曾 瑛綜述，曾 斌審校

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽421001）

DNA甲基化在肝癌發(fā)生與發(fā)展中的作用及研究現(xiàn)狀

曾 瑛綜述，曾 斌審校

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽421001）

肝腫瘤； DNA甲基化； 遺傳學(xué)，醫(yī)學(xué)； 綜述

肝臟是人體內(nèi)最大的消化及內(nèi)分泌器官，原發(fā)性肝癌（肝癌）具有易轉(zhuǎn)移、侵襲性強的特點，是臨床最常見的惡性腫瘤之一，5年生存率低，成為威脅人類生命第2名的惡性腫瘤。在我國，肝癌最主要的病因為病毒性肝炎，其中以乙型肝炎、丙型肝炎最常見，而在西方國家則以酒精性肝病為主。近年來不明原因的肝癌越來越多見，并呈年輕化趨勢，隨著對肝癌研究的深入，發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)改變在肝癌發(fā)生中起核心作用，DNA甲基化、組蛋白修飾及miRNA表達異常均屬于表觀遺傳學(xué)改變，而肝癌發(fā)生的核心環(huán)節(jié)主要與DNA異常甲基化相關(guān)。本文就近年來DNA甲基化改變與肝癌的相關(guān)研究作一綜述。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為供體，將甲基基團轉(zhuǎn)移到DNA CpG序列的胞嘧啶5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶的過程。DNMTs包括3種類型——DNMT1、DNMT2、DN MT3a/DNMT3b。DNMT1在細胞中含量最豐富，具有維持甲基化活性的作用；DNMT3家族主要起從頭甲基化作用，使本來無甲基化的DNA雙鏈發(fā)生甲基化，是催化DNA甲基化最重要、最關(guān)鍵的酶，與腫瘤的早期事件密切相關(guān)；DNMT2的作用還有待進一步研究。CpG島超甲基化與抑癌基因的表達沉默有關(guān)，在腫瘤的早期發(fā)生過程中起重要作用；而腫瘤基因組普遍低甲基化與原癌基因的活化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、堿基丟失密切相關(guān)，并與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等有重要聯(lián)系。已有大量研究證實，DNA甲基化改變與肝癌關(guān)系密切，而DNMTs作為甲基化過程中的中間媒介，其表達水平高低與DNA甲基化水平有重要關(guān)聯(lián)。

2 DNA甲基化與肝癌的發(fā)生與發(fā)展

2.1 DNA低甲基化與肝癌 惡性腫瘤如胃癌[1]、乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、結(jié)腸癌[4]等普遍存在DNA低甲基化，肝癌也是如此。Nishida等[5]研究發(fā)現(xiàn)，全基因組DNA低甲基化是早期肝癌形成的重要機制，同時也是非肝硬化肝癌早期染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的重要原因?；虻图谆饕l(fā)生在重復(fù)的DNA序列中，可激活處于沉默狀態(tài)的DNA序列，如LINES和Alu等重復(fù)序列[6]，轉(zhuǎn)移自身基因組位置，使其功能遭到破壞。有研究通過檢測LINE-1基因的甲基化水平（13例健康人和50例肝癌患者）發(fā)現(xiàn)，肝癌患者LINE-1甲基化水平顯著低于健康人，且其甲基化水平越低，腫瘤體積越大，分化水平越低，甲胎蛋白水平相對越高，患者1～2年生存率就越低[7]。Shen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，53例肝癌患者中 AKT3、CD147、CCL20和SCGB1D1基因呈現(xiàn)低甲基化水平，且與腫瘤惡性程度具有相關(guān)性。最近研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生與發(fā)展過程中人胰島素樣生長因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）基因P4啟動子低甲基化是一個早期和常見現(xiàn)象，在肝癌癌變過程中引起細胞染色體不穩(wěn)定性增加，并且參與P4啟動子表達激活[9]。多項研究發(fā)現(xiàn)，PAX4、HPA、VIM、uPA、c-myc基因低甲基化水平對肝癌的發(fā)生有促進作用[10-11]。DNA低甲基化激活了原癌基因Ras、myc等惰性基因的表達，研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中c-myc和c-N-Ras普遍呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，從而誘發(fā)肝癌的發(fā)生。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，在正常細胞中表達沉默的Trks家族在肝癌組織中表達卻上升，這與其在肝癌組織中啟動子區(qū)甲基化水平顯著降低相關(guān)，從而促進腫瘤的發(fā)生、存活、轉(zhuǎn)移[12]。

2.2 DNA高甲基化與肝癌 在肝癌中，抑癌基因表達沉默、DNA修復(fù)功能喪失均與啟動子CpG島高甲機化密切相關(guān)，致使DNA損傷不能及時修復(fù)，從而發(fā)生細胞異常增生，這與腫瘤發(fā)生有著密切關(guān)系。Hua等[13]在44例肝癌組織中發(fā)現(xiàn)，p16基因的甲基化率為64.5%，而癌旁組織中只檢出了5例，且p16基因高甲基化的患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著升高，為肝癌根治術(shù)術(shù)后患者復(fù)發(fā)風(fēng)險的評估提供了有力依據(jù)。Song等[14]、Shen等[8]采用定量甲基化特異PCR方法檢測到在肝癌組織及肝癌細胞株中，SOX1、NFATC1、BMP4、CDKN2A等基因 CpG島甲基化均呈高水平狀態(tài)，從而影響肝癌的發(fā)生，且甲基化狀態(tài)與肝癌的TNM分期顯著相關(guān)。Liu等[15]對乙醇及病毒引起的肝癌進行檢測，發(fā)現(xiàn)PAX5基因表達較正常組織明顯下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)PAX5啟動子區(qū)存在高甲基化狀態(tài)，可能是其表達下調(diào)的主要原因。Choi等[16]采用甲基化特異性PCR及雜合性缺失研究等方法，發(fā)現(xiàn)39例肝癌中有22例RIZI基因啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化，Lv等[17]研究表明，BTG3在肝癌組織中表達下調(diào)，與啟動子區(qū)高甲基化相關(guān)，2個實驗研究發(fā)現(xiàn)，RIZI和BTG3啟動子區(qū)甲基化水平越高，越容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，肝癌惡性程度越高，腫瘤體積相對越大，患者總存活率越低。P16INK4a是Rb信號通路中一種重要周期調(diào)控蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，其在肝癌中表達缺失，且其啟動子區(qū)CpG島甲基化率顯著高于慢性活動性肝炎及肝硬化組，結(jié)果表明，其表達缺失是啟動子區(qū)異常甲基化所致[18]?？傊?，大量研究證實抑癌基因表達沉默與DNA甲基化關(guān)系密切，是肝癌發(fā)生的重要表觀遺傳學(xué)改變。

2.3 DNMTs與肝癌 研究表明，DNMT在多種腫瘤細胞中表達增高、活性增強，而在DNA甲基化改變中起催化作用的甲基轉(zhuǎn)移酶包括DNMT1、DNMT3a/3b。普遍認為，從頭甲基轉(zhuǎn)移酶在腫瘤發(fā)生過程中較維持甲基轉(zhuǎn)移酶更為重要。李宏濤等[19]采用實時定量PCR檢測DNMT的表達情況，發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3b在MHCC97L、SMMC742、BEL7402、MHCC97M3和HepG25種肝癌細胞系中均呈高表達，且發(fā)現(xiàn)DNMT3a的表達水平越高，肝癌細胞系的遠處轉(zhuǎn)移能力可能越低。Qin等[20]發(fā)現(xiàn)，在55例肝癌組織中DNMT1表達水平均升高，且與門脈癌栓、腫瘤細胞分化高低及患者生存率相關(guān)。有學(xué)者報道，在大鼠肝癌模型中發(fā)現(xiàn)DNMT1及DNMT3b具有協(xié)助作用，均能促進抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化，并與肝癌組織浸潤性生長及門靜脈癌栓形成有關(guān)[21]。Mandrekar等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在癌旁組織、肝硬化組織及肝癌組織中，DNMTs表達逐漸升高，DNMTs種類也逐漸呈多樣化趨勢。Kanai等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肝癌組織中DNMT表達水平顯著升高，導(dǎo)致DNA高甲基化，從而誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌的發(fā)生。

3 DNA甲基化與肝癌的治療

因表觀遺傳學(xué)有可逆性，目前抑制抑癌基因DNA高甲基化水平，恢復(fù)其表達成為抗腫瘤藥物研發(fā)的主攻方向。目前研究較為廣泛的5-氮雜胞苷類制劑，已被批準用于骨髓異常綜合征的臨床治療。這類核苷類抗代謝藥通過競爭性結(jié)合DNMT結(jié)合位點而形成穩(wěn)定的共價鍵，從而達到抑制甲基轉(zhuǎn)移酶活性的作用。近來Tao等[24]采用RT-PCR及Western blotting檢測SMMC-7721肝癌細胞株相關(guān)抑癌基因的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)使用5-Aza-CR處理過的肝癌中端粒酶活性明顯下降，且hTERET啟動子區(qū)出現(xiàn)了去甲基化，使相關(guān)抑癌基因重新表達，誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡。Venturelli等[25]發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CR具有雙重抗腫瘤效應(yīng)，不僅能夠恢復(fù)腫瘤甲基化異常狀態(tài)，而且使腫瘤對凋亡誘導(dǎo)物質(zhì)（如腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體）具有增敏性，為其抗腫瘤作用提供了分析依據(jù)。其次像氨基苯甲酸類，如普魯卡因胺，是一種非核苷酸類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，研究表明普魯卡因胺能使肝癌細胞株HepG2高甲基化的GSTP基因去甲基化重新表達，鹽酸普魯卡因主要通過干擾DNA與DNMT1的結(jié)合位點，使超甲基化的CpG島去甲基化，繼而發(fā)揮治療腫瘤的作用。臨床試驗研究表明，普魯卡因胺的不良反應(yīng)相對較小，但由于其對心臟的不良反應(yīng)，而限制了臨床應(yīng)用。另有肼類，代表藥物肼屈嗪，Song等[26]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過肼屈嗪處理過的宮頸癌細胞中，抑癌基因APC表達明顯上調(diào)，且發(fā)現(xiàn)，肼屈嗪對多藥耐藥實體腫瘤有益。綠茶中含有豐富的茶多酚類，研究發(fā)現(xiàn)其具有去甲基化作用，不僅通過競爭抑制DNMT1的催化結(jié)合位點，從而抑制DNA甲基化，而且能使p16、hMLH1、06-MGMT基因的甲基化逆轉(zhuǎn)，使其激活；現(xiàn)已被食品藥品監(jiān)督管理局批準應(yīng)用于臨床，用于腫瘤治療前景可觀。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Zebularine、Psammaplin A均具有抑制DNMT活性，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。其中Zebularine也屬于核苷類制劑，有研究發(fā)現(xiàn)，Zebularine能激活RASSF1A、CIS等多個抑癌基因的表達，促進肝癌細胞凋亡，抑制其生長，且該藥在聯(lián)合抗腫瘤治療中不會使p16基因重新甲基化，可用于長期維持治療[27]。Zebularine具有毒性反應(yīng)少、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可口服等優(yōu)點，易于患者接受，臨床應(yīng)用前景廣泛。其他如姜黃素、雷公藤、三氧化二坤等藥物[28-29]均發(fā)現(xiàn)有抑制DNA甲基化作用，具有抗腫瘤效應(yīng)。

4 展 望

近年來DNA甲基化的研究進展迅速，為多種基因的甲基化與肝癌的早期診斷、預(yù)后及治療提供了一定的理論依據(jù)，但需要更多臨床樣本進行驗證和研究。肝癌的發(fā)生是多因素參與的復(fù)雜過程，還有許多問題待進一步研究，如組蛋白修飾及miRNA的表達異常、甲基化與染色質(zhì)重構(gòu)的關(guān)系等。此外，目前去甲基化藥物在臨床應(yīng)用上不夠成熟，藥物的劑量、給藥途徑、毒性反應(yīng)及確切療效仍不十分清楚，因此，在臨床上還需尋找特異性更強、敏感性更高的甲基化基因，研究不良反應(yīng)更低的去甲基化藥物，更早實現(xiàn)肝癌的分子靶向治療；但DNA去甲基化藥物也可能造成基因組不穩(wěn)定，存在其他組織潛在癌變風(fēng)險，如何防范和避免是需深入研究的問題。

[1]Compare D，Rocco A，Liguori E，et al.Global DNA hypomethylation is an early event in Helicobacter pylori-related gastric carcinogenesis[J].J Clin Pathol，2011，64（8）：677-682.

[2]Portela A，Esteller M.Epigenetic modifications and human disease[J].Nat Biotechnol，2012，28（10）：1057-1068.

[3]Yang B，Sun H，Lin W，et al.Evaluation of global DNA hypomethylation in human prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasm tissues by immunohistoc hemistry[J].Urol Oncol，2013，31（5）：628-634.

[4]Siegel R，Ward E，Brawley O，et al.Cancer statistics，2011：the impact of elim-inating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin，2011，61（4）：212-236.

[5]Nishida N，Kudo M，Nishimura T，et al.Unique association between global DNA hypomethylation and chromosomal alterations in human hepatocellular carcinoma[J].PloS One，2013，8（9）：e72312.

[6]De Smet C，Loriot A.DNA hypomethynation in cancer：Epigenetic scars of a neoplastic journey[J].Epigenetics，2010，5（3）：206-213.

[7]Ramzy II，Omran DA，Hamad O，et al.Evaluation of serum LINE-1 hypomethylation as a prognostic maker for hepatocelluar carcinoma[J].Arab J Gastroenterol，2011，12（3）：139-142.

[8]Shen J，Wang S，Zhang YJ，et al.Genome-wide DNA methylation profiles in hepatocelluar carcinoma[J].Hepatology，2012，55（6）：1799-1808.

[9]Dong ZZ，Yao M，Qian J，et al.Abnormal expression of insulin-like growth factor-IIandinterveningofitsmRNAtranscriptioninthepromotionofHepG2 cell apoptosis[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2013，93（12）：892-896.

[10]Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer：the next generation[J]. Cell，2011，144（5）：646-674.

[11]Pogribny IP，Rusyn I.Role of epigenetic aberrations in the developemet and progression of human hepatocellular carcinoma[J].Cance Lett，2014，342（2）：223-230.

[12]Jin W，Lee JJ，Kim MS，et al.DNA methylation-dependent regulation of TrkA、TrkB and TrkC genes in human hepatocellular carcinoma[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，406（1）：89-95.

[13]Hua D，Hu Y，Wu YY，et al.Quantitative methylation analysis of multiple genes using methylation-sensitive restriction enzyme-basedquantitative PCR for the detection of hepatocellular carcinoma[J].Exp Mol Pathol，2011，91（1）：455-460.

[14]Song MA，Tiirikainen M，Kwee S，et al.Elucidating the landscape of aberrant DNA methylation in hepatocellular carcinoma[J].PloS One，2013，8（2）：e55761.

[15]Liu W，Li X，Chu ES，et al.Paired box gene 5 is a novel tumor suppressor in hepatocellular carcinoma through interaction with p53 signaling pathway[J].Hepatology，2011，53（3）：843-853.

[16]Choi HN，Bae JS，Jamiyandorj U，et al.Expression and role of SIRT1 in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep，2011，26（2）：503-510.

[17]Lv Z，Zou H，Peng K，et al.The suppressive role and aberrent promoter methylation of BTG3 in the progression of hepatocelluar carcinoma[J]. PloS One，2013，8（10）：e77473.

[18]Ahmed R，Salama H，F(xiàn)ouad A，et al.Detection of aberrant p16INK4A methylation in sera of patients with HCV-related liver diseases：An Egyptian study[J].Med Sci Monit，2010，16（9）：CR410-415.

[19]李宏濤，梁后杰，李文梅，等.肝癌細胞系中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和HLA1類分子的表達及意義[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17（5）：1141-1143.

[20]Qin W，Leonhardt H，Pichler G.Regulation of DNA methyltransferase 1 by interactions and modifications[J].Nucleus，2011，2（5）：392-402.

[21]Medina-Franco JL，Caulfield T.Advances in the computational developmentofDNAmethyltransferaseinhibitors[J].DrugDiscov，2011，16（9/10）：418-425.

[22]Mandrekar P.Epigenetic regulation in alcoholic liver disease[J].World J Gastroenterol，2011，17（20）：2456-2464.

[23]Kanai Y.Genome-wide DNA methylation profiles in precancerous conditions and cancers[J].Cancer Sci，2010，101（1）：36-45.

[24]Tao SF，Zhang CS，Guo XL，et al.Anti-tumor effect of 5-aza-2′-deoxycytidine by inhibiting telomerase acitvity in hepatocelluar carcinoma cells[J]. World J Gastroenterol，2012，18（19）：2334-2343.

[25]Venturelli S，Berger A，Weiland T，et al.Dual antitumour effect of 5-azacytidine by inducing a breakdown of resistance-mediating factors and epigemetic modulation[J].Gut，2011，60（2）：156-165.

[26]Song Y，Zhang C.Hydralazine inhibits human cervical cancer cell growth in vitro in association with APC demethylation and reexpression[J].Cancer Chemother Pharmacol，2009，63（4）：605-613.

[27]Daniunaite K，Berezniakovas A，Jankevicius F，at al.Frequent Methylation of RASSF1 and RARB in Urine Sediments From Patients with Early Stage Prostate Cancer[J].Medicina（Kaunas），2011，47（3）：147-153.

[28]Liu Z，Xie Z，Jones W，et al.Curcumin is a potent DNA hypomethylation agent[J].Bioorg Med Chem Lett，2009，19（3）：706-709.

[29]Yang L，Luo JM，Wen SP，et al.Effect of As2O3 on demethylation of SHP-1 gene in human lymphoma cell line T2[J].Ai Zheng，2009，28（3）：249-254.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.08.019

：A

：1009-5519（2015）08-1173-03

2014-11-17）

曾瑛（1988-），女，湖南益陽人，碩士研究生，主要從事醫(yī)學(xué)臨床工作；E-mail：306712932@qq.com。