李月濤，鄭學(xué)星，王翠玲，王化磊，楊松濤，夏咸柱

裂谷熱（Rift Valley fever,RVF）是由裂谷熱病毒（RiftValley fever virus,RVFV）引起的由節(jié)肢動(dòng)物傳播的一種急性、發(fā)熱性人獸共患傳染病。1930年，科學(xué)家Danbney等在肯尼亞裂谷的一次綿羊疾病暴發(fā)調(diào)查中首次分離到RVFV[1]。本病主要流行于非洲反芻動(dòng)物，可引起懷孕動(dòng)物流產(chǎn)及新生動(dòng)物死亡；人類對(duì)本病普遍易感，嚴(yán)重者可引發(fā)死亡。

WHO將RVFV列為生物戰(zhàn)劑之一，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心和農(nóng)業(yè)部將其列為A類病原體[2]，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將RVF列為A類法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》將RVF列入重點(diǎn)防范的13種外來動(dòng)物疫病。

據(jù)報(bào)道，1950—1951年肯尼亞暴發(fā)RVF疫情，造成10萬只羊死亡，2萬人感染[3]。1977年埃及暴發(fā)RVF疫情，25%～50%的羊、牛和駱駝感染，20萬人感染，598人死亡，有些地區(qū)感染率高達(dá)35%[4]。

值得注意的是，2000年9月RVF越過紅海，首次在傳統(tǒng)疫區(qū)以外的地區(qū)——阿拉伯半島（沙特阿拉伯和也門）出現(xiàn)疫情，增加了其向亞洲和歐洲其他地區(qū)傳播和擴(kuò)散的威脅[5]。

疫苗可以有效預(yù)防動(dòng)物和人的RVF。本文就RVFV的病原學(xué)、流行病學(xué)及疫苗最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病原學(xué)

RVFV是一種RNA病毒，屬布尼亞病毒科沙蠅病毒屬，只有1個(gè)血清型。RVFV顆粒呈球形，顆粒直徑為80～120 nm。病毒核酸為單股負(fù)鏈RNA，囊膜包圍的3個(gè)核糖核蛋白復(fù)合體對(duì)應(yīng)S、M和L基因組片段。L節(jié)段長(zhǎng)6404 nt，反向編碼RNA依賴的RNA聚合酶，也稱為L(zhǎng)蛋白。M節(jié)段長(zhǎng)3885 nt，反向編碼1個(gè)聚合蛋白，經(jīng)翻譯后剪切成2個(gè)大小分別為78 000 Da和14 000 Da的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSm）以及2個(gè)糖蛋白（GN和GC）。S節(jié)段長(zhǎng)度為1690 nt，利用雙向策略，反義鏈編碼核衣殼蛋白（N），正義鏈編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSs）[2]。

RVFV的各個(gè)蛋白在病毒復(fù)制和致病過程中的作用一直是研究的熱點(diǎn)。N蛋白和L蛋白與病毒基因組結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物，然后進(jìn)行基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。糖蛋白對(duì)于布尼亞病毒在高爾基體內(nèi)的成熟具有重要作用，GN和GC蛋白參與高爾基體的定位過程。研究表明，GN蛋白C端的48個(gè)氨基酸部位就是RVFV的高爾基體定位信號(hào)，而GC蛋白則通過物理作用與GN蛋白相結(jié)合從而定位于高爾基體。N蛋白是RVFV主要的免疫原，而病毒表面的GN和GC蛋白含有中和表位，均能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但只有GN能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。核衣殼蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體結(jié)合抗體。研究者利用單克隆抗體定位了GN糖蛋白含有的4個(gè)抗原決定簇，其氨基酸序列分別為Ⅰ（105－138aa）、Ⅱ（229－239aa）、Ⅲ（362－375aa）和Ⅳ（127－146aa）。表位Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ為中和表位，而表位Ⅲ為非中和表位。其中，抗原決定簇Ⅳ與構(gòu)象有關(guān)，蛋白經(jīng)SDS變性后不能與相應(yīng)的單克隆抗體Ⅳ反應(yīng)[6]。

2 流行病學(xué)

2.1 傳染源 小綿羊、小山羊和小牛是本病的主要傳染源。急性患者的血液和咽喉部有病毒存在，因此患者和其他動(dòng)物宿主也可成為本病的傳染源。感染動(dòng)物的血液、體液、內(nèi)臟和器官都具有傳染性。

2.2 傳播媒介 RVF主要是由蚊子傳播，已知的可傳播本病的蚊子種類超過20種，伊蚊和庫(kù)蚊是本病流行的主要媒介，不同蚊種在不同地區(qū)被證明是優(yōu)勢(shì)媒介。RVF能被多種蚊子傳播的特性使其很可能成為世界范圍內(nèi)重要的人獸共患病，而且綿羊和駱駝一旦感染發(fā)生高病毒血癥，會(huì)更有效地傳播本病。本病可以通過蚊蟲的卵巢傳播是其另一個(gè)關(guān)鍵的昆蟲學(xué)特征。具有感染性的卵在土壤中能保持休眠狀態(tài)幾年，一旦有適合的環(huán)境條件，如大量的降雨、發(fā)生洪水或修建大壩，可導(dǎo)致蚊卵孵化，大量蚊蟲滋生，新的感染性蚊蟲會(huì)導(dǎo)致新一輪RVF的暴發(fā)。

2.3 易感對(duì)象 RVFV具有很廣的脊椎動(dòng)物寄生譜，反芻動(dòng)物綿羊、山羊、牛和駱駝是其主要感染者。其他易感動(dòng)物包括羚羊、馬、猴、田鼠和野生嚙齒類動(dòng)物等。不同年齡的動(dòng)物易感程度和病情不同。羔羊感染RVFV的死亡率可達(dá)90%，成年羊的死亡率低于10%，懷孕母羊感染后幾乎100%流產(chǎn)。綿羊是RVFV的擴(kuò)增宿主和二級(jí)傳染源。人對(duì)RVFV普遍易感，可通過接觸、處理感染性材料或蚊蟲媒介叮咬感染。其中高危人群包括：①在本病流行地區(qū)露宿者；②流行地區(qū)的牧民、屠宰工作人員和獸醫(yī)以及其他與被感染動(dòng)物接觸者；③在流行病地區(qū)旅游的游客。人感染后，有癥狀的患者表現(xiàn)為肝炎、視網(wǎng)膜炎、發(fā)熱，或發(fā)展為綜合征，如肝炎、出血熱或腦炎，甚至死亡。本病病死率為1%左右。但近幾次發(fā)生的流行中，病死率有上升的趨勢(shì)[3]。

2.4 流行特點(diǎn) 本病呈地方性流行或暴發(fā)流行。多發(fā)于農(nóng)村和牧區(qū)。一般于5月末或6月初開始發(fā)病，11月底至12月終止流行。人的發(fā)病通常在動(dòng)物流產(chǎn)和發(fā)病后1～2周出現(xiàn)。本病有明顯的職業(yè)性，牧民、獸醫(yī)、屠夫和農(nóng)民多見，RVFV研究人員發(fā)病率也較高。

3 RVFV疫苗

3.1 滅活疫苗 第1個(gè)以人用為目的RVFV的疫苗于1962年由Randall及其同事開發(fā)[7]。這種疫苗基于Entebbe毒株，該毒株于1944年從來源于烏干達(dá)的蚊子中分離出來。原Entebbe毒株在原代猴腎細(xì)胞增殖并通過福爾馬林滅活。疫苗能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生中和抗體，個(gè)體須多次免疫以達(dá)到可檢測(cè)到的中和抗體滴度。疫苗效價(jià)在4～6℃條件下存儲(chǔ)8個(gè)月以上無改變，據(jù)報(bào)道，1000人以上免疫后無不適的影響[7]。此后，該疫苗由南非國(guó)家藥品生物研究公司（NDBR）生產(chǎn)，命名為NDBR－103疫苗，從1967年開始用于保護(hù)實(shí)驗(yàn)室工作者。

為提高疫苗生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，NDBR－103疫苗毒種被飾板純化，并在二倍體恒河猴細(xì)胞上增殖，用于開發(fā)新疫苗。新疫苗由政府服務(wù)部門（TSI－GSD）和美國(guó)軍隊(duì)委托索爾克研究所生產(chǎn)，被稱為TSI－GSD 200疫苗。Rusnak等[8]報(bào)道了TSI－GSD 200疫苗19年的免疫原性和安全性。結(jié)果表明，該疫苗耐受性良好，由于滴度下降均在首次疫苗接種后6～12個(gè)月，推薦首次疫苗接種后6個(gè)月加強(qiáng)劑量免疫。盡管TSI－GSD 200疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員的保護(hù)非常有價(jià)值，但3次基礎(chǔ)免疫和1次加強(qiáng)免疫的要求也表明，有必要研究一個(gè)更為有效的人用疫苗。

3.2 弱毒疫苗

3.2.1 Smithburn疫苗 19世紀(jì)40年代烏干達(dá)學(xué)者Smithburn通過RVFV在老鼠腦組織傳代開發(fā)了Smithburn疫苗，這是第1個(gè)RVFV疫苗。產(chǎn)生的嗜神經(jīng)Smithburn病毒目前仍在用作獸用疫苗，并且由南非Onderstepoort生物制品公司生產(chǎn)。該疫苗生產(chǎn)成本較低并且免疫接種1次就能產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫性，因此對(duì)流行地區(qū)RVFV的控制很有價(jià)值。然而，由于疫苗殘余毒力能導(dǎo)致接種的懷孕動(dòng)物流產(chǎn)和胎兒畸形，因此，Smithburn疫苗從未被考慮用于人類[9]。

3.2.2 Clone 13疫苗 Clone 13病毒株由74HB59毒株的噬斑純化克隆而來，該毒株從中非共和國(guó)的一例患者身上分離[10]。該病毒在NSS基因含有大的（70%）缺失，在小鼠中高度衰減。然而Clone 13疫苗不是完全無毒力的，因?yàn)橐豁?xiàng)研究表明16只接種小鼠中有2只出現(xiàn)延遲性神經(jīng)功能障礙和癱瘓[11]。綿羊[12]和牛[13]接種Clone 13疫苗的安全性和有效性研究表明，無任何不良反應(yīng)發(fā)生，且免疫效力較高。

3.2.3 MP－12疫苗 1985年，Caplen等[14]證明通過連續(xù)誘變RVFV開發(fā)活的減毒疫苗是一種可行的方法。強(qiáng)毒株ZH548通過在誘變劑5－氟尿嘧啶的存在下不斷傳代，誘變病毒的毒力持續(xù)減弱，第12代后收獲，被命名為MVP 12（后被命名為MP－12）。

2003 年，Morrill和 Peters[15]報(bào)道了一項(xiàng) MP－12疫苗在恒河猴的致病性和神經(jīng)毒性研究。MP－12的靜脈內(nèi)給藥導(dǎo)致低水平的病毒血癥，并且血清AST和ALT水平出現(xiàn)輕微的短暫升高，而GGT水平保持在正常范圍內(nèi)。不過，未出現(xiàn)臨床癥狀。為了研究MP－12疫苗潛在神經(jīng)毒性，分別通過肌內(nèi)、下丘腦和脊柱內(nèi)注射的途徑接種猴子。在第1個(gè)實(shí)驗(yàn)中，5只猴子中的2只變得感覺過敏并發(fā)展成肌肉震顫。在第2個(gè)實(shí)驗(yàn)中，23只猴子中的2只出現(xiàn)左或右下癱瘓。綜合2次實(shí)驗(yàn)研究得出結(jié)論：MP－12疫苗并非無害，但殘留的病理病變較輕微，在實(shí)驗(yàn)中觀察到的嚴(yán)重程度的順序與17 d黃熱病疫苗類似。

Morrill和Peters[16]還用恒河猴對(duì)疫苗的有效性進(jìn)行研究。通過肌內(nèi)注射接種疫苗并不會(huì)造成不良影響，盡管對(duì)對(duì)照組猴子攻毒未出現(xiàn)臨床癥狀，但免疫避免了病毒血癥的發(fā)生。隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，通過不同黏膜途徑接種疫苗可以防止病毒血癥發(fā)生。

對(duì)于MP－12疫苗的效力和安全性也進(jìn)行了人體試驗(yàn)研究，有63名志愿者參與[17]。研究表明未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，也未發(fā)現(xiàn)毒力回歸。

3.3 基因工程疫苗

3.3.1 亞單位和核酸疫苗 Collett和Schmaljohn團(tuán)隊(duì)是最先基于Gn和Gc亞單位疫苗開發(fā)的開拓者，他們第一批表達(dá)了牛痘病毒和桿狀病毒基因組的單個(gè)基因，并且研究了這些蛋白質(zhì)的免疫原性。近年來，Kortekaas等[18]開發(fā)出一種基于Gn胞外結(jié)構(gòu)域（GN－e）的亞單位疫苗，主要的目標(biāo)是產(chǎn)生中和抗體。該GN－e蛋白與Stimune佐劑配制后在給小鼠和羊羔誘導(dǎo)單次接種后產(chǎn)生中和抗體，并保護(hù)羊羔避免出現(xiàn)病毒血癥、發(fā)熱和臨床體征。

DNA疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)是容易生產(chǎn)，而免疫原性差是過去幾十年一直困擾的主要問題，隨著技術(shù)的提高有望盡快克服這一障礙?？刂芌VFV的實(shí)驗(yàn)性DNA疫苗已經(jīng)開發(fā)出來，并且在嚙齒類動(dòng)物模型上獲得了良好的結(jié)果。在綿羊上進(jìn)行了第1個(gè)DNA疫苗實(shí)驗(yàn)，雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議須進(jìn)一步改進(jìn)其免疫原性，但也表明這是一個(gè)可行的方法。

3.3.2 載體疫苗 在過去的10年中，先后開發(fā)評(píng)估了幾個(gè)人用的基于病毒載體的RVFV疫苗。近年來，基于痘病毒的改良安卡拉牛痘（MVA）疫苗和以痘病毒為基礎(chǔ)的候選疫苗在狒狒上的實(shí)驗(yàn)表明，痘病毒載體疫苗具有安全性和免疫原性[19]?；诩撞《緩?fù)制子和復(fù)制缺陷型腺病毒載體CAdVax和ChAd－Ox1的試驗(yàn)性疫苗也已經(jīng)開發(fā)出來。

Kortekaas等[20]開發(fā)了一種基于副粘病毒新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）的載體疫苗。單次接種產(chǎn)生的中和抗體保護(hù)羔羊未出現(xiàn)病毒血癥和臨床癥狀。這個(gè)疫苗被稱為NDV－GnGc，已經(jīng)開發(fā)用于家畜使用，該疫苗良好的免疫原性及安全性特征使其特別適合作為人的候選疫苗。NDV作為疫苗載體應(yīng)用于人類的潛在用途已被廣泛接受，因?yàn)槿祟惒皇荖DV的天然宿主，最大限度減少了由于載體存在先天性免疫力導(dǎo)致接種失敗的危險(xiǎn)性[9]。

3.3.3 病毒樣顆粒（virus－like particles,VLPs）疫苗 VLPs是由某種病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的空心蛋白顆粒。與全病毒相比，VLPs作為疫苗具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：①安全性高，不含病毒核酸，無法自主復(fù)制，不存在基因重組或重配和毒力回復(fù)的可能；②表面抗原排列高度重復(fù)有序；③保持病毒抗原的天然構(gòu)象，易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別；④允許外源蛋白的摻入；⑤能區(qū)別動(dòng)物自然感染與免疫[21]。VLPs憑借本身的大小、電位等性質(zhì)，能夠有效激活抗原提呈細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞[22－23]，既可通過主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）－Ⅱ類分子途徑又可通過MHC－Ⅰ類分子途徑進(jìn)行加工提呈，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫[24－26]。這使得在無病毒復(fù)制條件下樹突狀細(xì)胞能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[27]。因此，某些VLPs既能激活輔助性T淋巴細(xì)胞又能激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，而且VLPs可以直接誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，從而對(duì)共刺激分子及細(xì)胞因子進(jìn)行正調(diào)控以激活CD8+T淋巴細(xì)胞[28－29]。目前，有2種人用VLPs疫苗批準(zhǔn)上市，分別是英國(guó)葛蘭素史克公司生產(chǎn)的乙型肝炎疫苗和二價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗以及美國(guó)默克公司生產(chǎn)的乙型肝炎疫苗和四價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗[30]，其他多種病毒VLPs疫苗正在研發(fā)或處于臨床試驗(yàn)階段[31]。由此顯示了VLPs作為疫苗的廣闊應(yīng)用前景。

RVFV VLPs是一個(gè)不被復(fù)制的病毒粒子，它由病毒的被膜G1、G2及N蛋白組成，并且吸附到細(xì)胞受體上，就像感染了RVFV。在VLPs吸附到細(xì)胞受體后，病毒的被膜蛋白在內(nèi)吞溶酶體內(nèi)被消化，然后MHC－Ⅱ提呈抗原，這證明VLPs的抗原穩(wěn)定性和免疫原性超過了可溶性蛋白[32]。N?slund等[33]共表達(dá)了 RVFV 的 N、L、G1、G2、78 ku NSm，用 RVFV VLPs免疫老鼠產(chǎn)生的中和抗體滴度是1∶250～1∶1250，被免疫的老鼠在RVFV ZH548病毒株的攻擊中成功獲得保護(hù)。實(shí)驗(yàn)表明，基于VLPs的實(shí)驗(yàn)性疫苗（種）在小鼠模型上具有很好的免疫原性，甚至在沒有佐劑存在時(shí)也可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體。

4 結(jié) 語

總之，每種RVFV疫苗都有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。滅活疫苗雖然安全，但須重復(fù)增加劑量；弱毒活疫苗雖然免疫原性較高，但存在毒力回歸的生物安全隱患。近年來，運(yùn)用反向遺傳技術(shù)生產(chǎn)的RVFV疫苗具有高效性和穩(wěn)定性?；蚬こ桃呙缑庖甙踩?，但由于進(jìn)行特異性動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)有限，免疫的途徑、劑量、毒株的篩選、中和抗體的滴度和測(cè)定有待確定。VLPs疫苗以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)具有良好的發(fā)展前景，但其在規(guī)?；a(chǎn)及如何降低生產(chǎn)成本方面還須進(jìn)一步改進(jìn)。

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