)量明顯高于野生型擬南芥；轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥K+和Ca2+含量也高于野生型擬南芥，而Na+含量較野生型擬南芥低。100 mmol/L NaCl處理后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)與NaCl脅迫前相比下降幅度較小。轉(zhuǎn)PeSOS1基因植株在NaCl脅迫下能更快地產(chǎn)生H2O2，并使抗氧化酶保持較高的活性。SOS1抑制劑阿米洛利(Amiloride)對(duì)NaCl脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖離子流的變化有明顯影響，用質(zhì)膜NADPH氧化酶抑制劑DPI (抑制H2O2的產(chǎn)生)處理后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥根尖K+內(nèi)流減弱，Na+外流和H+內(nèi)流增強(qiáng)，植株維持K+和Na+平衡的能力減弱?！窘Y(jié)論】 在擬南芥中異源表達(dá)PeSOS1基因可促進(jìn)H2O2快速產(chǎn)生，維持了SOS1 mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控了K+和Na+平衡，并激活了抗氧化防御系統(tǒng)，因而顯著提高了其耐鹽性。

胡楊；鹽脅迫；轉(zhuǎn)基因擬南芥；質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)；H2O2信號(hào)；K+/Na+平衡；離子流

質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)基因在植物抗鹽中的重要作用已廣為人知。2007年，Wu等[1]用RACE技術(shù)克隆了胡楊SOS1蛋白的基因PeSOS1 (GenBank登錄號(hào):DQ517530.1)，其cDNA全長(zhǎng)為3 665 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)3 438 bp的開(kāi)放讀碼框，編碼1 145個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為127 ku，預(yù)測(cè)此蛋白N端有12個(gè)跨膜區(qū)，其跨膜區(qū)與其他植物和微生物高度相似；C端有一個(gè)位于胞質(zhì)內(nèi)的長(zhǎng)親水性尾巴，其氨基酸序列與擬南芥的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AtSOS1)相似度為64%，在鹽脅迫下其蛋白水平會(huì)上調(diào)，轉(zhuǎn)化到缺失Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EcNhaA 和 EcNhaB活性的鹽敏感大腸桿菌EP432中后，發(fā)現(xiàn)可以抑制大腸桿菌對(duì)鹽的敏感性，提高其耐鹽性?？贵w定位試驗(yàn)結(jié)果證明，PeSOS1定位在質(zhì)膜上，其功能是將細(xì)胞內(nèi)的Na+排出胞外以避免胞質(zhì)內(nèi)過(guò)多Na+的積累；鹽脅迫下，胡楊葉片中PeSOS1的表達(dá)上調(diào)，質(zhì)膜H+-ATPase也同時(shí)上調(diào)；上調(diào)的質(zhì)膜H+-ATPase可為PeSOS1外排Na+提供動(dòng)力[2]。Chung等[3]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下本身不穩(wěn)定的AtSOS1 mRNA穩(wěn)定性有所增加，主要是由活性氧介導(dǎo)所致；AtSOS1活性同時(shí)受轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[4]。但目前對(duì)SOS1和H2O2的相互作用機(jī)制尚不清楚。

本試驗(yàn)將胡楊的PeSOS1基因轉(zhuǎn)到擬南芥中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同轉(zhuǎn)基因株系擬南芥中PeSOS1表達(dá)量的差異；并利用3個(gè)PeSOS1表達(dá)量較高的株系進(jìn)行耐鹽性及PeSOS1與H2O2相關(guān)性研究，比較野生型擬南芥和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下的萌發(fā)率、根長(zhǎng)、離子含量、根尖離子流、H2O2的產(chǎn)生及相關(guān)抗氧化酶活性等指標(biāo)，以期為探明胡楊PeSOS1響應(yīng)鹽脅迫的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物 胡楊為新疆2年生胡楊實(shí)生苗，4月份將其栽種在10 L塑料花盆里(1株/盆)，培養(yǎng)基質(zhì)為土和砂按1∶1體積比混合的基質(zhì)，置于北京林業(yè)大學(xué)的苗圃中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間視天氣情況定期澆水和除草，且每隔1周每桶苗木澆1 L Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液。

擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型(Columbia ecotype,Col-0)，由北京林業(yè)大學(xué)沈昕實(shí)驗(yàn)室留存。培養(yǎng)條件為：溫度25/22 ℃(晝/夜)，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度150 μmol/(m2·s)，光照周期為8 h黑暗/16 h光照。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與試劑 大腸桿菌TOP10及感受態(tài)，由北京林業(yè)大學(xué)沈昕實(shí)驗(yàn)室留存或制備；農(nóng)桿菌GV3101，購(gòu)自北京科百奧生物科技有限責(zé)任公司；中間載體pENTR/D-TOPO試劑盒(2 580 bp，篩選標(biāo)記為卡那霉素)，購(gòu)自Invitrogen公司。植物穩(wěn)定表達(dá)載體pK7m34GW2-8m21GW3D.0 (pK7，15 801 bp，篩選標(biāo)記為壯觀霉素)，由北京林業(yè)大學(xué)沈昕實(shí)驗(yàn)室留存。

rTaqDNA polymerase、ExTaqDNA polymerase，Takara (寶生物工程大連有限公司)生產(chǎn)；Silwet-77，美國(guó)GE公司生產(chǎn)；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix、RNA提取試劑Trizol reagent和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司；Oligo (dT)15，購(gòu)自Promega；十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、DEPC、瓊脂糖、氨芐青霉素、卡那青霉素和壯觀霉素，為Sigma公司生產(chǎn)；胰蛋白胨、酵母提取物，為英國(guó)Oxoid公司生產(chǎn)；其他普通國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭楸本┗S生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 胡楊RNA提取與cDNA 一鏈的合成 按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取胡楊幼嫩葉片的總RNA[2]，用SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2PeSOS1的克隆 根據(jù)胡楊質(zhì)膜PeSOS1(GenBank登錄號(hào):DQ517530.1)的序列，用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(S-P1f：5′-ATGGGGAGCGCGATAGAAACAG-3′，S-P1r：5′-CTAAGAAGCATGATGGAACGAC-3′) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：2.5 μL 10×Taqbuffer，17.5 μL ddH2O，1 μL dNTP mix (10 mmol/L)，引物(S-P1f、S-P1r)各1 μL，1 μL DNA模板，1 μL ExTaqDNA polymerase (5 U/μL)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃反應(yīng)后延伸10 min。用ddH2O代替模板為陰性對(duì)照 。

1.2.3 載體的構(gòu)建PeSOS1測(cè)序無(wú)誤后，用帶接頭的引物,即CACC+S-P1f和S-P1r擴(kuò)增PeSOS1，取定量PCR產(chǎn)物按照pENTR/D-TOPO試劑盒說(shuō)明書(shū)直接構(gòu)建中間載體pENTR/D-TOPO-PeSOS1；反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后鋪板，挑單菌落提質(zhì)粒，鑒定成功后按照Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix說(shuō)明書(shū)重組pENTR/D-TOPO-PeSOS1與pK7，構(gòu)建植物表達(dá)載體pK7-PeSOS1。利用Primer Primier 5.0軟件，設(shè)計(jì)鑒定檢測(cè)所用引物S-P2f：5′-AGGATGAGGAACTTGGA-CCTG-3′，S-P2r：5′-CCTGAGGAAATGTAACAC-GGAC-3′，其PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度約600 bp。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：ddH2O 18 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 1 μL,S-P2f 1 μL,S-P2r 1 μL,DNA 1 μL,rTaqDNA polymerase 0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃反應(yīng)后延伸10 min,然后于10 ℃保存。

1.2.4 擬南芥的轉(zhuǎn)化 將pK7-PeSOS1和空載體pK7 質(zhì)粒(陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后，用蘸花侵染方法轉(zhuǎn)化擬南芥[5]。用卡那霉素篩選擬南芥轉(zhuǎn)PeSOS1陽(yáng)性植株，再根據(jù)孟德?tīng)柗蛛x定律篩選純合子，用其種子開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。PCR鑒定時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照為用質(zhì)粒pK7作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；陰性對(duì)照為用ddH2O作模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 不同擬南芥株系PeSOS1表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real Time PCR)分析 取在人工營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)4周并用0和100 mmol/L NaCl處理3 d的野生型(WT)、轉(zhuǎn)空載體(VC)和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥，提取RNA (RNA提取方法同1.2.1)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法同1.2.1)，用熒光定量PCR儀(美國(guó) Bio-Rad MJ Opticon 2)進(jìn)行Real time PCR，檢測(cè)鹽處理對(duì)不同株系PeSOS1基因表達(dá)量的影響。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：2.5 μL 10×buffer，17 μL ddH2O，1 μL dNTP mix (10 mmol/L)，引物(S-P3f (5′-GTGAACAGAACGGTGTAGGG-3′)、S-P3r (5′-CGAGTCTCATTTGTGCCTGT-3′)或內(nèi)參基因Actin的Actin-f (5′-AT-TACCCGATGGGCAAGTCA-3′)、Actin-r (5′-TG-CTCATACGGTCAGCGATAC-3′))各1 μL，DNA Evagreen Green Ⅰ MIX 1 μL，1 μL cDNA模板，0.5 μL rTaqDNA polymerase (10 U/μL)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃反應(yīng)后延伸10 min。以Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算PeSOS1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性分析 1)鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥萌發(fā)率的影響。取野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系擬南芥的T3代純合子種子，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉和體積分?jǐn)?shù)75%乙醇無(wú)菌消毒處理，再用無(wú)菌水洗3次，然后播種在鹽濃度分別為0，100和150 mmol/L的1/2 MS培養(yǎng)基上，每天觀察并記錄其萌發(fā)率，至第5 天結(jié)束。

2)鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥根長(zhǎng)的影響。擬南芥種子萌發(fā)3 d后(種子無(wú)菌處理方法同上)，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，為了保證試驗(yàn)處理?xiàng)l件的一致性，需要將種子播在同一培養(yǎng)皿的同一水平線上，且培養(yǎng)皿要垂直放，每1～2 d觀察1次，拍照并測(cè)量其根長(zhǎng)，至第12天結(jié)束。

1.2.7 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)的變化 1)鹽脅迫對(duì)擬南芥干質(zhì)量及K+、Na+、Ca2+含量的影響。野生型與轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥種子萌發(fā)5 d后，轉(zhuǎn)移至含0,50 和 100 mmol/L NaCl的直徑9 cm花盆中，花盆中營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的體積比為1∶1(用PNS營(yíng)養(yǎng)液泡過(guò)夜后使用)，每盆4～6株，每個(gè)株系種6盆，覆膜后避光培養(yǎng)2 d后見(jiàn)光，光照3 d后揭膜，培養(yǎng)3周后取地上部分稱取鮮質(zhì)量，殺青后烘干，稱干質(zhì)量，樣品粉碎后消煮，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定K+、Na+、Ca2+含量，材料培養(yǎng)與處理等參見(jiàn)Wang等[6]的方法。

2)鹽脅迫對(duì)擬南芥根尖離子流的影響。野生型與轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥種子萌發(fā)后，均轉(zhuǎn)移至含0和100 mmol/L NaCl的 1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1或7 d，以0 mmol/L NaCl處理作為對(duì)照(CK)，測(cè)定K+、Na+、H+流的變化，具體步驟見(jiàn)Wang等[6]和Sun等[7]的方法。因在0 mmol/L NaCl處理培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1與7 d時(shí)根尖離子流的變化趨勢(shì)一致，因此對(duì)照僅列1 d時(shí)的結(jié)果。

3)SOS1抑制劑阿米洛利(Amiloride)對(duì)鹽脅迫下擬南芥根尖離子流的影響。野生型與轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥種子萌發(fā)7 d后，轉(zhuǎn)移至含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d左右，測(cè)定K+、Na+、H+流的變化。在含0和100 mmol/L NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基中，加入100 μmol/L Amiloride處理NaCl脅迫前后擬南芥2 h，再用含100 μmol/L Amiloride的測(cè)試液泡30 min，然后測(cè)定其K+、Na+、H+流的變化。

1.2.8 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥根中H2O2的產(chǎn)生及抗氧化酶活性的變化 1)產(chǎn)生H2O2的測(cè)定。在1/2 MS培養(yǎng)基上播種無(wú)菌處理的擬南芥種子，培養(yǎng)擬南芥無(wú)菌組培苗，生長(zhǎng)1周時(shí)，分別移到含有0 (CK)和100 mmol/L NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基上(配制培養(yǎng)基時(shí)加入相應(yīng)濃度的NaCl)分別培養(yǎng)10 min，24 h和7 d，利用含50 μmol/L H2O2的探針H2DCFDA避光孵育處理5 min，用1/2 MS液體培養(yǎng)基洗去探針，熒光顯微鏡(Leica DMI4000 B)下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度并采集圖像，用圖像處理軟件Image Pro-Plus，在根尖上取6～8個(gè)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得到平均熒光強(qiáng)度，以其表示H2O2水平。每個(gè)處理取5個(gè)樣本作重復(fù)，以降低個(gè)體差異帶來(lái)的誤差。

2)抗氧化酶活性的測(cè)定。將野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥種子直接播種在用液體1/2 MS培養(yǎng)基浸泡過(guò)夜的培養(yǎng)土中，用保鮮膜覆蓋保濕，2 d后照光，3 d后揭膜，每周澆1次1/2 MS液體培養(yǎng)基和2次水，生長(zhǎng)4周后，用100 mmol/L NaCl處理3 d后采樣，將樣品立即置于液氮中保存。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(Nitro Blue Tetrazolium chloride,NBT)比色法，參考Giannopolitis 等[8]和Wang等[9]的方法進(jìn)行。谷胱甘肽還原酶(GR)活性根據(jù)NADPH的氧化反應(yīng)來(lái)測(cè)定，具體參考Giannopolitis等[8]和Schaedle[10]的方法進(jìn)行。過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸氧化酶(APX)活性測(cè)定參考Wang等[6,8]的方法進(jìn)行。

1.2.9 H2O2對(duì)鹽誘導(dǎo)擬南芥根尖離子流的調(diào)控 用DPI (NADPH氧化酶的抑制劑)處理擬南芥，測(cè)定根尖K+、H+、Na+流的變化情況，研究H2O2對(duì)鹽誘導(dǎo)根尖離子流的調(diào)控作用。

取生長(zhǎng)1周的擬南芥組培苗，其中野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥均設(shè)4個(gè)處理：第Ⅰ組為陰性對(duì)照，在測(cè)試液(含0.1 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L KCl和25 g/L蔗糖，用HCl和KOH調(diào)節(jié)pH至5.5)中適應(yīng)0.5 h后，直接測(cè)定K+、Na+、H+流；第Ⅱ組為陽(yáng)性對(duì)照，在含100 μmol/L DPI的1/2 MS液體培養(yǎng)基中處理2 h后，再在測(cè)試液中適應(yīng)0.5 h，測(cè)定K+、Na+、H+流；第Ⅲ組：在含100 mmol/L NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基中處理2 h后，再在測(cè)試液中適應(yīng) 0.5 h，然后測(cè)定K+、Na+、H+流；第Ⅳ組：在含100 mmol/L NaCl和100 μmol/L DPI的1/2 MS液體培養(yǎng)基中處理2 h后，在測(cè)試液中適應(yīng)0.5 h，測(cè)定K+、Na+、H+流。以上4個(gè)處理分別簡(jiǎn)稱為CK、DPI、NaCl和NaCl+DPI。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡楊RNA提取與cDNA一鏈的合成

由圖1可見(jiàn)，提取的胡楊RNA條帶清晰，且28S條帶的亮度約為18S的2倍，基本無(wú)蛋白、鹽離子和DNA等雜質(zhì)污染， OD260/OD280約為2.0，OD260/OD230約為2.0，說(shuō)明RNA質(zhì)量和完整度好，純度高。cDNA 一鏈經(jīng)電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，條帶呈彌散狀，分子質(zhì)量在1～2 kb(圖2)，說(shuō)明cDNA質(zhì)量很好，完全能滿足下一步試驗(yàn)需要。

2.2 胡楊PeSOS1的克隆

PeSOS1的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3顯示，克隆條帶單一清晰，無(wú)非特異性條帶，大小為3 000～4 000 bp，符合預(yù)期長(zhǎng)度。經(jīng)測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn),拼接序列與Wu等[1]克隆的PeSOS1(GenBank登錄號(hào):DQ517530.1)的大小及序列完全一致。

圖2 胡楊cDNA一鏈的電泳結(jié)果
1．DNA Marker DL2000；2.cDNA一鏈產(chǎn)物；3.DNA Marker DL10000
Fig.2 Gel electrophoresis ofPopuluseuphraticacDNA
1.DNA Marker DL2000;2.cDNA;3.DNA Marker DL10000

圖3 胡楊PeSOS1的PCR擴(kuò)增結(jié)果1～3.PeSOS1的擴(kuò)增產(chǎn)物；4.DNA Marker DL10000；5.陰性對(duì)照
Fig.3 PCR amplification ofPopuluseuphraticaPeSOS1 gene1-3.PCR product ofPeSOS1;4.DNA Marker DL10000;5.Negative control

2.3 轉(zhuǎn)PeSOS1載體的構(gòu)建

圖4-A顯示，構(gòu)建的中間載體pENTR/D-TOPO-PeSOS1的大小為3 000 bp。對(duì)構(gòu)建的中間載體pENTR/D-TOPO-PeSOS1進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果(圖4-B)顯示，該載體構(gòu)建成功。

由圖5可知，表達(dá)載體pK7-PeSOS1的PCR產(chǎn)物大小為3 000 bp左右，符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物(PeSOS1的全長(zhǎng))大小。

2.4 擬南芥的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化擬南芥后，順利獲得了7個(gè)陽(yáng)性株系，標(biāo)記為S1～S7，從中選取PeSOS1表達(dá)量高的3個(gè)株系(S1、S2和S5)進(jìn)行純合子篩選及耐鹽性試驗(yàn)。轉(zhuǎn)PeSOS1擬南芥陽(yáng)性植株的基因組DNA見(jiàn)圖6。

圖6 轉(zhuǎn)PeSOS1擬南芥陽(yáng)性植株的基因組DNA
1.DNA Marker DL15000；2～6.不同轉(zhuǎn)基因株系
Fig.6 Gel electrophoresis of genetic DNA of transgenicArabidopsislines
1.DNA Marker DL15000;2-6.Different transgenic lines

由圖6可知，擬南芥T1代陽(yáng)性株系的DNA提取結(jié)果完好，條帶單一，既沒(méi)有降解，也沒(méi)有RNA的污染，完全可以用作模板進(jìn)行定性鑒定。圖7顯示，從擬南芥T1代陽(yáng)性株系中全部成功鑒定出了目的條帶，且條帶大小與用質(zhì)粒pK7作模板的陽(yáng)性對(duì)照一致，野生型擬南芥和陰性對(duì)照中均沒(méi)有此條帶，說(shuō)明卡那霉素篩選結(jié)果可靠，轉(zhuǎn)基因株系鑒定成功。

2.5 不同株系擬南芥PeSOS1表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的RNA及PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8-A可知，野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的RNA提取較為成功，沒(méi)有降解及基因組DNA的污染，條帶28S的亮度約為18S的2倍，說(shuō)明RNA質(zhì)量較高，其OD280/OD260、OD280/OD230值均為1.8～2.0，說(shuō)明樣品RNA的質(zhì)量完全滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。圖8-B顯示，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥擴(kuò)增條帶單一，亮度良好，沒(méi)有非特異性條帶及引物二聚體的污染。目的模板擴(kuò)增片段清晰可見(jiàn)，陰性對(duì)照(VC)沒(méi)有目的條帶的痕跡，可以滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR的要求。

通過(guò)檢測(cè)不同株系擬南芥PeSOS1的表達(dá)量(圖9)發(fā)現(xiàn)，在野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體pK7植株中均未檢測(cè)到PeSOS1基因，而轉(zhuǎn)基因擬南芥中均檢測(cè)到PeSOS1。當(dāng)用0 mmol/L NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中PeSOS1表達(dá)量均不高，而用100 mmol/L NaCl處理后轉(zhuǎn)基因株系PeSOS1表達(dá)量顯著提高。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性

NaCl脅迫對(duì)野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥萌發(fā)率的影響見(jiàn)圖10。圖10表明，在無(wú)鹽(0 mmol/L NaCl)培養(yǎng)基上，野生型(WT)和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥(S1、S2、S5)的萌發(fā)率較高，均在95%左右；當(dāng)用100 mmol/L NaCl處理后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的萌發(fā)率基本沒(méi)有明顯變化，為70%～90%，而野生型擬南芥萌發(fā)率卻降到了30%左右；在用150 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥的萌發(fā)率降到了約10%，而轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥株系中的萌發(fā)率顯著高于野生型擬南芥。說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因后植株的耐鹽性顯著提高。

觀察發(fā)現(xiàn)，處理7 d后，在無(wú)鹽(0 mmol/L NaCl)培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥株系的根長(zhǎng)沒(méi)有差異(圖11)，同時(shí)植株在葉片和根形態(tài)上也沒(méi)有差異；利用100 mmol/L NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)生長(zhǎng)優(yōu)于野生型(圖11)，且轉(zhuǎn)基因株系葉片較大、綠色較深，根比較粗壯，說(shuō)明鹽脅迫并沒(méi)有明顯抑制轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系根長(zhǎng)的生長(zhǎng)，卻抑制了野生型擬南芥根長(zhǎng)的生長(zhǎng)。

監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期(6～12 d)鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的根長(zhǎng)生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖12。由圖12可知，在無(wú)鹽(0 mmol/L NaCl)培養(yǎng)基上，野生型與轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系擬南芥的根長(zhǎng)在脅迫6～10 d時(shí)差異不顯著，但在12 d時(shí)差異顯著。用100 mmol/L NaCl處理后，其抑制了擬南芥的根長(zhǎng)生長(zhǎng)，且對(duì)野生型擬南芥的抑制作用更為明顯，轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系擬南芥的根長(zhǎng)生長(zhǎng)顯著優(yōu)于野生型，

說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥生長(zhǎng)受鹽脅迫的影響較小。

2.7 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)的變化

2.7.1 鹽脅迫對(duì)干質(zhì)量及K+、Na+、Ca2+含量的影響 圖13顯示，當(dāng)NaCl濃度為0 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥的干質(zhì)量差異不顯著。用50～100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥的干質(zhì)量顯著下降，且隨著NaCl濃度的增加，下降幅度更明顯；轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥干質(zhì)量亦有所下降，但下降幅度低于野生型擬南芥，說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的生物量受鹽脅迫的影響明顯小于野生型擬南芥。

圖14顯示，NaCl處理前野生型與轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的K+含量沒(méi)有顯著差異，100 mmol/L NaCl處理后野生型植株的K+含量下降了約50%，而轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系K+含量雖然也有所下降，但下降幅度較小，為NaCl處理前的80%～90%，說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下能更好地抑制K+的流失。100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥比轉(zhuǎn)基因株系積累了更多的Na+，約為處理前的2倍；轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系Na+含量也有所增加，但其增加幅度較小，約為NaCl處理前的10%。NaCl處理前后轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥Ca2+含量變化趨勢(shì)與K+相似，即NaCl處理前，野生型與轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥Ca2+含量無(wú)顯著差異；100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥Ca2+含量顯著下降，而轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥Ca2+含量基本上維持了原有的水平，與NaCl處理前差異不顯著。說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下?tīng)I(yíng)養(yǎng)元素的流失減少。100 mmol/L NaCl處理后，野生型擬南芥的K+/Na+明顯下降，其K+/Na+失去平衡，對(duì)植株的生長(zhǎng)造成較大影響，而轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥能有效減少K+和Ca2+的流失，因此受鹽脅迫的傷害較輕?？芍?00 mmol/L NaCl處理后轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥對(duì)K+/Na+平衡的維持能力比野生型擬南芥強(qiáng)。

2.7.2 鹽脅迫對(duì)根尖離子流的影響 圖15顯示，在非鹽脅迫下(用0 mmol/L NaCl處理1 d，CK，下同)，野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥K+流沒(méi)有顯著差異；100 mmol/L NaCl處理后野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系K+內(nèi)流均有所減少，短期(1 d)鹽處理后轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的K+內(nèi)流顯著大于野生型；在長(zhǎng)期(7 d)鹽脅迫下，野生型擬南芥還出現(xiàn)了K+外流的情況，而轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥沒(méi)有出現(xiàn)K+外流的情況，說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下仍能保持對(duì)K+的吸收，而野生型擬南芥在長(zhǎng)期鹽脅迫下則出現(xiàn)了K+外流。

由圖15還可見(jiàn)，在非鹽脅迫下，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥Na+外流高于野生型，但差異不顯著。100 mmol/L NaCl處理1 d后，不同株系擬南芥Na+外流均增加，但是轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥Na+的外流顯著高于野生型；處理7 d后，不同株系擬南芥Na+外流進(jìn)一步增加，但轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的Na+外流仍顯著高于野生型擬南芥。

由圖15可以看出，在非鹽脅迫下，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥H+外流與野生型差異不顯著，但用100 mmol/L NaCl處理后，無(wú)論是短期(1 d)還是長(zhǎng)期(7 d)鹽脅迫，均能導(dǎo)致擬南芥出現(xiàn)H+內(nèi)流，且野生型擬南芥的H+內(nèi)流顯著小于轉(zhuǎn)基因株系，說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥能及時(shí)對(duì)鹽處理作出響應(yīng)，激活SOS1蛋白，外排Na+的同時(shí)將H+轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，使得H+呈內(nèi)流的趨勢(shì)。

2.7.3 抑制劑Amiloride對(duì)NaCl脅迫下根尖離子流的影響 圖16顯示，抑制劑Amiloride處理與否，對(duì)照組(CK)中不同株系擬南芥的K+內(nèi)流差異不顯著；但在100 mmol/L NaCl脅迫組中，添加Amiloride后，其明顯抑制了轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系的K+內(nèi)流，轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系K+內(nèi)流與野生型擬南芥沒(méi)有顯著差異。這說(shuō)明鹽脅迫下轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥的K+流與SOS1活性的關(guān)系密切。

圖16表明，添加Amiloride與否，對(duì)照組(CK)中轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的Na+外流與野生型擬南芥無(wú)顯著差異。用NaCl處理后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥的Na+外流高于野生型擬南芥，且差異顯著；用NaCl+Amiloride處理后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥和野生型擬南芥Na+外流均大幅減小，且轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明抑制劑Amiloride處理后消除了PeSOS1對(duì)Na+外流的促進(jìn)作用。

由圖16還可知，添加Amiloride與否，對(duì)照組中不同株系擬南芥H+外流差異不顯著。NaCl處理后，使H+流向發(fā)生變化，由外流轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)流，這與Na+的外流相對(duì)應(yīng)，表明為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。NaCl+Amiloride處理后，不同株系的H+內(nèi)流均大幅度降低，且野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因株系間的差異消失，說(shuō)明SOS1被抑制后，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)受到明顯影響。

2.8 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥根中H2O2的產(chǎn)生和抗氧化酶活性的變化

圖17顯示，擬南芥根細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但變化趨勢(shì)有所不同。野生型擬南芥的H2O2隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，至第7天H2O2水平達(dá)到最高；而轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥根細(xì)胞中H2O2水平在24 h內(nèi)呈增加的趨勢(shì)，之后到第7天并未繼續(xù)增加，與NaCl處理24 h的水平基本一致。說(shuō)明轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥能及時(shí)抑制H2O2的過(guò)量產(chǎn)生，避免過(guò)多的活性氧帶來(lái)的氧化脅迫，而野生型擬南芥并不能抑制鹽誘導(dǎo)的H2O2過(guò)量產(chǎn)生。

圖18表明，在轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥和野生型擬南芥中，抗氧化物酶SOD和GR活性在NaCl脅迫前后的變化趨勢(shì)基本相同，即NaCl處理前轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥SOD和GR活性無(wú)顯著差異，NaCl脅迫后SOD和GR活性均增加，但是轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥SOD和GR活性增加的幅度顯著大于野生型擬南芥。野生型擬南芥的CAT和APX活性受NaCl脅迫的影響小，而轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在NaCl脅迫后CAT和APX活性均顯著提高，且APX活性平均提高幅度(100%)高于CAT(30%)。

2.9 H2O2對(duì)鹽誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖離子流的調(diào)控

圖19顯示，與CK相比，NaCl處理后擬南芥根尖的K+內(nèi)流減弱，Na+外流和H+內(nèi)流增強(qiáng)，表明Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高。與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥K+內(nèi)流減弱的幅度較小，Na+外流和H+內(nèi)流的增強(qiáng)幅度均較大，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)能力較高，且野生型與轉(zhuǎn)PeSOS1基因型擬南芥差異顯著。與CK相比，加入NADPH氧化酶抑制劑DPI后，不同株系擬南芥根尖的離子流未受影響，但卻進(jìn)一步降低了NaCl處理擬南芥根尖的K+和H+的內(nèi)流。與CK相比，NaCl和DPI共同處理后野生型和轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥Na+外流均有所增加，但是野生型擬南芥增幅較少，說(shuō)明DPI對(duì)NaCl處理后野生型擬南芥的影響比轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥大，可能是由于野生型擬南芥在NaCl處理后產(chǎn)生了較多H2O2所致；說(shuō)明添加DPI抑制了H2O2的產(chǎn)生后，影響了離子的平衡，降低了轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥Na+外流與野生型擬南芥的差異，即減小了轉(zhuǎn)PeSOS1基因造成的差異。與NaCl處理相比，NaCl和DPI共同處理后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥和野生型擬南芥H+內(nèi)流均減小，而野生型擬南芥減少幅度較轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥小。可知NaCl與DPI共同處理后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥與野生型擬南芥根尖離子流之間的差異比NaCl單獨(dú)處理造成的差異有所降低。以上結(jié)果表明，H2O2調(diào)節(jié)了SOS1的活性，參與鹽誘導(dǎo)離子流的調(diào)控。

3 討 論

SOS1在提高植物抗鹽性中有著非常重要的作用。質(zhì)膜SOS1外排Na+的作用降低了植物因鹽處理導(dǎo)致的體內(nèi)Na+積累，因此減少了Na+積累帶來(lái)的離子滲透和氧化脅迫作用[11-12]，進(jìn)而保證了K+、Ca2+等重要離子所占的比例，維持了K+/Na+平衡[12-14]，這為植物細(xì)胞內(nèi)的正常代謝等生命活動(dòng)提供了必要條件。SOS1在作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的同時(shí)還兼顧了信號(hào)信使的重要使命[15-18]。鹽脅迫產(chǎn)生的H2O2也起著信號(hào)信使的作用[2,19]。NaCl處理植物后，SOS1和H2O2信號(hào)系統(tǒng)共同作用，調(diào)控著植物體對(duì)NaCl脅迫的適應(yīng)性[8,20]。對(duì)胡楊根組織分離原生質(zhì)體的研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽性的胡楊在鹽處理后維持了K+/Na+平衡，且在此過(guò)程中，SOS1保持著對(duì)Na+的外排活性[20]。與對(duì)鹽敏感的楊樹(shù)相比，胡楊的葉片組織在鹽處理或正常生長(zhǎng)狀態(tài)下均可保持較高的SOS1轉(zhuǎn)錄水平[2]。本研究克隆并表達(dá)了PeSOS1，發(fā)現(xiàn)PeSOS1可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性和K+/Na+平衡。

前人在多種植物中均發(fā)現(xiàn)，鹽和H2O2均對(duì)SOS1 mRNA的穩(wěn)定性起著重要作用[3,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，短期(10 min～24 h)NaCl脅迫下轉(zhuǎn)PeSOS1基因的擬南芥根細(xì)胞中 H2O2水平顯著高于野生型擬南芥，而且H2O2在多種類型細(xì)胞中均對(duì)刺激生長(zhǎng)起到重要作用[6,21-24]，這可能是轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在鹽脅迫下根系快速生長(zhǎng)的原因。

Amiloride和DPI分別是SOS1和質(zhì)膜NADPH氧化酶的抑制劑，在轉(zhuǎn)基因植株中Na+外流和K+內(nèi)流受Amiloride和DPI的影響。說(shuō)明擬南芥可能通過(guò)H2O2來(lái)調(diào)控SOS1，以達(dá)到維持胞內(nèi)K+/Na+平衡的作用[25]。很多研究已經(jīng)證明，H2O2對(duì)SOS1的活性有調(diào)節(jié)作用[3,25]。Sun等[26]研究表明，在胡楊細(xì)胞中，NaCl誘導(dǎo)產(chǎn)生的H+內(nèi)流有助于產(chǎn)生過(guò)量的H2O2[26]。因此可以推測(cè)，由于H+內(nèi)流的加強(qiáng)，導(dǎo)致質(zhì)外體瞬時(shí)堿化，可激活質(zhì)膜NADPH氧化酶并導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥根細(xì)胞中H2O2的積累[27]。這可能是因?yàn)镹aCl處理后PeSOS1表達(dá)上調(diào)，使植物在外排Na+的同時(shí)將大量H+轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，這有助于激活質(zhì)膜NADPH氧化酶，從而調(diào)節(jié)H2O2的產(chǎn)生。

在本研究中，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在NaCl處理下快速產(chǎn)生H2O2，且脅迫早期(10 min～24 h)H2O2的爆發(fā)可引起抗氧化防御[20,28]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥在有或無(wú)NaCl處理的條件下均可保持較高的抗氧化酶活性，這使得H2O2水平得到了控制。研究表明，鹽脅迫下胡楊能調(diào)控活性氧平衡主要通過(guò)2條途徑：一是控制胞內(nèi)離子平衡來(lái)減少長(zhǎng)期鹽脅迫下誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生，二是迅速上調(diào)氧化防御機(jī)制來(lái)阻止活性氧的損傷[20,29]。胡楊在鹽脅迫前后其PeSOS1均有較高的表達(dá)量[2]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl脅迫后，轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥中H2O2迅速產(chǎn)生，從而有助于通過(guò)調(diào)控Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活性以維持K+/Na+平衡；此外，H2O2還能上調(diào)氧化防御機(jī)制從而防止長(zhǎng)期NaCl脅迫下的氧化損傷發(fā)生。另外，鹽誘導(dǎo)H2O2提高胞內(nèi)Ca2+濃度，胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通過(guò)SOS信號(hào)通路激活SOS1[30]。在擬南芥中，H2O2對(duì)維持SOS1 mRNA的穩(wěn)定性還有重要作用[3]。因此可以推斷，在擬南芥和胡楊中SOS1的高量表達(dá)促進(jìn)了鹽脅迫下H2O2的產(chǎn)生，H2O2信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步調(diào)控胞內(nèi)的離子平衡。

綜上所述，在擬南芥中異源表達(dá)PeSOS1后，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性提高，其機(jī)制為通過(guò)上調(diào)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性及外排Na+維持了K+/Na+平衡；同時(shí)轉(zhuǎn)PeSOS1基因擬南芥通過(guò)促進(jìn)H2O2的產(chǎn)生，又進(jìn)一步維持了SOS1 mRNA的穩(wěn)定性，使之在長(zhǎng)期鹽脅迫中保持活性，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)起著重要的作用。

[1] Wu Y,Ding N,Zhao X,et al.Molecular characterization ofPeSOS1:The putative Na(+)/H(+) antiporter ofPopuluseuphratica[J].Plant Mol Biol,2007,65(1/2):1-11.

[2] Ding M,Hou P,Shen X,et al.Salt-induced expression of genes related to Na(+)/K(+) and ROS homeostasis in leaves of salt-resistant and salt-sensitive poplar species [J].Plant Mol Biol,2010,73(3):251-269.

[3] Chung J S,Zhu J K,Bressan R A,et al.Reactive oxygen species mediate Na+-induced SOS1 mRNA stability inArabidopsis[J].Plant J,2008,53(3):554-565.

[4] Shi H,Lee B H,Wu S J,et al.Overexpression of a plasma me-mbrane Na+/H+antiporter gene improves salt tolerance inArabidopsisthaliana[J].Nat Biotechnol,2003,21(1):81-85.

[5] Clough S J,Bent A F.Floral dip:A simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana[J].Plant J,1998,16(6):735-743.

[6] Wang M,Wang Y,Sun J,et al.Overexpression of PeHA1 enhances hydrogen peroxide signaling in salt-stressedArabidopsis[J].Plant Physiol Biochem,2013,71C:37-48.

[7] Sun J,Dai S,Wang R,et al.Calcium mediates root K+/Na+homeostasis in poplar species differing in salt tolerance [J].Tree Physiol,2009,29(9):1175-1186.

[8] Wang R,Chen S,Zhou X,et al.Ionic homeostasis and reactive oxygen species control in leaves and xylem sap of two poplars subjected to NaCl stress [J].Tree Physiol,2008,28(6):947-957.

[9] Giannopolitis C N,Ries S K.Superoxide dismutases:Ⅰ.Occurrence in higher plants [J].Plant Physiol,1977,59(2):309-314.

[10] Schaedle M.Chloroplast glutathione reductase [J].Plant Physiol,1977,59(5):1011-1012.

[11] Yadav N S,Shukla P S,Jha A,et al.TheSbSOS1 gene from the extreme halophyteSalicorniabrachiataenhances Na+loading in xylem and confers salt tolerance in transgenic tobacco [J].BMC Plant Biol,2012,12(1):188.

[12] Garciadeblas B,Haro R,Benito B.Cloning of two SOS1 transporters from the seagrassCymodoceanodosa.SOS1 transporters fromCymodoceaandArabidopsismediate potassium uptake in bacteria [J].Plant Mol Biol,2007,63(4):479-490.

[13] Rus A,Lee B H,Munoz-Mayor A,et al.AtHKT1 facilitates Na+homeostasis and K+nutrition in planta [J].Plant Physiol,2004,136(1):2500-2511.

[14] Pardo J M,Cubero B,Leidi E O,et al.Alkali cation exchangers:Roles in cellular homeostasis and stress tolerance [J].J Exp Bot,2006,57(5):1181-1199.

[15] Martinez-Atienza J,Jiang X,Garciadeblas B,et al.Conservation of the salt overly sensitive pathway in rice [J].Plant Physiol,2007,143(2):1001-1012.

[16] Huang G T,Ma S L,Bai L P,et al.Signal transduction during cold,salt,and drought stresses in plants [J].Mol Biol Rep,2012,39(2):969-987.

[17] Quintero F J,Ohta M,Shi H,et al.Reconstitution in yeast of theArabidopsisSOS signaling pathway for Na+homeostasis [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002, 99(13):9061-9066.

[18] Tang R J,Liu H,Bao Y,et al.The woody plant poplar has a functionally conserved salt overly sensitive pathway in response to salinity stress [J].Plant Mol Biol,2010,74(4/5):367-380.

[19] Zhang F,Wang Y,Yang Y,et al.Involvement of hydrogen peroxide and nitric oxide in salt resistance in the calluses fromPopuluseuphratica[J].Plant Cell Environ,2007,30(7):775-785.

[20] Sun J,Wang M J,Ding M Q,et al.H2O2and cytosolic Ca2+signals triggered by the PM H-coupled transport system mediate K+/Na+homeostasis in NaCl-stressedPopuluseuphraticacells [J].Plant Cell Environ,2010,33(6):943-958.

[21] Jhumka Z,Pervaiz S,Clement M V.Resveratrol regulates the expression of NHE-1 by repressing its promoter activity:Critical involvement of intracellular H2O2and caspases 3 and 6 in the absence of cell death [J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(4):945-956.

[22] Bassil E,Tajima H,Liang Y C,et al.TheArabidopsisNa+/H+antiporters NHX1 and NHX2 control vacuolar pH and K+homeostasis to regulate growth,flower development,and reproduction [J].Plant Cell,2011,23(9):3482-3497.

[23] Potocky M,Jones M A,Bezvoda R,et al.Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase are involved in pollen tube growth [J].New Phytol,2007,174(4):742-751.

[24] Carol R J,Dolan L.The role of reactive oxygen species in cell growth:Lessons from root hairs [J].J Exp Bot,2006,57(8):1829-1834.

[25] Ma L,Zhang H,Sun L,et al.NADPH oxidase AtrbohD and AtrbohF function in ROS-dependent regulation of Na(+)/K(+) homeostasis inArabidopsisunder salt stress [J].J Exp Bot,2012,63(1):305-317.

[26] Sun J A,Li L S,Liu M Q,et al.Hydrogen peroxide and nitric oxide mediate K(+)/Na(+) homeostasis and antioxidant defense in NaCl-stressed callus cells of two contrasting poplars [J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2010,103(2):205-215.

[27] Oh D H,Lee S Y,Bressan R A,et al.Intracellular consequences of SOS1 deficiency during salt stress [J].J Exp Bot,2010,61(4):1205-1213.

[28] Banakou E,Dailianis S.Involvement of Na+/H+exchanger and respiratory burst enzymes NADPH oxidase and NO synthase,in Cd-induced lipid peroxidation and DNA damage in haemocytes of mussels [J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol,2010,152(3):346-352.

[29] Wang R G,Chen S L,Deng L,et al.Leaf photosynthesis,fluorescence response to salinity and the relevance to chloroplast salt compartmentation and anti-oxidative stress in two poplars [J].Trees-Structure and Function,2007,21(5):581-591.

[30] Quan R,Lin H,Mendoza I,et al.SCABP8/CBL10,a putative calcium sensor,interacts with the protein kinase SOS2 to protectArabidopsisshoots from salt stress [J].Plant Cell,2007,19(4):1415-1431.

Modulation of H2O2signaling in salt-stressedArabidopsisbyPeSOS1

WANG Mei-juan1,WANG Yang1,SHEN Ze-dan1,MA Xu-jun1,SA Gang1,DENG Shu-rong1,LIU Dan-dan2,ZHANG Yu-hong1,SHEN Xin1,CHEN Shao-liang1

(1CollegeofBiologicalSciencesandTechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China;2DataoVillageofColouredGlazeRiverTown,FangshanDistrict,Beijing102403,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the role ofPeSOS1 in salt sensing and adaption through H2O2signaling.【Method】 Plasma Membrane (PM) Na+/H+antiporter genePeSOS1 ofPopuluseuphraticawas cloned and introduced toArabidopsisthaliana.Then differences in salt tolerance between wild-type andPeSOS1-transgenicArabidopsisplants were illustrated by comparing germination,root length,biomass,contents of K+,Na+and Ca2+,fluxes of root K+,Na+and H+,H2O2production,antioxidant enzyme activity and effects of inhibitor on ion fluxes of homozygous seedlings under 100 mmol/L NaCl salt stress.【Result】 Compared to wild-type,PeSOS1-transgenicArabidopsisplants had higher germination rate,root length,and biomass under NaCl stress.PeSOS1-transgenicArabidopsisplants also had higher contents of K+and Ca2+but lower content of Na+.Transgenic plants exhibited lower ratio of Na+/H+antiport compared to wild-type.In roots of transgenicArabidopsis,H2O2production was more rapidly than wild-type when plants were subjected to NaCl stress and the activities of the antioxidant enzymes were higher.Transgenic plants were unable to remain K+/Na+homeostasis when salt-induced H2O2production was inhibited by diphenylene iodonium (DPI),an inhibitor of NADPH oxidase.【Conclusion】PeSOS1 increased salt tolerance through rapid H2O2production,which maintained the stability of SOS1 mRNA,controlled K+/Na+homeostasis and triggered antioxidant defense inArabidopsis.

Populuseuphratica;salt stress;transgenicArabidopsis;PM Na+/H+antiporter (SOS1);H2O2signaling;K+/Na+homeostasis;ion flux

2013-10-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270654，31170570)；教育部科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(113013A)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(6112017)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(JC2011-2，TD-2012-04)；北京市優(yōu)秀博士學(xué)位論文指導(dǎo)教師專項(xiàng)(YB20081002201)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃項(xiàng)目(111 Project，B13007)

王美娟(1983-)，女，山東濟(jì)寧人，博士，主要從事樹(shù)木抗逆生理與分子生物學(xué)研究。E-mail：colorhail@sina.com

陳少良(1969-)，男，河北霸州人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事林木抗逆生理與分子生物學(xué)研究。 E-mail：Lschen@bjfu.edu.cn

時(shí)間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.009

S792.119;Q785

A

1671-9387(2015)02-0079-13

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.009.html