方 曉，高 慧 君，曹 憲 國，王 玲，路 潔，趙 殿 軍，劉 亞 龍，王 際 輝，肖 珊

（1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連韓偉養(yǎng)雞有限公司，遼寧 大連 116043）

0 引 言

抗生素在畜產(chǎn)品中的殘留對食品安全和人體健康造成了嚴(yán)重威脅，益生菌作為一種綠色的飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于畜產(chǎn)品生產(chǎn)中。我國對益生菌的研究始于20世紀(jì)80年代，從20世紀(jì)90年代開始有些益生菌產(chǎn)品進(jìn)入了市場［1］。2003年我國農(nóng)業(yè)部公布了可直接用于生產(chǎn)的15種動(dòng)物飼料添加劑：干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞鏈球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸乳桿菌、啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和沼澤紅假單胞菌［1］。目前市場上用于飼料的益生菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌、酵母和霉菌四大類［2］。芽孢桿菌是一種能耐受高溫、高壓和耐酸，能夠產(chǎn)生芽孢的好氧性非致病菌。芽孢桿菌在消化腸道內(nèi)消耗大量的氧氣，維持腸道厭氧環(huán)境，從而促進(jìn)乳酸菌、雙歧桿菌等厭氧益生菌的生長，抑制需氧致病菌的生長，維持腸道的菌群平衡［1－2］。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生維生素B1、B2、B6等多種B 族維生素，并能產(chǎn)生活性很高的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶以及多種氨基酸，增強(qiáng)腸道的吸收能力。芽孢桿菌抗逆性很強(qiáng)，可耐受顆粒飼料加工的影響。它在腸道或貯藏過程中都以內(nèi)生孢子的形式存在，不消耗飼料養(yǎng)分，可保持飼料的質(zhì)量。因此，芽孢桿菌以其抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)成為飼料加工中最理想的微生物添加劑［2］。目前使用的菌株有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌及東洋芽孢桿菌。本研究選用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌4類國家允許使用的芽孢桿菌制劑，研究其對蛋雞生產(chǎn)性能、雞蛋品質(zhì)、腸道菌群區(qū)系及糞便中臭味物質(zhì)的影響，旨在為合理添加芽孢桿菌制劑提供參考，為芽孢桿菌在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試 驗(yàn)

1.1 材 料

芽孢桿菌微生態(tài)制劑，購自山東寶來利來生物工程有限公司，產(chǎn)品中芽孢桿菌內(nèi)生芽孢大于0.8×1010cfu／g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)日糧

選用體重和產(chǎn)蛋率相近的392日齡的健康海蘭褐商品蛋雞600只作為試驗(yàn)動(dòng)物。隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25只蛋雞?？瞻讓φ战M飼喂基礎(chǔ)日糧（日糧配方見表1），試驗(yàn)一、二、三組在基礎(chǔ)日糧中分別添加0.15%的枯草芽孢桿菌、0.15%的地衣芽孢桿菌、0.15%的復(fù)合芽孢桿菌制劑（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌各占25%）。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平Tab.1 Ingredients and nutrient level of basal diet

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及管理

試驗(yàn)時(shí)間為2012－06－20—2012－09－10，其中，預(yù)飼期7d，正式試驗(yàn)期84d。試驗(yàn)蛋雞采用3層階梯式籠養(yǎng)飼養(yǎng)方式，專人飼養(yǎng)，人工加料及撿蛋。蛋雞自由采食和飲水，環(huán)境控制及免疫按蛋雞常規(guī)飼養(yǎng)管理進(jìn)行。

1.4 樣品的采集與處理

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，隨機(jī)選取48只雞，每個(gè)處理12只雞，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞。將雞宰殺后，剪去腹腔處的羽毛，剪開腹腔，并去除皮下脂肪。取出腸道后，迅速分別采集5g盲腸和十二指腸的內(nèi)容物于離心管中，置于－80 ℃冰箱中保存，待測。

1.5 檢測指標(biāo)和方法

1.5.1 生產(chǎn)性能

（1）產(chǎn)蛋率：以“天”為單位記錄每組的產(chǎn)蛋數(shù)（枚）、產(chǎn)蛋率（%）。

（2）蛋重：每天定時(shí)稱量雞蛋的質(zhì)量（g）并記錄。

（3）料蛋比：記錄各組每天的耗料量（g），根據(jù)總的雞蛋質(zhì)量和耗料量計(jì)算料蛋比（%）。

（4）破軟蛋率：記錄每組蛋雞的破軟蛋數(shù)，計(jì)算出破軟蛋率（%）。

（5）入舍死亡率：死亡蛋雞占入舍雞的百分比（%）。

（6）只日產(chǎn)量：每天計(jì)算蛋雞日產(chǎn)量（g／（只·d））。

（7）單耗：單耗＝飼料消耗量／存欄數(shù)。

1.5.2 雞蛋品質(zhì)

利用蛋殼厚度儀（日本ORKA，ESTG－01）測定雞蛋的蛋殼厚度，并利用蛋品質(zhì)測定儀（日本ORKA，EA－01）測定雞蛋的哈夫單位。

1.5.3 腸道菌群區(qū)系測定

在試驗(yàn)結(jié)束的當(dāng)天分別采集1g盲腸和十二指腸內(nèi)容物，用平板涂布法計(jì)算盲腸和十二指腸中葡萄球菌、腸球菌、腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。其中，乳桿菌培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基，腸桿菌培養(yǎng)用EMB培養(yǎng)基，葡萄球菌培養(yǎng)用SP培養(yǎng)基，腸球菌培養(yǎng)用EC培養(yǎng)基［2－3］。需氧菌和兼性厭氧菌在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24～72h。根據(jù)細(xì)菌在選擇培養(yǎng)基上形成的菌落特征（形態(tài)、大小、色澤等）及革蘭氏染色和鏡檢鑒定菌群。

1.5.4 蛋雞糞便臭味指標(biāo)

蛋雞糞便中的臭味指標(biāo)糞臭素和吲哚的檢測采用二甲氨基苯甲醛比色法［4］。糞便中糞氨的測定采用凱氏定氮法［4］，總有機(jī)酸和總揮發(fā)酸采用半微量蒸餾法［5］。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件的單因素方差分析模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，測定結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 日糧中添加芽孢桿菌對蛋雞的生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，在蛋雞日糧中添加0.15%的枯草芽孢桿菌，對蛋雞的生產(chǎn)性能沒有影響（P＞0.05）。在日糧中添加0.15%的地衣芽孢桿菌顯著地提高了入舍死亡率（P＜0.05），對蛋雞其他的生產(chǎn)性能指標(biāo)沒有影響（p＞0.05）。對比空白對照組，在日糧中添加復(fù)合芽孢桿菌顯著地提高了蛋雞的只日產(chǎn)量，顯著地降低了蛋雞的入舍死亡率，并在一定程度上提高了蛋雞的產(chǎn)蛋率（3.73%，P＞0.05），降低了破軟蛋率（17.28%，P＞0.05）。

表2 日糧中添加不同芽孢桿菌制劑對蛋雞生產(chǎn)性能的影響Tab.2 The influence of different Bacillus on production performance of laying hens

2.2 日糧中添加芽孢桿菌對雞蛋品質(zhì)的影響

由表3可知，蛋雞日糧中添加0.15%的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和復(fù)合芽孢桿菌顯著地提高了雞蛋的哈夫單位（P＜0.05）。其中，以枯草芽孢桿菌組作用最顯著，比空白對照組提高了4.32%。蛋雞日糧中添加0.15%的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和復(fù)合芽孢桿菌對蛋雞的蛋殼厚度、破軟蛋率、蛋質(zhì)量無影響（P＞0.05）。但是蛋雞日糧中添加0.15%的地衣芽孢桿菌和復(fù)合芽孢桿菌有降低破軟蛋率的趨勢。

表3 日糧中添加不同芽孢桿菌對雞蛋品質(zhì)的影響Tab.3 The influence of different Bacillus on egg quality

2.3 日糧中添加芽孢桿菌對蛋雞腸道微生物菌群區(qū)系的影響

2.3.1 盲腸微生物菌群

表4為日糧中添加不同芽孢桿菌對蛋雞盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。從表中可知，在蛋雞盲腸4類主要菌群中，乳酸桿菌的數(shù)量最高，其次是腸桿菌和腸球菌，葡萄球菌最少。與對照組相比，枯草芽孢桿菌組的腸球菌、腸桿菌顯著降低（P＜0.05），乳酸桿菌數(shù)顯著增加（P＜0.05）；地衣芽孢桿菌組和復(fù)合芽孢桿菌組的葡萄球菌、腸球菌和腸桿菌顯著降低（P＜0.05），乳酸桿菌數(shù)顯著增加（P＜0.05）。飼料中添加芽孢桿菌對盲腸的腸桿菌和乳酸桿菌影響較大，枯草芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌組、復(fù)合芽孢桿菌組的腸桿菌菌數(shù)分別減少了8.02%、18.71%、27.81%；乳酸桿菌分別增加了9.62%、17.99%、28.87%。其中，以復(fù)合芽孢桿菌組的作用最大，與對照組相比，葡萄球菌、腸球菌和腸桿菌分別降低了6.50%、5.75%、27.81%，乳酸桿菌增加了28.87%。

表4 日糧中添加不同芽孢桿菌對蛋雞盲腸微生物菌群變化的影響Tab.4 The effects of different Bacillus on laying hens cecum microbial flora 107cfu·g－1

2.3.2 十二指腸微生物菌群

表5為日糧中添加不同芽孢桿菌對蛋雞十二指腸微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響。從表中得知，在蛋雞十二指腸4類主要菌群中，乳酸桿菌的數(shù)量最高，其次是腸桿菌和葡萄球菌，腸球菌最少。與對照組相比，枯草芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌組和復(fù)合芽孢桿菌組的葡萄球菌、腸球菌、腸桿菌數(shù)顯著降低（P＜0.05），乳酸桿菌數(shù)顯著增加（P＜0.05）；其中飼料中添加復(fù)合芽孢桿菌制劑對蛋雞十二指腸微生物區(qū)系的影響最大，其次是地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。

表5 日糧中添加不同芽孢桿菌對蛋雞十二指腸微生物菌群變化的影響Tab.5 The effects of different Bacillus on laying hens duodenum microbial flora 107cfu·g－1

2.4 日糧中添加芽孢桿菌對蛋雞糞便中臭味物質(zhì)的影響

表6為日糧中添加芽孢桿菌對蛋雞糞便中臭味物質(zhì)含量的影響。由表6可知日糧中添加不同芽孢桿菌顯著地降低了蛋雞的糞便中的糞氨含量（P＜0.05），其中復(fù)合芽孢桿菌組降低幅度最大（23.94%）其次是地衣芽孢桿菌組（16.49%）和枯草芽孢桿菌組（9.57%）。日糧中添加枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對蛋雞糞便中揮發(fā)酸的含量無影響，其中枯草芽孢桿菌組的揮發(fā)酸含量為1.24%，相比于對照組揮發(fā)酸的含量降低了7.46%；地衣芽孢桿菌組的揮發(fā)酸含量為1.26%，比對照組降低了5.97%；日糧中添加復(fù)合芽孢桿菌顯著地降低了蛋雞糞便中的揮發(fā)酸含量（P＜0.05），比對照組降低了14.18%。日糧中添加芽孢桿菌顯著地降低了蛋雞糞便中總有機(jī)酸的含量（P＜0.05），對比空白對照組，日糧中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和復(fù)合芽孢桿菌的總有機(jī)酸的含量分別降低了13.87%、8.40% 和20.59%。日糧中添加芽孢桿菌顯著地降低了蛋雞糞便中的糞臭素和吲哚含量，其中復(fù)合芽孢桿菌組的作用最強(qiáng)，對比空白對照組，復(fù)合芽孢桿菌組的糞臭素和吲哚含量分別降低了8.23% 和6.42%。

表6 日糧中添加不同芽孢桿菌對蛋雞糞便中臭味物質(zhì)的影響Tab.6 The effects of different Bacillus on odor material of laying hens faeces

3 討 論

3.1 芽孢桿菌對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

很多學(xué)者對飼料中添加芽孢桿菌對蛋雞生產(chǎn)性能的影響做了研究，但是結(jié)果不一。辛娜等［6］的研究結(jié)果表明，在蛋雞飼料中添加3%的復(fù)合芽孢桿菌對蛋雞的生產(chǎn)性能沒有影響。張旭等［7］的研究結(jié)果表明，在日糧中添加5～25mg／kg的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的混合產(chǎn)品，顯著地提高了蛋雞的生產(chǎn)性能。很多學(xué)者對芽孢桿菌提高蛋雞生產(chǎn)性能的機(jī)制進(jìn)行了探討，研究結(jié)果表明芽孢桿菌在蛋雞腸道定植后可分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、葡聚糖酶、戊聚糖酶和纖維素酶等各種消化酶和促生長因子，增強(qiáng)了蛋雞的代謝水平，在一定程度上提高蛋雞的生產(chǎn)性能［8］。而且芽孢桿菌能促進(jìn)蛋雞機(jī)體產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制致病菌的生長繁殖，通過維持腸道的微生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫功能，從而防治家禽疾病，提高了蛋雞的健康水平，進(jìn)而提高了蛋雞的生產(chǎn)性能［9］。芽孢桿菌能促進(jìn)飼料營養(yǎng)素降解，提高飼料利用率，從而影響蛋雞的生產(chǎn)性能［7］。在本試驗(yàn)中，單一的芽孢桿菌對蛋雞的生產(chǎn)性能沒有影響，復(fù)合芽孢桿菌有提高蛋雞生產(chǎn)性能的趨勢。這可能是由于幾種芽孢桿菌復(fù)合后產(chǎn)生了協(xié)同作用，可產(chǎn)生乳酸菌素、抗菌肽等有益因子，提高了蛋雞的免疫力［10］，改善了蛋雞的健康狀況，從而提高了蛋雞的生產(chǎn)性能。

3.2 芽孢桿菌對雞蛋品質(zhì)的影響

雞蛋的哈夫值是美國農(nóng)業(yè)部蛋品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定表示蛋品新鮮度的指標(biāo)，目前國內(nèi)也是以該指標(biāo)為準(zhǔn)。哈夫單位值越高，表明蛋白黏稠度越好，雞蛋品質(zhì)越高。該指標(biāo)主要分為4個(gè)等級，AA 級：72或者更高；A 級：71～60；B 級：59～31；C 級：30或更低。本研究的結(jié)果表明飼料中添加芽孢桿菌顯著地提高了雞蛋的哈夫單位，與辛娜等［7］的研究結(jié)果一致。分析其原因可能是芽孢桿菌在動(dòng)物體內(nèi)增殖過程中優(yōu)化了蛋白質(zhì)的氨基酸組成，代謝產(chǎn)生了維生素供動(dòng)物機(jī)體利用，改善了礦物質(zhì)的吸收功能，增強(qiáng)了機(jī)體的抗應(yīng)激能力，從而使雞蛋蛋白濃度增加，提高了雞蛋的哈夫單位。

本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，飼料中添加地衣芽孢桿菌和復(fù)合芽孢桿菌有降低破軟蛋率的趨勢。此結(jié)果與李萬軍［11］、張宜輝［12］等的研究結(jié)果一致。其原因可能是芽孢桿菌在動(dòng)物腸道定植后，在其生長繁殖過程中能產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，降低動(dòng)物腸道的pH，抑制腸內(nèi)病原菌的生長，進(jìn)而促進(jìn)礦物質(zhì)吸收，減少蛋雞破軟蛋的發(fā)生率。

3.3 芽孢桿菌對蛋雞十二指腸和盲腸微生物區(qū)系的影響

蛋雞的正常微生物菌群是禽類與微生物在長期進(jìn)化中形成相互依賴的微生態(tài)系統(tǒng)，它與畜禽的免疫、營養(yǎng)等都有著密切的聯(lián)系。研究表明，在蛋雞飼料中添加益生菌可提高其對沙門氏菌、大腸桿菌等致病菌的抵抗力，對蛋雞具有保護(hù)作用［7］。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在日糧中添加0.15%枯草芽孢桿菌、0.15%地衣芽孢桿菌和0.15%復(fù)合芽孢桿菌制劑均顯著地降低了蛋雞十二指腸和盲腸中的有害菌的含量，顯著地提高了有益菌乳酸桿菌的含量。根據(jù)競爭性排斥作用原理，芽孢桿菌通過其代謝產(chǎn)物（如有機(jī)酸）進(jìn)行競爭性抑制，能使胃腸道內(nèi)的有益菌濃度增大，并進(jìn)行有效的繁殖，必然會使另一些細(xì)菌，尤其是致病菌的生長受到明顯抑制［13］。而且，芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，能夠消耗腸道內(nèi)的氧氣，促進(jìn)乳酸桿菌類有益菌群的增殖［14］。同時(shí)，由于有益菌的代謝使消化道酸度增加，在一定程度上促進(jìn)了其他耐酸有益菌的生長，也就競爭性地抑制了有害菌如腸球菌、腸桿菌的繁殖［15］。由于幾種芽孢桿菌復(fù)合后產(chǎn)生的協(xié)同作用，所以復(fù)合芽孢桿菌組對蛋雞腸道菌群的影響更大，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.4 芽孢桿菌對蛋雞糞便中臭味物質(zhì)的影響

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，蛋雞日糧中添加芽孢桿菌顯著地降低了糞便中臭味物質(zhì)的含量，與李海英等［16］的研究結(jié)果一致。蛋雞生產(chǎn)過程中，雞舍產(chǎn)生一定的有害氣體，如氨氣、二氧化碳、硫化氫等，很大一部分由大腸桿菌使糞便蛋白質(zhì)腐敗分解所產(chǎn)生［17］。芽孢桿菌可利用蛋雞消化道內(nèi)游離的氨及吲哚等有害物質(zhì)，減少糞便中氮、磷、鈣的排泄量，降低糞便臭味；同時(shí)芽孢桿菌能使大腸桿菌的含量減少，阻止蛋白質(zhì)向氨的轉(zhuǎn)化，減少了隨糞便排出體外的氨等有害氣體的含量［14］。此外，芽孢桿菌可分泌淀粉酶和蛋白酶等各種消化酶和促生長因子等多種生物活性物質(zhì)，協(xié)同芽孢桿菌產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物來增加飼料養(yǎng)分的消化和吸收，優(yōu)化飼料的消化方式，從而減少蛋雞糞便的臭味物質(zhì)的含量［14］。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，復(fù)合芽孢桿菌制劑對臭味物質(zhì)的降低作用優(yōu)于單一的芽孢桿菌制劑，其原因可能是復(fù)合芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物之間會產(chǎn)生協(xié)同作用，從而提高了其對臭味物質(zhì)的降低作用。

4 結(jié) 論

日糧中添加復(fù)合芽孢桿菌顯著地提高了蛋雞的只日產(chǎn)量，顯著地降低了蛋雞的入舍死亡率，并在一定程度上提高了蛋雞的產(chǎn)蛋率，降低了破軟蛋率。日糧中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和復(fù)合芽孢桿菌均能促進(jìn)乳桿菌的生長，抑制葡萄球菌、腸球菌、腸桿菌的繁殖。同時(shí)，日糧中添加3種不同的芽孢桿菌均能降低蛋雞糞便中吲哚、糞臭素和糞氨的含量，其中，復(fù)合芽孢桿菌的作用效果最佳。

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