閆飛虎，王化磊，馮娜，楊松濤，夏咸柱

拉沙熱疫苗研究進(jìn)展

閆飛虎，王化磊，馮娜，楊松濤，夏咸柱

拉沙熱是由拉沙病毒（Lassa virus,LASV）引起的一種急性傳染病，主要由嚙齒類動(dòng)物傳給人。西非是拉沙熱最主要的流行區(qū)，該地區(qū)每年有幾十萬人患病，數(shù)千例死亡。由于LASV的高致病性，被列為潛在生物戰(zhàn)劑，當(dāng)前無獲批的拉沙熱疫苗。研究表明傳統(tǒng)的滅活疫苗免疫保護(hù)效果不理想，LASV基因重組的復(fù)制增殖型病毒載體疫苗、復(fù)制缺陷型病毒載體疫苗和DNA疫苗等新型疫苗顯示較好的發(fā)展前景。但是這幾種新型疫苗仍處于臨床預(yù)試驗(yàn)階段或臨床試驗(yàn)階段。

拉沙熱；拉沙病毒；疫苗

拉沙熱（Lassa fever,LF）是由拉沙病毒（Lassa virus,LASV）引起的急性傳染病，于20世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)于非洲尼日利亞東北地區(qū)的拉沙鎮(zhèn)，直到1969年才分離出病毒。LF臨床表現(xiàn)差異很大，大多數(shù)人感染后無明顯癥狀，少數(shù)嚴(yán)重感染后可引發(fā)肝、脾、腎、腦等多器官損傷及出血性休克等[1]。LF主要在西非（幾內(nèi)亞、利比里亞、塞拉利昂和尼日利亞）流行，發(fā)病率和病死率相當(dāng)高，西非每年大約有250 000例感染LASV，5000例死亡[2]。人可以通過接觸被LASV感染的嚙齒動(dòng)物的分泌物、排泄物、組織及血液而感染，人與人之間傳播主要通過消化道或呼吸道。由于LASV的高致病性，被列為A類潛在生物戰(zhàn)劑[3]。

LF的致死率盡管不如馬爾堡出血熱和埃博拉病毒病高，但感染范圍更廣，被視為嚴(yán)重威脅人類的疾病。為應(yīng)對LF威脅，早在20世紀(jì)80年代科學(xué)家即著手開展疫苗的研究，并在豬及非人的靈長類動(dòng)物中免疫，取得良好效果。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 弱毒活疫苗LASV被分離出后不久，Kiley等[4]用與LASV親緣關(guān)系密切的沙粒病毒屬的活Mopeia病毒免疫猴，攻毒結(jié)果提示該免疫猴能抵抗LASV的致死性攻擊。Mopeia病毒可能是LF理想的“天然”弱毒活疫苗候選者，但無論過去還是現(xiàn)在因涉及弱毒株的使用安全問題，而阻礙了疫苗研發(fā)[5-6]。

最近，Zapata等[7]研究的減毒疫苗候選株ML29初顯成效，它是LASV與Mopeia病毒的重配體。豚鼠和狨猴免疫接種ML29后均可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，并可抵抗LASV的致死性攻擊。進(jìn)一步研究表明：該疫苗在非人的靈長類動(dòng)物中也具有很好的免疫效果，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性高，不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象。因此，ML29是一種有發(fā)展前景的LF減毒疫苗候選。

1.2 滅活疫苗滅活LF疫苗曾用恒河猴實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示無保護(hù)作用[8]。滅活LASV的動(dòng)物雖然產(chǎn)生了抗LASV抗體，但是在攻毒后免疫動(dòng)物全部死亡，檢測發(fā)現(xiàn)其血清病毒水平與未免疫對照猴相同。該結(jié)果提示免疫保護(hù)還應(yīng)依賴于細(xì)胞免疫應(yīng)答。

有研究報(bào)道用滅活LASV免疫可以誘導(dǎo)狒狒有效對抗0.4蝕斑形成單位的LASV攻擊[9]。盡管當(dāng)前LASV滅活疫苗的前景不容樂觀，但是新型佐劑（如ISCOMATRIX）可顯著增強(qiáng)免疫機(jī)體的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可能增強(qiáng)滅活疫苗的免疫保護(hù)效能[10]。

2 重組活載體疫苗

2.1 復(fù)制增殖型病毒載體疫苗第一個(gè)LASV基因重組疫苗是利用重組的牛痘病毒來表達(dá)LASV Josiah毒株的核蛋白、表面糖蛋白和跨膜蛋白。恒河猴免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示：同時(shí)表達(dá)這3種蛋白的重組牛痘疫苗，或者同時(shí)表達(dá)表面糖蛋白和跨膜蛋白的重組牛痘疫苗免疫的動(dòng)物能有效對抗LASV攻擊，但是單獨(dú)表達(dá)核蛋白的重組牛痘疫苗卻不能誘導(dǎo)有效的免疫保護(hù)[3]。盡管牛痘病毒載體疫苗的研究顯示其在誘導(dǎo)抗LASV感染中的良好作用，但是活牛痘病毒載體疫苗對免疫抑制人群無效，此外先前接種的其他牛痘病毒載體疫苗（如天花疫苗）可能會(huì)干擾LASV基因重組牛痘病毒載體疫苗的免疫作用[11]。

另外2種具有強(qiáng)復(fù)制子的病毒載體也處于實(shí)驗(yàn)階段。一種以水泡性口炎病毒為載體[3]，另一種以黃熱病毒做載體[12-13]。通過反向遺傳技術(shù)，用LASV的糖蛋白基因取代水泡性口炎病毒的表面糖蛋白基因，拯救獲得表達(dá)LASV糖蛋白的重組病毒[14]。結(jié)果顯示此類疫苗對猴安全，免疫猴均能產(chǎn)生適度的特異性IgG抗體和低水平的中和抗體；LASV攻擊后，免疫猴的感染癥狀顯著輕于非免疫猴[3]。

黃熱病病毒重組LF疫苗用減毒黃熱病病毒疫苗株YFD-17D構(gòu)建。在過去的70年中，YFD-17D免疫接種過幾百萬人，顯示出高安全性和良好免疫原性，被廣泛應(yīng)用于嵌合疫苗的構(gòu)建。如能用其成功構(gòu)建一種既抗黃熱病又抗LF的嵌合疫苗，則是非洲人民的福音。但是，采用YFD-17D與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的LASV進(jìn)行嵌合很困難。在起初的探索中，將LASV的糖蛋白基因嵌合到黃熱病病毒中，并同時(shí)保留黃熱病病毒的膜蛋白基因。盡管該嵌合病毒構(gòu)建成功，豚鼠實(shí)驗(yàn)顯示其能誘導(dǎo)有效的抗LASV免疫，但是該嵌合病毒復(fù)制率很低，且在細(xì)胞中傳幾代后變得不穩(wěn)定[12，15]。為了獲得復(fù)制率高且更加穩(wěn)定的嵌合病毒，僅表達(dá)LASV表面糖蛋白或跨膜蛋白的嵌合病毒得到研發(fā)，盡管該嵌合病毒的復(fù)制率和穩(wěn)定性均有提高，但是免疫保護(hù)性不理想[12]。

2.2 復(fù)制缺陷型病毒載體疫苗迄今，2種不同的復(fù)制缺陷型疫苗研究已報(bào)道：委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒復(fù)制子[16]和病毒樣顆粒[17]。委內(nèi)瑞拉馬腦炎復(fù)制子疫苗系統(tǒng)由幾種RNA構(gòu)成，這幾種RNA由3種不同的cDNA在體外產(chǎn)生，其中1種可編碼復(fù)制子（即委內(nèi)瑞拉馬腦炎復(fù)制酶和LASV的囊膜糖蛋白前體蛋白基因或核蛋白基因），另外2種編碼委內(nèi)瑞拉馬腦炎的包膜蛋白和衣殼蛋白。用這幾種RNA共同感染細(xì)胞可產(chǎn)生委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒樣顆粒，這些顆粒包含LASV復(fù)制子，且這些顆?？蓮募?xì)胞培養(yǎng)物上清中純化獲得，該純化顆粒可感染細(xì)胞或動(dòng)物。因?yàn)闊o輔助RNA提供包裝成分，所以這種復(fù)制僅發(fā)生1次，而沒有其他感染性顆粒的產(chǎn)生。豚鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：連續(xù)免疫3次后在豚鼠體內(nèi)未檢測到中和抗體，只檢測到了一些非中和抗體，攻毒后部分免疫豚鼠出現(xiàn)病毒血癥，但均未出現(xiàn)臨床癥狀，非免疫豚鼠則全部死亡。提示特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗病毒感染中起重要作用[16]。

另外一種委內(nèi)瑞拉馬腦炎復(fù)制子疫苗是用同一RNA表達(dá)LASV糖蛋白和埃博拉病毒表面糖蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明這種疫苗可誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生免疫對抗LASV或埃博拉病毒的致命性攻擊，但是再次遭受LASV攻擊后免疫豚鼠會(huì)出現(xiàn)病毒血癥。

另一種是不具有自主復(fù)制能力的病毒樣顆粒，與全病毒相比病毒樣顆粒作為新型疫苗具有獨(dú)特優(yōu)勢：不能復(fù)制，安全性高；病毒樣顆粒憑借其本身的大小和電位等，能夠有效激活抗原提呈細(xì)胞及B細(xì)胞，既可通過組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）-Ⅱ類分子途徑又可通過MHC-Ⅰ途徑被加工提呈，從而誘導(dǎo)更有效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。LASV樣顆粒由質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的LASV糖蛋白、核衣殼蛋白和小蛋白組裝而成。沙粒病毒的小蛋白是病毒的基質(zhì)蛋白，它與病毒的出芽生殖有關(guān)，相關(guān)研究表明其可使形成的病毒樣顆粒從感染或轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中釋放出來[17]。形成的病毒樣顆粒形態(tài)上與真實(shí)的LASV相似，但其免疫保護(hù)性尚有待證實(shí)。

3 DNA疫苗

在重組DNA疫苗的構(gòu)建中最重要的是質(zhì)粒DNA。當(dāng)質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞之后，它利用宿主細(xì)胞內(nèi)的酶和原料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯出目的蛋白，類似原始的病毒進(jìn)入細(xì)胞后生產(chǎn)自己蛋白質(zhì)的過程。采用不同的方法（如基因槍技術(shù)和電穿孔技術(shù)）將DNA疫苗注入動(dòng)物體內(nèi)，讓DNA穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答。

一種表達(dá)LASV核蛋白基因的DNA疫苗可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，且可以抵抗另外2種沙粒病毒的攻擊（淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和伯欽特沙粒病毒）[18]。Grant-Klein等[19]將LASV糖蛋白基因重組DNA疫苗通過真皮內(nèi)電穿孔注射方式免疫豚鼠和短尾猴，可使100%的免疫動(dòng)物抵抗LASV的致死性攻擊。

4 LF疫苗可行性及挑戰(zhàn)

盡管LF是一種急性傳染性疾病，但尚無證據(jù)顯示幸存者有二次感染發(fā)生，提示采用滅活病毒疫苗接種預(yù)防是可行的[20]。但是，由于此病毒的高致病性，滅活疫苗生產(chǎn)中的病毒大量繁殖必須在生物安全4級實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行。另一個(gè)瓶頸是LASV的基因型多樣性，基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析將54株LASV分為4種血清型，菌株核苷酸水平變異高達(dá)27%，氨基酸水平變異高達(dá)15%[21]。盡管這些變異對菌株交叉免疫反應(yīng)的影響還不為人知，但用某一種血清型LASV作滅活疫苗可能不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗另一種血清型病毒的有效免疫。

抗LASV保護(hù)性免疫應(yīng)答不僅與體液免疫有關(guān)，更可能與細(xì)胞免疫有關(guān)。盡管人和非人靈長類動(dòng)物感染LASV會(huì)產(chǎn)生高水平特異性抗體，但是這些抗體都不是中和抗體，而從LF康復(fù)患者和動(dòng)物血清中檢測到的是低水平中和抗體[20]。研究發(fā)現(xiàn)LASV感染后幸存的短尾猴比死亡短尾猴的特異性T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)生更早、更強(qiáng)，能產(chǎn)生更多的細(xì)胞毒T細(xì)胞；病情嚴(yán)重的短尾猴細(xì)胞免疫應(yīng)答受到嚴(yán)重抑制，死亡短尾猴僅檢測到緩慢發(fā)生的低水平T細(xì)胞應(yīng)答[22]。這些提示特異性細(xì)胞免疫在抗LASV感染中有十分重要的作用。

基因工程疫苗是今后LF疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，研發(fā)能誘導(dǎo)特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答對抗所有血清型LASV的新型疫苗是可能的。多種研發(fā)前景良好的LASV基因工程疫苗已進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室或臨床前研究階段，但這些疫苗的實(shí)際應(yīng)用還有很長的路要走。

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（2015-02-08收稿 2015-03-17修回）

（責(zé)任編委 貌盼勇 本文編輯 陳玉琪）

Recent advances in the development of Lassa fever vaccines

YAN Fei-hu,WANG Hua-lei,FENG Na,YANG Song-tao*,XIA Xian-zhu*
Laboratory of Virology,Institute of Military Veterinary Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control,Changchun,Jilin 130122,China
*Corresponding author.Yang Song-tao,E-mail:yst62041@163.com;Xia Xian-zhu,E-mail:xiaxzhu@cae.com

Lassa fever is an acute viral disease caused by Lassa virus(LASV).The virus ismainly transmitted to humans by a rodent reservoir,Mastomys natalensis.The infection is endemic in West African countries,resulting in hundreds of thousands of cases annually,and causing approximately thousands of deaths each year.Due to its high pathogenicity,LASV is recognized as a potential agentofbio-warfare.Currently,there are no licensed vaccines for Lassa fever.Studies have shown that the vaccine prepared by in-activated LASV is not ideal for eliciting a protective immune response.Recently,several promising vaccine candidates against Lassa fever have been developed,such as replication-competent virus-vectored vaccines,replication-deficient virus-vectored vaccines and DNA vaccines.However,these novel typesofvaccine candidatesagainst Lassa fever remain to be pre-clinically and/or clinically evaluated.

Lassa fever;Lassa virus;vaccines

R512.99

A

1007-8134(2015)02-0122-03

國家科技支撐計(jì)劃（2013BAD12B04）

130122長春，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所病毒學(xué)研究室吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（閆飛虎、王化磊、馮娜、楊松濤、夏咸柱）；130118長春，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院（馮娜）

楊松濤，E-mail：yst62041@163.com；夏咸柱，E-mail：xiaxzh@cae.cn