趙洪剛 綜述，張遵城 審校

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院核醫(yī)學科 300210)

·綜 述·

Klotho在腎臟損傷疾病中的作用研究進展

趙洪剛 綜述，張遵城 審校

(天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院核醫(yī)學科 300210)

Klotho;急性腎損傷;慢性腎臟病;高磷血癥;血管鈣化

雖然經(jīng)過長期的發(fā)展，目前急慢性腎臟病的腎臟替代治療有了很大的提高，挽救很多人的生命，但是對疾病進展的研究卻收效甚微。在積極對腎臟病進行一級、二級預防的同時，也不斷增加對腎臟保護性的研究。腎臟保護性因子Klotho基因最初在小鼠模型中被發(fā)現(xiàn)。因其表達增高能夠延緩衰老，延長生命，所以就用希臘神話中掌管人生命女神Klotho的名字命名。在對Klotho的研究過程中人們逐漸發(fā)現(xiàn)，其在調(diào)整機體磷代謝中也起到重要作用。特別是近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，血磷和病死率之間存在密切的關(guān)系，鈣磷失衡導致的血管鈣化是心血管疾病獨立的強危險因素[1]，甚至認為磷在循環(huán)過程中可能對機體起到毒性作用。而Klotho的作用也逐漸得到人們的重視。近年發(fā)現(xiàn)，Klotho不僅能作為腎損傷的標志物，減緩腎臟損傷促進修復，而且可能在軟組織鈣化中起到保護性作用。目前的研究更傾向于認為，膜外的磷對細胞有毒性作用，而尿磷的排泄減少可能會導致機體的早熟和衰老[2]。本文將對其在磷代謝、減緩腎損傷和減少軟組織鈣化中的作用進行綜述。

1 成纖維細胞生長因子-23(fibroblast growth factor-23，F(xiàn)GF-23)和Klotho在機體磷代謝中的作用

高血磷現(xiàn)象普遍存在于慢性腎臟病終末期，由其所帶來的并發(fā)癥嚴重影響患者的生活質(zhì)量。對于高血磷一種可能的解釋為矯枉過正(trade-off theory)理論，即隨著腎功能的下降，導致磷潴留，最終導致低鈣血癥和甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)增高。FGF-23在磷代謝中起到重要作用，并可以作用于1-α羥化酶，影響血鈣的代謝。在慢性腎臟病進展的過程中，血磷的調(diào)節(jié)不僅依靠FGF-23，還需要Klotho的參與，二者不可或缺。故在鈣磷代謝研究中常把二者結(jié)合起來。

FGF-23來自成纖維細胞生長因子(FGFs)家族。FGFs家族由包括120個高保守氨基酸殘基和多變的N末端和C末端殘基組成。通過分析得知，人類的FGFs有7個亞家族。其中的FGF-23主要調(diào)節(jié)血磷和1，25(OH)2VitD3在體內(nèi)的平衡。

FGF-23主要由成骨細胞和骨細胞合成。共有251個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26×103。FGF-23包括氨基末端信號肽(1～24殘基)、FGF-23樣序列(25～180殘基)及其他FGF亞家族成員不同的羧基末端延長序列(181～251殘基)。在FGF-23分子的氨基末端具有FGF受體結(jié)合位點，羧基末端具有Klotho蛋白的結(jié)合位點，這是FGF-23行使其功能的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。健康人循環(huán)中FGF-23半衰期為58 min。有研究發(fā)現(xiàn)[3]FGF-23 的增加是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)預后不良的表現(xiàn)。ArMORR研究提示[4]，F(xiàn)GF-23水平升高是維持性血液透析患者一年生存時間的獨立危險因素。較血磷而言是更強有力的病死率預測因子。

Klotho在人體中有兩種存在形式：膜型和游離型。膜型主要表達于近端腎小管上皮細胞，為激素受體，主要功能為調(diào)節(jié)磷排泄和合成活性維生素D。游離型Klotho作為體液因子，在機體中起到多樣化作用，如抑制生長因子信號、減緩氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)離子通道和載體等。1997年由Kuro等[5]發(fā)現(xiàn)。其為130×103的跨膜β葡萄糖醛羧酶，能水解類固醇β葡萄糖醛酸。有研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除Klotho的大鼠，表現(xiàn)為老化加速和動脈粥樣硬化[1]?，F(xiàn)在已經(jīng)證實，Klotho和FGF-R復合體較Klotho和FGF-23-R，對FGF-23具有更高的親和力。也就是說，F(xiàn)GF-23通過依賴Klotho的FGF受體結(jié)合發(fā)揮生物學效應(yīng)。研究證實，F(xiàn)GF-R分布廣泛，但是膜性Klotho僅表達于腎小管上皮細胞、甲狀旁腺和脈絡(luò)叢等處，這種分布特點決定了FGF-23的作用具有組織選擇性。而游離型Klotho則可以在不依賴FGF-23的情況下在機體中發(fā)揮多樣化的作用。游離型Klotho可以通過腎小管遠端內(nèi)皮細胞TRPV5的表達而限制鈣離子的重吸收。其可能在磷的代謝中起到一定的作用。

FGF-23能促進尿磷排泄。其作用機制為：腎臟主要通過近端腎小管細胞刷狀緣上的鈉-磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白Ⅱ(Na-PiⅡ)調(diào)節(jié)尿磷的重吸收。其中起作用的主要是鈉-磷協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白Ⅱa(Na-PiⅡa)，另有近1/3的尿磷的重吸收是通過鈉磷協(xié)同蛋白Ⅱc(Na-PiⅡc)。FGF-23通過調(diào)節(jié)近端腎小管Na-PiⅡa(也可能示Na-PiⅡc)的表達下降，實現(xiàn)對尿磷的調(diào)節(jié)。過度表達FGF-23的大鼠腎臟Na-Pi協(xié)同蛋白表達下降，尿磷排泄增加，而FGF-23失活小鼠則表現(xiàn)為高磷血癥。此外，F(xiàn)GF-23還可通過VitD依賴途徑，降低小腸Na-PiⅡb的活性，減少胃腸道對磷的重吸收[6]。

增加或限制磷的攝入、口服磷結(jié)合劑均可影響血清FGF-23的水平。研究發(fā)現(xiàn)FGF-23可抑制1-α羥化酶，使1,25(OH)2VitD3生成減少、分解加速，此種情況說明，其對維持血磷的長期穩(wěn)定可能發(fā)揮重要作用。而血PTH對血磷的反應(yīng)較為迅速，可能主要負責短期血磷的調(diào)節(jié)。

CKD患者隨著腎臟清除率的下降，F(xiàn)GF-23水平逐漸增加。但是研究發(fā)現(xiàn)合成明顯增加才是FGF-23血清水平升高的主要原因。這可能是患者腎單位減少導致磷排泄不足的生理性代償機制。FGF-23的增高可增加尿磷的排泄，并可通過抑制1-α羥化酶而間接使1,25(OH)2VitD3合成下降，減少胃腸道對磷的吸收。在腎功能不全早期，在一定的腎單位下，F(xiàn)GF-23的過度分泌可使血磷在相當長的時間里維持在正常范圍。Hsieh等[8]發(fā)現(xiàn)，CKD患者中Klotho表達下降，導致FGF-23的功能不能充分的發(fā)揮。這也是FGF-23代償性增加的因素。有人測量，在CKD5期，F(xiàn)GF-23水平可達到健康人的100倍以上[7]。

2 急慢性腎損傷中Klotho的變化規(guī)律

急性腎損傷的主要病因為中毒和缺血缺氧。在對急慢性腎損傷的研究中[9]，逐漸發(fā)現(xiàn)在急慢性腎損傷時Klotho水平下降。其可能與單核細胞趨化因子-1在急慢性腎損傷中起緩和和保護性作用有關(guān)。Klotho具有細胞保護作用，主要表現(xiàn)在能夠抵御氧化應(yīng)激和缺血再灌注損傷。血清Klotho水平是預測殘余腎功能和腎臟清除磷能力的指標[10]。衰老、腎臟病、氧化應(yīng)激之間具有相似性且關(guān)系密切[11-12]。

氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷和血壓升高能夠?qū)е录毙阅I損傷(acute kidney injury,AKI)。國外有研究觀察到，Klotho蛋白水平在腎臟和腎臟細胞株中的表達減少。在慢性腎臟病和相關(guān)的動物模型中，均檢測到Klotho水平減低[13]。腎臟為膜型Klotho的主要表達器官，因此在腎臟受到嚴重損傷時，Klotho表達減低。但是至今尚沒有在急慢性腎損傷的相關(guān)數(shù)據(jù)。最近國外有報道[14]，提示在嚙齒類動物AKI時血液、腎臟和尿液中，Klotho蛋白均有急劇的下降，而且在腎臟修復后能夠完全恢復。這種現(xiàn)象提示AKI時，Klotho處于低水平狀態(tài)。AKI時Klotho急劇減少的機制尚不清楚。研究結(jié)果顯示，在Klotho急劇減少時，Klotho mRNA減少的幅度并不大，而且Klotho的轉(zhuǎn)運RNA僅下降50%，而且Klotho的減少早于其他的腎損傷標志物。實驗發(fā)現(xiàn)[15]，在培養(yǎng)細胞株出現(xiàn)氧化應(yīng)激時，Klotho mRNA和Klotho蛋白均明顯減少。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和干擾素-γ(interferon-γ,INF-γ)能夠減少Klotho mRNA和Klotho蛋白[16]。但是，在AKI中，是不是TNF和INF-γ的作用降低了Klotho mRNA和Klotho蛋白尚不明確[17]。

AKI如何進展為CKD和CKD過程中如何合并AKI的機制尚不明確。目前有多種學說解釋這個慢性的不可逆的病理過程。終末期腎病的患者和試驗動物，其腎臟中的Klotho水平均是降低的，但是在他們的血液和尿液中，也存在Klotho水平的下降。重要的是，Klotho的減少在CKD的第1期和第2期就已經(jīng)出現(xiàn)，在嚙齒類動物和人類中其下降的程度與腎小球濾過率呈正相關(guān)。尿液中的Klotho含量是CKD病程變化非常敏感的指標，而且其下降與腎功能下降是平衡的。Klotho在AKI和CKD中的下降的機制有待于研究，其可能對阻斷和延緩腎臟病進展的治療起到一定作用。

3 Klotho對腎臟保護的機制

腎臟為非可再生器官，而且在CKD進展過程中，目前尚無有效的阻止腎功能繼續(xù)惡化的方法，這讓腎臟的保護顯得尤為重要。Hu和他的團隊完成了含有不同濃度Klotho 的AKI和CKD的小鼠模型的建立[18]。低水平組為雜合子，Kl+/-；對照組為正常表達；高水平組為轉(zhuǎn)基因制備高表達Klotho和Tg-Kl。在AKI模型中，低表達組Kl+/-小鼠，血清中的Klotho為低表達，尿和腎臟中的為常規(guī)水平。此組最終導致了嚴重的腎臟病。相反在高表達組，由于血清、腎臟和尿中的Klotho水平相對于其他兩組高，故對缺血再灌注損傷有較強的抵抗力。這些現(xiàn)象表明，Klotho減少加重了AKI的損傷，而其高表達則減弱了AKI的損傷。HU和他的團隊[14]在腎損傷30～60 min后，將重組的Klotho蛋白注入腎損傷的動物體內(nèi)，結(jié)果觀察到腎臟組織和功能的損傷均減弱。此類研究具有重要的臨床價值。

腎臟替代治療目前仍然是AKI的主要治療手段[19]。但是此治療并沒有明顯縮短AKI的病程，而強化治療方案也并沒有增加存活率和改善遠期預后。從長遠來看[20]，應(yīng)用Klotho減少腎單位的損傷，促進腎臟恢復是治療新思路。Klotho保護腎臟免受損傷的具體機制尚不得而知，而抗氧化、抗吞噬、促進血管增生在其中可能起到重要的作用。

除了AKI，還應(yīng)該注意CKD患者Klotho的水平也減少。目前已經(jīng)有不同的實驗室采用不同的實驗動物模型，均得到了相同的Klotho保護腎功能的結(jié)論。通過病毒導入Klotho基因的動物，更好維持腎臟的功能，減少尿蛋白，而且降低了血管緊張素Ⅱ?qū)δI小管間質(zhì)的改變[21]。在免疫相關(guān)的腎小球腎炎中，通過病毒導入Klotho基因，使之高表達，能夠抵御氧化應(yīng)激，減少腎臟損傷，提高患者的生存率。還有研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性高血壓大鼠中，通過病毒導入高表達Klotho基因，有降低血壓，改善腎臟組織，抑制氧化的作用。

采用CKD大鼠制備單側(cè)腎臟切除加對側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型，結(jié)果Kl+/-CKD大鼠存在高血壓、貧血、肌酐清除率下降、蛋白尿、嚴重的腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。相反，在Tg-KlCKD大鼠中，所有的改變均有不同程度的減弱[22]。所以，通過這個試驗，可以認為Klotho在動物中為腎臟保護因子。

4 Klotho對機體軟組織的鈣化調(diào)節(jié)

低鈣血癥和移位鈣化在CKD患者中比較常見，且多為高磷血癥導致。比如甲狀旁腺功能亢進、骨礦物質(zhì)鈣化不良、心血管鈣化等。調(diào)節(jié)血磷水平可以有效改善所有這些病變。CKD相關(guān)的血管鈣化在Kl-/-和WT小鼠中表現(xiàn)明顯，但是在Tg-Kl小鼠中，這些病理變化均消失。表明Klotho能夠阻止異位鈣化的發(fā)生[23]。Klotho具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能和松弛脈管系統(tǒng)的作用。

在Kl-/-和WT小鼠各個器官中均有嚴重的鈣化，而在Tg-Kl小鼠模型中鈣化非常少甚至沒有。同時還觀察到，在WT小鼠中甲狀旁腺激素水平高，在Tg-Kl小鼠中則相對較低。相對穩(wěn)定的Klotho水平能夠減少周圍軟組織的鈣化。

血管鈣化的另一個決定性因素為血清磷的濃度。Kl-/-和WT小鼠的血清中均含有較高濃度的磷，而相反在Tg-Kl小鼠中卻很少有表現(xiàn)為高磷血癥。既然Klotho為重要的血磷調(diào)節(jié)劑，那么另外一個可能機制是，其可能是通過增加尿中磷的排出量，降低血磷濃度來減少軟組織鈣化。

對于血清磷和血肌酐相同的條件下， Tg-Kl小鼠軟組織鈣化的程度最輕，Kl-/-小鼠的鈣化程度最重，而WT小鼠居中。僅僅通過不同的Klotho的濃度來確定異位鈣化的嚴重程度是不足的，血清磷和血肌酐水平一樣也起到了重要的作用。這種現(xiàn)象說明，Klotho可以直接保護軟組織對抗鈣化，且這種作用不依賴腎臟對尿磷的調(diào)節(jié)和其對腎小球濾過率的保護性作用。那么，Klotho作用于脈管系統(tǒng)的機制是什么？

Na-Pi聯(lián)合轉(zhuǎn)運蛋白(主要包括Pit1和Pit2)是血磷流入脈管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的主要載體，且是血管鈣化的主要元兇。正向調(diào)節(jié)劑Runx2(成骨細胞標志物)，負向調(diào)節(jié)劑SM22(平滑肌細胞的收縮標志物)在血管鈣化中均能監(jiān)測到。在Kl-/-小鼠動物模型中，Pit1、Pit2和Runx2表達增加而SM22表達減少。相反，Klotho過度表達的結(jié)果相反[23-24]。Klotho可能控制著平滑肌細胞的分化和去分化。在Klotho減少時，CKD表現(xiàn)為相同的表型，CKD的所導致的各種癥狀可以被Klotho阻斷。體內(nèi)實驗的一個缺點是，不能提供Klotho直接作用于磷轉(zhuǎn)運蛋白和血管平滑肌細胞分化的機制。

在體外生長的血管平滑肌細胞中，Klotho能夠作用于Na-Pi聯(lián)合蛋白阻止磷的轉(zhuǎn)入，減低高血磷導致的礦化作用。重組的Klotho能夠逆轉(zhuǎn)高磷所致的高表達的Runx2和低表達的SM22，表明Klotho能夠直接阻止磷所導致的去分化。數(shù)據(jù)表明,Klotho能夠通過3種機制發(fā)揮作用：增加尿磷排泄、保護腎功能、直接作用于血管平滑肌細胞[25-26]。

5 總 結(jié)

總之，腎功能損傷、修復與Klotho有著重要的關(guān)系。AKI可以伴隨Klotho的減少，而CKD也存在Klotho缺乏。Klotho不僅僅是腎臟疾病的蛋白標志物，而且其急劇減少打亂了CKD患者的礦物質(zhì)代謝和血管鈣化平衡。在AKI和CKD中早期應(yīng)用外源性Klotho蛋白能夠提高腎功能的恢復，提高患者的生存率。Klotho在腎臟病中至少起到兩重作用，(1)可以作為腎臟疾病早期敏感的生物學標志物。(2)應(yīng)用外源性Klotho能夠通過減少損傷和促進恢復起到治療作用。而對于CKD則可以減緩腎臟病的進展和減少并發(fā)癥。

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趙洪剛(1973-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事影像醫(yī)學及核醫(yī)學方面的研究。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.047

R692

A

1671-8348(2015)15-2139-04

2014-11-08

2015-02-21)