尚 卿綜述，劉遠(yuǎn)梅審校（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒普胸泌外科，貴州遵義563099）

腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞發(fā)育與先天性巨結(jié)腸關(guān)系研究

尚 卿綜述，劉遠(yuǎn)梅審校
（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒普胸泌外科，貴州遵義563099）

干細(xì)胞； 腸神經(jīng)系統(tǒng)； Hirschsprung病； 胚胎發(fā)育； 綜述

先天性巨結(jié)腸（HD）也稱為先天性腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，是小兒外科常見的消化道畸形，普遍認(rèn)為其主要發(fā)病機(jī)制與胚胎時期腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞（ENCCs）遷移、發(fā)育、存活異常有關(guān)[1]，且與造成正常腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）發(fā)育異常有關(guān)。HD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，國內(nèi)外均對其發(fā)病原因進(jìn)行了大量研究，普遍認(rèn)為，ENCCs發(fā)育異常是HD發(fā)病的主要原因之一，現(xiàn)將影響ENCCs發(fā)育的因素綜述如下，進(jìn)一步探討HD的病因。

1 ENCCs的正常發(fā)育形成完整的ENS

ENCCs起源于迷走神經(jīng)和骶神經(jīng)的胚胎軸區(qū)域。迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞最終定植在前腸、中腸和后腸，而骶神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移定植到遠(yuǎn)端腸管。在小鼠胚胎，迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞于胚胎8.5 d開始遷移，于胚胎14.5 d結(jié)束，遷移大約需6 d[2]；在人類胚胎，ENCCs的遷移于胚胎4周時開始，結(jié)束于胚胎7周，大約花費(fèi)3周[3]。最開始普遍認(rèn)為，ENCCs必須通過盲腸部分可定植于后腸。但Nishiyama等[4]對小鼠胚胎ENCCs延遲成像的研究顯示，胚胎10.5～11.5 d，中腸和后腸呈反向平行，這時，ENCCs可通過二者間的腸系膜以單細(xì)胞的形式從中腸遷移至后腸，并且這些通過腸系膜遷移的ENCCs是組成后腸ENS的主要來源。此外，有研究表明，ENCCs定植到腸管各處后并非是一動不動的，單個細(xì)胞存在一個無目的的遷移[5]，甚至有由遠(yuǎn)端向近端，呈相反方向的遷移運(yùn)動，這種現(xiàn)象可能是ENCCs在腸管內(nèi)保持密度均勻的一種機(jī)制。另外，有學(xué)者認(rèn)為，小鼠胚胎10.5～14.5 d存在一個限制期，當(dāng)ENCCs未及時通過腸系膜遷移時，后腸的定植就會受到影響。但Barlow等[6]研究表明，即使胚胎14.5 d后也存在ENCCs的定植，這說明可能不單只有一個控制ENCCs遷移的限制期。目前，單純的遷移延遲已經(jīng)不能完全闡明HD的發(fā)病機(jī)制，而且ENS的形成也不單單只受到ENCCs增殖、分化的影響，還受到腸道內(nèi)環(huán)境的影響[7-8]。無論ENCCs在哪一環(huán)節(jié)上出現(xiàn)異常，都將導(dǎo)致ENS的發(fā)育缺陷，進(jìn)而可能引起HD發(fā)生。

2 影響ENCCs發(fā)育的腸道內(nèi)遺傳學(xué)因素

2.1 受體酪氨酸激酶（RET）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF） RET和GDNF是引起HD最主要的基因。在散發(fā)HD病例中（家族成員中只有1例HD患者）RET基因的突變率達(dá)15%～35%，而家族病例中達(dá)50%。GDNF是一種分泌蛋白，與GDNF家族受體α1（GFRα1，一種錨定在細(xì)胞表面的磷脂酰肌醇糖基化的蛋白）結(jié)合形成復(fù)合物，可以結(jié)合并激活跨膜RET。然后RET自身磷酸化激活下游通路，從而調(diào)節(jié)ENCCs增殖、存活、凋亡、遷移和分化。

在ENCCs遷移進(jìn)入胚腸前，GDNF在中胚層即有表達(dá)。當(dāng)其遷移入胚腸時，即開始表達(dá)RET和GFRα1；當(dāng)ENCCs到達(dá)食道位置時，GDNF已經(jīng)在胃表達(dá)；而當(dāng)ENCCs遷移至遠(yuǎn)端小腸時，GDNF已經(jīng)在盲腸表達(dá)[8]，表明GDNF的作用可能是促進(jìn)RET和GFRα1的表達(dá)，使ENCCs遷移至正確位置，如果后腸無GFRα1表達(dá)的話，ENCCs則不能離開中腸。近期，一種新的RET基因突變小鼠，表現(xiàn)為ENCCs通過腸系膜從中腸遷移至后腸時發(fā)生延遲和破壞，引起腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少癥[4]，這說明RET對ENCCs跨腸系膜遷移也起到調(diào)節(jié)作用。但需要注意的是，ENCCs遷移的延誤或數(shù)量的減少并不會必然導(dǎo)致腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的缺如，其不足的細(xì)胞數(shù)可以通過局部神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖和分化來代償[6-7]。無論基因突變是在RET、GDNF或GFRα1任何一處，只要GDNF-GFR α1-RET復(fù)合體功能缺陷，就可能導(dǎo)致無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥。

2.2 內(nèi)皮素通路 內(nèi)皮素因子3（EDN3或ET3）是一種腸道間質(zhì)細(xì)胞分泌的多肽，可以與內(nèi)皮素B型受體（EDNRB）結(jié)合，并通過內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1（ECE1）的修飾形成只有21個殘基大小的活性形式。EDN3-EDNRB信號通路參與調(diào)節(jié)ENCCs的正常遷移并維持腸神經(jīng)干細(xì)胞的增殖狀態(tài)[9]，抑制ENCCs的分化。

EDN3基因、EDNRB基因和ECE1基因突變小鼠均表現(xiàn)出不同程度的ENCCs遷移缺陷，造成遠(yuǎn)端腸管ENS的缺如。對EDNRB的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在條件性敲除EDNRB基因的研究中發(fā)現(xiàn)，EDN3-EDNRB信號通路的關(guān)鍵期在胚胎10.5～12.5 d，而且EDNRB缺失和EDN3缺失小鼠只在遠(yuǎn)端結(jié)腸上表現(xiàn)為腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，推測EDN3-EDNRB信號通路可能在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞遷移的后期起重要作用。在正常小鼠的胚胎14.5 d，ENCCs已經(jīng)完全遷移至整個小鼠腸道，而對于EDNRB突變小鼠，ENCCs的遷移較正常小鼠要晚24 h，而且ENCCs遷移方向改變的同時速度也降低[10]。最近，Evangelisti等[11]研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白B（ApoB）是GDNF/RET

和EDN3/EDNRB通路調(diào)控ENCCs的一個新靶點(diǎn)，可能與ApoB介導(dǎo)腸管內(nèi)Hu蛋白D型（HuD）蛋白的表達(dá)有關(guān)，這為將來進(jìn)一步研究ENCCs的特性提供了新的著手點(diǎn)。

2.3PHOX2B基因 PHOX2B基因可以編碼一種與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在ENCCs遷移過程中、腸神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)[12]。PHOX2B基因缺失的小鼠和斑點(diǎn)魚動物模型表現(xiàn)為全腸段的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥[13]，且在該突變小鼠的無神經(jīng)節(jié)腸管內(nèi)無RET的表達(dá)。在人體中，多聚丙氨酸延展突變是PHOX2B基因最常見的突變類型，臨床表現(xiàn)為先天性中樞性肺換氣不足綜合征（CCHS），同時合并有HD的發(fā)生，且丙氨酸延展越長，其HD表型也越嚴(yán)重[14]。其發(fā)生機(jī)制可能與PHOX2B基因和SOX10基因之間互相調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致自主神經(jīng)節(jié)發(fā)育異常有關(guān)[15]。

2.4 SOX10基因 SOX10基因也是一種轉(zhuǎn)錄因子，迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞從神經(jīng)管內(nèi)遷出時可表達(dá)SOX10，在ENCCs遷移過程中持續(xù)表達(dá)，并維持ENS前體細(xì)胞的活性。SOX10純合突變的小鼠表現(xiàn)為ENS和黑色素細(xì)胞的異常，這種小鼠“ENS前體細(xì)胞池”的細(xì)胞數(shù)相較正常小鼠明顯減少，且整個腸道均缺乏神經(jīng)元細(xì)胞。迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞在遷移入腸前就已經(jīng)死亡，所以該突變小鼠一出生就將死亡。人類SOX10基因突變表現(xiàn)為瓦登伯革綜合征，無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥就是其中一種表型。Nagashimada等[15]在研究“CCHS-HD-神經(jīng)細(xì)胞瘤”聯(lián)合動物模型時，通過引入一個重復(fù)擴(kuò)展突變的基因至小鼠的PHOX2B基因表位，使得突變胚胎腸道神經(jīng)節(jié)前體中SOX10基因持續(xù)表達(dá)，降低了ENCCs的擴(kuò)增和向膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力。說明SOX10基因和PHOX2B基因的相互調(diào)控可能是維持ENCCs向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵。Watanabe等[16]將SOX10基因突變小鼠和整合素β1（ITGB1）基因突變小鼠雜交后發(fā)現(xiàn)，SOX10基因的過多或過少表達(dá)同樣會影響ENCCs的定植能力，原因可能是SOX10基因表達(dá)的改變影響了整合素β1亞單位（一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)受體）的表達(dá)有關(guān)。這同樣也說明細(xì)胞外環(huán)境的改變，也將會影響ENCCs的遷移、定植。

2.5 CXCR4基因 CXCR4是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）的特異受體，位于細(xì)胞表面，表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞。CXCR4基因敲除小鼠表現(xiàn)為胃腸道大血管的形成缺陷，同時，這些小鼠在胚胎11.5 d通過腸系膜遷移的ENCCs數(shù)量減少，且在胚胎14.5 d相較于正常小鼠定植于后腸的ENCCs顯著減少[4]，暗示經(jīng)腸系膜遷移的ENCCs可能受到血管源性信號通路的部分影響。但最近Delalande等[17]認(rèn)為血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育對ENCCs的遷移無引導(dǎo)作用，甚至從最開始二者間就是獨(dú)立存在的，因此血管源信號通路與HD的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

2.6DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNMT3B）DNMT3B是哺乳動物體內(nèi)的DNA重新甲基化酶之一，在建立和維持個體DNA甲基化模式的過程中起到了非常重要的作用。盡管已有研究證明，DNMT3B與顱ENCCs的發(fā)育無關(guān)[18]，但Torroglosa等[19]于體外分離培養(yǎng)HD患者和健康人的ENCCs后發(fā)現(xiàn)，后者ENCCs神經(jīng)球的DNMT3B基因mRNA及蛋白表達(dá)量較健康組明顯下降，而Nestin（一種神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物）的表達(dá)較健康組明顯增高，這說明HD患者的ENCCs分化能力也相應(yīng)下降。同時，其研究還證實(shí)，HD患者ENCCs的FN1基因、LAMC1基因及PAX6基因表達(dá)也顯著下調(diào)，而PAX6低表達(dá)會降低細(xì)胞增殖能力[20]，高表達(dá)將促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化[21]。可以看出，異常的DNA甲基化模式可能調(diào)節(jié)ENCCs的發(fā)育，參與HD的發(fā)病，對DNMT3B聯(lián)合其他HD相關(guān)基因的研究也將進(jìn)一步闡明HD的病理機(jī)制。

3 影響ENCCs發(fā)育的腸道內(nèi)局部微環(huán)境因素

目前普遍認(rèn)為，HD為一多基因異常導(dǎo)致的疾病，但遺傳學(xué)因素尚不能完全闡明HD的發(fā)病，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腸道內(nèi)局部微環(huán)境的改變也可影響ENS的正常發(fā)育。腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是由ENCCs發(fā)育而來，而局部微環(huán)境的改變影響ENCCs的正常遷移及分化，是HD發(fā)生的主要非基因?qū)W病因之一。

3.1 維生素A 維生素A（又稱視黃醇）是一種人體必需的維生素，其活性形式維甲酸（RA）在胚胎發(fā)育中起重要作用。不足或過量地攝入維生素A均會導(dǎo)致胎兒先天缺陷，甚至造成死胎。最近研究顯示，敲除RBP4基因小鼠模型和敲除RALDH2基因小鼠模型[22]可能為HD的發(fā)病機(jī)制提供新的方向。該2種小鼠的肝臟不能保存維生素A，在胚胎7.5 d時開始對孕鼠行無維甲酸飲食，胎鼠將完全耗盡維生素A及維甲酸。RBP4基因缺陷小鼠表現(xiàn)為輕度的維甲酸缺乏伴遠(yuǎn)端腸管神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失癥，同時存在磷酸酶的增高和張力蛋白同源物（PTEN）的聚集，后者的堆積將降低ENCCs的遷移速度。因此，RA被認(rèn)為可能通過維持ENCCs遷移過程中偽足的形成，從而保持ENCCs的持續(xù)遷移。這也表明，維生素A的缺乏可能是引起HD的非遺傳危險因素。RALDH2基因缺陷小鼠通常于胚胎9.5 d左右死亡，早于ENS的發(fā)育。但是，如果從胚胎7.5 d開始對孕鼠添加維甲酸飲食處理，則胎鼠存活的時間大大延長，同時也表現(xiàn)出腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育不良。盡管上述的小鼠模型表明，維甲酸信號通路可能參與HD的發(fā)病，但無論哪種基因缺陷小鼠，其HD的表現(xiàn)均存在部分人為干預(yù)的因素，因此維甲酸對ENCCs遷移的具體機(jī)制仍有待探索。

3.2 骨形成蛋白（BMPs） BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族，是一種廣泛的調(diào)節(jié)因子，對胚胎期的細(xì)胞增殖、分化、凋亡和器官發(fā)育上均起作用。已有研究指出，BMPs及其相關(guān)的信號分子在ENCCs遷移及ENS神經(jīng)節(jié)形成過程中起作用[23]，最近發(fā)現(xiàn)低濃度的BMPs可提高神經(jīng)元數(shù)量，反之，高濃度的BMPs會減少腸道神經(jīng)元的數(shù)量，可能與BMPs限制腸道神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖有關(guān)。Wu等[24]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HD患者狹窄段腸管，BMP2、BMP5、BMP10表達(dá)顯著增加，說明這些蛋白與HD的發(fā)生有密切關(guān)系。但目前BMPs引起HD的具體機(jī)制尚不清楚，對其更深的研究可能會為治療HD提供一個新靶點(diǎn)。

3.3 細(xì)胞粘合素C（TNC） TNC也叫肌腱蛋白C，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。Akbareian等[25]發(fā)現(xiàn)，在禽類胚胎發(fā)育過程中，當(dāng)ENCCs到達(dá)盲腸區(qū)前，幾乎不表達(dá)TNC。一旦ENCCs通過盲腸進(jìn)入后腸時，就會在ENCCs周圍大量表達(dá)。其進(jìn)一步研究表明，ENCCs自身也產(chǎn)生TNC，而這種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過修正局部的內(nèi)環(huán)境促進(jìn)其遷移能力。此外，只有迷走神經(jīng)嵴來源的ENCCs表達(dá)TNC，而骶神經(jīng)嵴來源的ENCCs不表達(dá)這種蛋白，其原因尚不明了?？梢圆孪耄咛テ谠摰鞍妆磉_(dá)異常將會影響正常ENS的發(fā)育，成為HD發(fā)生的危險因素之一。

綜上所述，HD是一個復(fù)雜的疾病，其遺傳機(jī)制也異常復(fù)雜，且胚胎期腸道微環(huán)境的異常也參與了HD的發(fā)病。雖然已有大量的針對HD病因的研究，但單純的遺傳學(xué)原因不能完全解釋HD的發(fā)病機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究探索更多HD相關(guān)的遺傳和非遺傳因素。對于HD患者基因外顯子甚至是整個基因組序列的檢測，可能是一種理想的方式來確定是哪些基因的突變會引發(fā)HD。同時，對于腸道微環(huán)境及環(huán)境因素對ENS的影響也不能忽略。腸神經(jīng)干細(xì)胞移植治療HD一直被認(rèn)為可能是一種徹底治愈HD的理想方法，目前已有將患者自身提取的腸神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾后移植治療HD的報道[26]，因此研究新的HD動物模型、更深入的篩選、鑒定與HD發(fā)病有關(guān)的人類基因，并嘗試去發(fā)現(xiàn)這些基因突變后對ENS的影響，也將對未來HD的臨床診斷、治療，甚至對高危人群的HD預(yù)防起到積極作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.016

：A

：1009-5519（2015）08-1164-04

2014-12-05）

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字[2012]2364號）。

尚卿（1990-），男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事小兒普外科臨床工作；E-mail：pal40276292@163.com。

劉遠(yuǎn)梅（E-mail：yuanmei116@aliyun.com）。