孫 慶 元，張 雪，朱 歡

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

鐵皮石斛（Dendrobiumcandidum）是藥用石斛中的珍品，其含有的多糖、生物堿、氨基酸等成分具有多種生物學(xué)功能［1－2］。由于人們對(duì)野生鐵皮石斛的無節(jié)制采掘，使得野生鐵皮石斛資源日漸枯竭，而鐵皮石斛的種子極小，無胚乳，自然繁殖力極低，很難用實(shí)生苗進(jìn)行人工栽培。常規(guī)繁殖分株、扦插等方式的繁殖率低，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上的需要［3］。因此，利用人工組培快速繁殖幼苗已成為種植種源的首要來源。

然而，目前組培方式誘導(dǎo)原球莖增殖、分化生芽、壯苗生根后完成組培苗的培養(yǎng)，這種方式原球莖分化生芽后需再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)后才能完成組培苗的培養(yǎng)，兩次移植培養(yǎng)增加了染菌概率和人工及培養(yǎng)基成本［4－5］。因此，本研究利用生根發(fā)芽二合一培養(yǎng)基，一次性移植鐵皮石斛原球莖進(jìn)行生芽生根，減少染菌概率和人工及培養(yǎng)基成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

取由鐵皮石斛的嫩莖為外植體誘導(dǎo)60d后的圓球莖，實(shí)驗(yàn)材料取自大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取相同條件下生長(zhǎng)良好的鐵皮石斛原球莖，在無菌條件下切成1cm 直徑的小塊，分別接在不同的培養(yǎng)基中，每瓶接入原球莖2g，每種培養(yǎng)基接種20 瓶，培養(yǎng)90d。采用統(tǒng)一的培養(yǎng)條件：室溫保持25 ℃，相對(duì)濕度60%～80%，光照強(qiáng)度2 000lx，每天光照12h；每種培養(yǎng)基pH 為6.0，加入蔗糖20g／L，瓊脂粉6g／L。

1.2.1 原球莖的生根生芽培養(yǎng)

鐵皮石斛原球莖生根發(fā)芽以1／2MS 和N6為基本培養(yǎng)基，以ρ（KT）／ρ（NAA）、天然添加為研究因子，其中ρ（KT）／ρ（NAA）分別采用1.0／0.5、1.0／1.0、0.5／1.0三種處理方法。分別添加土豆汁或香蕉汁各100g／L，以1／2MS 和N6為基本培養(yǎng)基，不添加激素及天然添加物為對(duì)照組，培養(yǎng)90d，確定即最佳的培養(yǎng)基配方。

1.2.2 硝基氮氨基氮摩爾比對(duì)原球莖分化的影響

在不改變培養(yǎng)基中硝基氮和氨基氮總量基礎(chǔ)上，按n（NO3）／n（NH4）＝3∶2、4∶3和1∶1三種處理方法，以1／2MS培養(yǎng)基為對(duì)照，分別培養(yǎng)90d，確定影響圓球莖分化的最適n（NO3）／n（NH4）。

1.2.3 氮含量對(duì)圓球莖分化的影響

增加氨基氮與硝基氮總量，分別增加5、10和15g／L，以“1.2.2”中確定的最佳培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)90d，確定影響圓球莖分化的最佳施用氮含量。

1.2.4 活性炭對(duì)圓球莖分化的影響

在“1.2.2”、“1.2.3”確定的最佳培養(yǎng)基中，分別添加30、60和90g／L活性炭，以不加入活性炭為對(duì)照，培養(yǎng)90d，確定影響圓球莖分化的最適活性炭施用量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配方及激素比對(duì)圓球莖根苗分化的影響

由表1可以看出，在1／2MS培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基加入土豆汁，對(duì)鐵皮石斛原球莖的生芽和生根都未發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)作用，甚至加入不同質(zhì)量濃度比的KT 和NAA 也未見明顯的效果。但是土豆汁對(duì)鐵皮石斛原球莖的增殖有明顯的促進(jìn)作用。

在兩種培養(yǎng)基中加入的ρ（KT）／ρ（NAA）＝1.0／1.0時(shí)作用最明顯，其中在1／2MS培養(yǎng)基中鐵皮石斛原球莖增殖了6.3 倍；在N6 培養(yǎng)基中鐵皮石斛原球莖增殖更多，是未添加的7.15倍。

香蕉泥對(duì)兩種培養(yǎng)基中的鐵皮石斛原球莖的生芽和生根都有促進(jìn)作用，當(dāng)ρ（KT）／ρ（NAA）＝1.0／1.0時(shí)作用更明顯，且在1／2MS培養(yǎng)基中鐵皮石斛原球莖生根和生芽效果最好。

綜上所述，鐵皮石斛原球莖生根及生芽最理想的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、天然添加物和激素組合為1／2MS培養(yǎng)基，香蕉泥100g／L，NAA 1.0mg／L，KT 1.0mg／L。

表1 不同添加物對(duì)培養(yǎng)基中圓球莖分化的影響Tab.1 The effect of different natural agents on the protocorm differentiation

2.2 硝基氮氨基氮摩爾比對(duì)圓球莖分化成苗的影響

由表2 可以看出，改變培養(yǎng)基中n（NO3）／n（NH4）對(duì)鐵皮石斛生根和生芽均有促進(jìn)作用，尤其對(duì)根分化影響更為突出。其中n（NO3）／n（NH4）＝4∶3效果最好，莖高增加51.7%、鮮重增加59%、根長(zhǎng)增加3.86倍。

培養(yǎng)基中氨基氮硝基氮的比例對(duì)植物生長(zhǎng)和分化影響不同［6］。同時(shí)使用氨基氮和硝基氮不僅可以保證營(yíng)養(yǎng)元素平衡，也可避免在培養(yǎng)基中培養(yǎng)物對(duì)不同離子的吸收差異而產(chǎn)生培養(yǎng)基pH 的劇烈變化，影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)與分化，如大多數(shù)植物培養(yǎng)過程中單獨(dú)使用硝基氮時(shí)常會(huì)使pH 升高，單獨(dú)使用氨基氮時(shí)則會(huì)使pH 降低。

表2 不同摩爾比的硝基氮與氨基氮培養(yǎng)基對(duì)圓球莖分化成苗的影響Tab.2 The effect of different n（NO3）／n（NH4）on the protocorm differentiation

2.3 氮含量的變化對(duì)圓球莖分化的影響

由表3可以看出，適當(dāng)增加培養(yǎng)基中氮含量有益于鐵皮石斛原球莖的生根和生芽。與對(duì)照組相比，加入10g／L時(shí)效果最佳，鮮重增加44.5%、莖高增加21.4%、根數(shù)增加1 倍、莖粗增加33.3%、根長(zhǎng)增加10.4%、葉片顏色呈深綠色。

表3 氮含量對(duì)鐵皮石斛圓球莖分化成苗的影響Tab.3 The effect of nitrogen content on the protocorm differentiation

2.4 活性炭對(duì)原球莖分化的影響

由表4可以看出，隨著活性炭投加量的增加，鐵皮石斛植株數(shù)減少，說明在培養(yǎng)基中加入活性炭對(duì)鐵皮石斛圓球莖生芽有一定的抑制作用。加入30g／L 活性炭時(shí)鮮重增加78.9%、株數(shù)減少13.3%、莖高增加56.1%、根長(zhǎng)增加45.5%、根數(shù)增加12.5%；加入60g／L 活性炭時(shí)鮮重增加34%、株數(shù)減少26.7%、莖高增加57.6%、根長(zhǎng)增加84.8%、根數(shù)增加18.8%?；钚蕴抠|(zhì)量濃度在30～60g／L對(duì)植株數(shù)影響不大，對(duì)植株的根數(shù)和根長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。

活性炭可能促進(jìn)了根系的呼吸作用，從而促進(jìn)了根系的生長(zhǎng)發(fā)育。發(fā)達(dá)的根系就會(huì)增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，進(jìn)而莖高和鮮重增加。雖然活性炭促進(jìn)植株個(gè)體的生長(zhǎng)，但是由于活性炭抑制了植株分化，植株數(shù)減少，從而影響了培養(yǎng)基中鐵皮石斛總鮮重。

表4 活性炭對(duì)鐵皮石斛圓球莖分化的影響Tab.4 The effect of active carbon on the protocorm differentiation

3 結(jié) 論

在N6和1／2MS培養(yǎng)基中分別加入土豆汁，對(duì)鐵皮石斛原球莖的分化（生芽和生根）未發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)作用，但是對(duì)鐵皮石斛原球莖的增殖有顯著作用。1／2MS培養(yǎng)基中加入香蕉泥能促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的分化，加入ρ（KT）／ρ（NAA）＝1.0／1.0對(duì)鐵皮石斛原球莖的增殖和分化都是最適比例。1／2MS培養(yǎng)基中，n（NO3）／n（NH4）＝4∶3時(shí)，鐵皮石斛原球莖分化效果最好；氮質(zhì)量濃度為10g／L時(shí)，鐵皮石斛原球莖分化效果達(dá)到最佳?；钚蕴抠|(zhì)量濃度為30～60g／L時(shí)，鐵皮石斛原球莖分化效果最好。鐵皮石斛原球莖生根發(fā)芽二合一培養(yǎng)基的最適配方為1／2MS ＋香蕉汁10g／L＋KT 1.0mg／L＋NAA 1.0mg／L＋氮素10g／L＋活性炭30～60g／L。

［1］史宏志，韓錦鋒，劉國(guó)順，等.不同氮素營(yíng)養(yǎng)的煙葉氨基酸含量與香吃味品質(zhì)的關(guān)系［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，31（4）：319－322.

［2］魏鳳娟.鐵皮石斛組織培養(yǎng)與栽培技術(shù)研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：81－85.

［3］陳兆貴，譚俊.不同激素配比對(duì)鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響研究［J］.惠州學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（3）：11－14.

［4］王培忠，趙欣，張宗申.東北矮紫杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中褐化問題的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：5760－5762.

［5］溫明霞，聶振朋，林媚，等.鐵皮石斛組織培養(yǎng)與快速繁殖研究進(jìn)展［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，38（3）：227－229.

［6］謝從華，柳君.植物細(xì)胞工程［M］.北京：高等教育出版社，2005：75－87.