周 學(xué) 勤，王 嬋，王 紅 英

（1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

紅曲霉（Monascuspurpureus）的應(yīng)用在中國已有1 000多年的歷史，它是生產(chǎn)藥材、食品著色劑、紅曲米、紅曲酒的主要菌種［1］。紅曲色素作為天然色素，提取液中無黃曲霉素，安全無毒，可用于糖果、糕點(diǎn)、藥片、肉罐頭的染色［2－4］。中國食品發(fā)酵工業(yè)研究用紅曲紅色素代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞硝酸鹽對發(fā)酵香腸染色，用1.6 mg／g的紅曲色素形成的顏色接近于使用0.15 mg／g NaNO2產(chǎn)生的效果［5］。生產(chǎn)紅曲色素的傳統(tǒng)工藝是將紅曲霉固態(tài)發(fā)酵，此種方式耗糧多、周期長、勞動強(qiáng)度大、產(chǎn)率低且工藝煩瑣［6－8］。近年發(fā)展起來的液態(tài)發(fā)酵具有節(jié)約糧食、工藝簡單、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，但產(chǎn)量和色調(diào)偏低，工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)受到了制約。因此，提高紅曲色素產(chǎn)量及色調(diào)具有重要的意義［9－11］。

復(fù)合菌株發(fā)酵具有良好的發(fā)酵性能和穩(wěn)定性，可通過代謝產(chǎn)物等提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率［12－14］。朱振元等［15］將酵母發(fā)酵液及酵母細(xì)胞破碎液分別加入到紅曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)瓶中，提高了親水性色素和疏水性色素的產(chǎn)量；王偉平［16］將紅曲霉與啤酒酵母或米曲霉混合培養(yǎng)發(fā)酵，使得紅曲色素色價得到明顯提升。本實(shí)驗將酵母菌或酵母細(xì)胞破碎液加入紅曲霉液體培養(yǎng)瓶中，研究酵母及其細(xì)胞破碎液加入量、培養(yǎng)時間對紅曲色素產(chǎn)量、色調(diào)及紅曲霉菌絲體生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

紅曲霉（M.purpureus）、啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae），實(shí)驗室保藏菌種，由大連工業(yè)大學(xué)生物學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁固體培養(yǎng)基：用麥芽制成Bx 10°的麥芽汁，加入2%的瓊脂，pH 自然。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%，硝酸鈉0.3%，酵母膏0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%，去離子水溶解，pH 自然。

基本培養(yǎng)基：葡萄糖2%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%，去離子水溶解，pH 6.0。

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，去離子水溶解，pH 6.0，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，硝酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%，硫酸亞鐵0.001%，氯化鉀0.05%，去離子水溶解，pH 6.6。

1.2 方 法

1.2.1 紅曲霉的活化

將實(shí)驗室保藏的紅曲霉孢子粉用麥芽糖固體培養(yǎng)基二次活化培養(yǎng)后，得到純化的紅曲霉。

1.2.2 酵母菌及酵母細(xì)胞破碎液的制備

1.2.2.1 酵母菌的液體培養(yǎng)

將酵母菌接種于基本培養(yǎng)基（用于酵母菌對紅曲霉產(chǎn)紅色素的影響實(shí)驗）和YEPD 培養(yǎng)基（用于酵母破碎液對紅曲霉生產(chǎn)紅色素影響的實(shí)驗），35 ℃、170r／min的搖床中培養(yǎng)3d，計數(shù)。

1.2.2.2 酵母破碎液的制備

取上述酵母發(fā)酵液于7 000r／min條件下離心10min，收集菌體，稱濕重，用無菌水在無菌條件下沖洗幾次，加入適量的生理鹽水，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（2s，2s，300 W，400 W）進(jìn)行破碎。將破碎液在10 000r／min，4 ℃離心10min，取上清液，加入生理鹽水稀釋到500mL，備用。

1.2.3 紅曲霉的液態(tài)發(fā)酵

刮取活化后的紅曲霉的孢子粉于種子培養(yǎng)基中32 ℃、170r／min培養(yǎng)3d后，形成菌球大小均勻，直徑約2mm 的菌球，挑取10個紅曲霉菌球加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32℃、170r／min的搖床中培養(yǎng)24h。

1.2.4 紅曲霉與酵母菌及細(xì)胞破碎液的共同培養(yǎng)

向100mL紅曲霉發(fā)酵液中分別加入不同量的酵母菌及細(xì)胞破碎液，編號見表1。于30 ℃、170r／min培養(yǎng)6d，每隔1d測定一次，分別做3組平行實(shí)驗。

表1 酵母菌及破碎液的添加量Tab.1 Addictive amount of Saccharomyces cerevisiae and its lysate mL

1.2.5 紅曲霉產(chǎn)紅色素色價的測定

1.2.5.1 胞外色價

將發(fā)酵液在4 000r／min條件下離心10min，取上清液1mL加入9mL 的75%酒精，搖勻，以75%酒精作對照，測定510和410nm 的OD 值。胞外色素色價（U／mL）＝OD 值×稀釋倍數(shù)［17］。

1.2.5.2 胞內(nèi)色價

發(fā)酵液過濾后的菌絲體經(jīng)60℃烘干至恒重，將菌體于研缽中充分研磨，以75%乙醇定容至10mL，60 ℃浸提30min，每隔10min搖勻1次。取1mL該浸提液，加入9mL的75%酒精搖勻，以75%乙醇作空白對照，測定510 和410nm的OD 值。胞內(nèi)紅色素色價（U／mL）＝OD 值×稀釋倍數(shù)／菌體重［18］。

1.2.6 菌絲體干重

將發(fā)酵液離心、過濾，于90℃烘干5h，稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)色素及菌體生長的影響

在相同條件下對加入了不同酵母菌量（105個／mL）的紅曲霉進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每隔24h在510及410nm 波長處對胞外及胞內(nèi)色素色價進(jìn)行測量，并稱量菌體干重。

2.1.1 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞外色素的影響

從圖1可以看出，與照組相比，添加酵母菌與紅曲霉共同培養(yǎng)沒有改變紅曲霉色素生產(chǎn)曲線的基本模式，隨發(fā)酵時間的延長色素產(chǎn)量增加。胞外色素在紅曲霉與酵母混合后5d，第3組效果最好，紅色素（510nm）產(chǎn)量為2.58 U／mL，比空白組提高了41.75%。如圖2 所示，胞外黃色素（420nm）產(chǎn)量也是第3組達(dá)到最大，為2.37U／mL，比空白組提高了78.19%。

圖1 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞外紅色素的影響Fig.1 Effects of Saccharomyces cerevisiae on production of extracellular red pigment from Monascus purpureus

圖2 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞外黃色素的影響Fig.2 Effects of Saccharomyces cerevisiae on extracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.1.2 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)色素的影響

從圖3、4可以看出，隨發(fā)酵時間的延長，色素產(chǎn)量逐漸增加。胞內(nèi)色素在紅曲霉與酵母混合后5d達(dá)到最大值，第3組效果最好，紅色素產(chǎn)量為1 185.42U／g，比空白組提高了21.24%；黃色素產(chǎn)量為1 296.32U／g，比空白組提高了34.57%。

根據(jù)實(shí)驗結(jié)果推測，酵母菌與紅曲霉共同培養(yǎng)時，酵母菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶作用于真菌的細(xì)胞壁多糖的主要成分幾丁質(zhì)，成為紅曲霉細(xì)胞提高色素產(chǎn)量的刺激因子，增加細(xì)胞壁的通透性，從而提高色素產(chǎn)量；其次，可能是紅曲霉的細(xì)胞壁受到水解酶類水解時，菌體會與紅曲霉產(chǎn)生競爭作用，使紅曲霉生長受到自我保護(hù)，會大量產(chǎn)生疏水類物質(zhì)（如色素）抑制生長。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)接近尾聲時，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，菌株會以紅色素為營養(yǎng)物質(zhì)，消耗色素。

圖3 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞紅內(nèi)色素的影響Fig.3 Effects of Saccharomyces cerevisiae on intracellular red pigment of Monascus purpureus

圖4 酵母菌對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)黃色素的影響Fig.4 Effects of Saccharomyces cerevisiae on intracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.1.3 酵母菌對紅曲霉生長的影響

從圖5可以看出，添加酵母菌沒有改變紅曲霉生長曲線的基本模式，菌體質(zhì)量在紅曲霉與酵母混合后4d達(dá)到最大值，也是第3組菌體質(zhì)量達(dá)到最大值，為0.26g，比空白組提高了100%。

圖5 酵母菌對紅曲霉菌絲生長的影響Fig.5 Effects of Saccharomyces cerevisiae on mycelial growth of Monascus purpureus

2.2 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)色素及菌體生長的影響

2.2.1 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞外色素的影響

從圖6、7可以看出，添加酵母破碎液沒有改變紅曲霉色素生產(chǎn)曲線的基本模式，色素隨發(fā)酵時間的延長產(chǎn)量有所增加。胞外色素在紅曲霉與酵母破碎液混合后5d達(dá)到最大值，第2組效果最好，胞外紅色素產(chǎn)量為4.43 U／mL，比空白組提高了55.99%；胞外黃色素產(chǎn)量為4.03U／mL，比空白組提高了48.71%。

圖6 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞外紅色素的影響Fig.6 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on extracellular red pigment of Monascus purpureus

圖7 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞外黃色素的影響Fig.7 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on extracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.2.2 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)色素的影響

從圖8、9可以看出，胞內(nèi)色素在紅曲霉與酵母破碎液混合后5d達(dá)到最大值，第2組效果最好，胞內(nèi)紅色素產(chǎn)量為1 043.25 U／g，比空白組提高20.87%；胞內(nèi)黃色素產(chǎn)量為1 003.68U／g，比空白組提高了23.88%。

酵母細(xì)胞破碎液促進(jìn)了紅曲霉紅色素產(chǎn)量的增加，可能是破碎液中的幾丁質(zhì)酶對紅曲霉的刺激作用，也可能是酵母細(xì)胞破碎液中含有紅曲色素合成途徑中紅色素的前體反應(yīng)的酶的催進(jìn)物，具體是哪種成分催進(jìn)了次級代謝產(chǎn)物紅色素的合成有待進(jìn)一步研究。

圖8 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)紅色素的影響Fig.8 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on intracellular red pigment of Monascus purpureus

圖9 酵母破碎液對紅曲霉產(chǎn)胞內(nèi)黃色素的影響Fig.9 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on intracellular yellow pigment of Monascus purpureus

2.2.3 酵母細(xì)胞破碎液對紅曲霉生長的影響

如圖10所示，菌體質(zhì)量在紅曲霉與酵母混合后5d達(dá)到最大值。添加的酵母破碎液量為培養(yǎng)液體積的4%時效果最好，菌體質(zhì)量為0.41g，比空白組提高了19.35%。

圖10 酵母破碎液對紅曲霉菌絲生長的影響Fig.10 Effects of Saccharomyces cerevisiae lysate on mycelial growth of Monascus purpureus

2.3 酵母菌及其細(xì)胞破碎液對紅曲紅色素色調(diào)的影響

紅曲紅色素一般為多種色素的混合物，主要含紅色素和黃色素，兩者比值即為色調(diào)，色調(diào)也是評價紅色素質(zhì)量的指標(biāo)之一。若紅多于黃，即色調(diào)大于1，則顏色感官為深紅；反之，黃多于紅，即色調(diào)小于1，則顏色呈橙紅或橙黃色［18］。

取5d時每組的紅色素色調(diào)進(jìn)行比較，如表2所示，胞內(nèi)外紅曲色素色調(diào)均隨著酵母菌加入量的增大而減小，分析可能是因為酵母菌與紅曲霉競爭營養(yǎng)物質(zhì)，給紅曲霉造成了生產(chǎn)黃色素比紅色素更適宜的營養(yǎng)環(huán)境，從而使紅色素色調(diào)降低。而酵母細(xì)胞破碎液對紅色素色調(diào)的影響并不顯著，色調(diào)幾乎保持在1.00，表示紅色素色調(diào)的影響與酵母菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物無關(guān)。

表2 酵母菌及其細(xì)胞破碎液對紅曲色素色調(diào)的影響Tab.2 Effects of Saccharomyces cerevisiae and its lysate on hue of red pigment

3 結(jié) 論

混菌之間可互利共棲，產(chǎn)生協(xié)同作用，提高產(chǎn)率［19］。酵母菌與紅曲霉混合培養(yǎng)可使紅曲霉產(chǎn)色素量增加，在混菌培養(yǎng)5d、菌液加入量為12mL（培養(yǎng)液體積的4%）時，色素產(chǎn)量達(dá)到最大值，比紅曲霉單獨(dú)培養(yǎng)胞外紅色素和胞內(nèi)紅色素分別提高了41.75%和21.24%，菌體干重提高了100%。酵母細(xì)胞破碎液也可使紅曲霉產(chǎn)色素量增加，在共同培養(yǎng)5d，加入量為4mL（培養(yǎng)液體積的4%）時達(dá)到最大值，比紅曲霉單獨(dú)培養(yǎng)胞外紅色素和胞內(nèi)紅色素分別提高了55.99%和20.87%，菌體干重提高了19.35%。此外，實(shí)驗還研究了酵母菌及其破碎液對紅色素色調(diào)的影響，表明色調(diào)變化與酵母菌代謝產(chǎn)物無關(guān)。

酵母菌及其破碎液能增加紅曲色素產(chǎn)量，若能在規(guī)模化生產(chǎn)中應(yīng)用，將能產(chǎn)生可觀的效益。

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