熊　悅，魏榮芳，趙夢(mèng)娟，張萬舉

(黃岡師范學(xué)院 化工學(xué)院，湖北 黃州 438000)

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光譜法研究銅配合物Cu(ODA)(NBZIM)(HO)與DNA的相互作用

熊悅，魏榮芳，趙夢(mèng)娟，張萬舉

(黃岡師范學(xué)院 化工學(xué)院，湖北 黃州 438000)

摘要通過紫外光譜和熒光光譜法研究了三元銅配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O) (ODA=一縮二乙醇酸，NBZIM = 6-硝基苯并咪唑)與小牛胸腺DNA(CT-DNA)之間的相互作用。紫外光譜研究中，隨著DNA的加入，配合物的紫外吸收呈現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)，但未發(fā)生紅移；熒光光譜研究中，EB-DNA復(fù)合物的熒光隨著配合物的加入而明顯的猝滅。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)與CT-DNA之間的相互作用模式為溝槽結(jié)合。

關(guān)鍵詞銅配合物；DNA相互作用；溝槽結(jié)合;光譜法

DNA是是藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)之一，小分子化合物特別是過渡金屬配合物與DNA的鍵合和分子識(shí)別特性使其有可能作為DNA結(jié)構(gòu)探針，具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。了解金屬配合物和生物大分子相互作用的規(guī)律，不僅能夠闡明生物大分子本身的結(jié)構(gòu)和功能，還對(duì)明確藥物的作用機(jī)制、指導(dǎo)藥物的設(shè)計(jì)等具有十分重要應(yīng)用價(jià)值[2]。

苯并咪唑衍生物具有良好的抗癌、抗氧化、殺菌、消炎等活性，廣泛應(yīng)用于人體疾病、腫瘤以及動(dòng)植物病毒的防治[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，這些化合物與某些金屬形成配合物后，由于金屬離子的協(xié)同作用，其生物活性會(huì)得到進(jìn)一步的提高[6]，其中，有關(guān)苯并咪唑衍生物與過渡金屬元素所形成配合物的研究尤為引人關(guān)注。過渡金屬元素配位形式多樣、價(jià)態(tài)可變、配位數(shù)可調(diào)，可以形成結(jié)構(gòu)新穎、性質(zhì)獨(dú)特的系列配合物，在小分子化合物與生物大分子相互作用研究領(lǐng)域受到國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們的廣泛重視[7]。但是，目前有關(guān)苯并咪唑三元金屬配合物的研究還相對(duì)較少，有待于進(jìn)一步深入的研究。三元金屬配合物，由于含有兩個(gè)功能有機(jī)配體，其性質(zhì)往往比含有單一配體的金屬配合物更為優(yōu)異[8]。為了探討苯并咪唑三元過渡金屬配合物的性質(zhì)，選取6-硝基苯并咪唑(NBZIM)和氯化銅為原料，輔以第二配體一縮二乙醇酸(H2ODA)，合成了三元配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)，并采用紫外光譜和熒光光譜法對(duì)其與小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用進(jìn)行了研究。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器及試劑

pHS-25型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；TP-1901型紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析儀器廠)；FP-750w型熒光測(cè)定儀。

CT-DNA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購(gòu)于Sigma公司，其它試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；DNA溶液用Tris-HCl緩沖溶液配制。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

Tris-HCl緩沖液配制：量取0.5 mol·L-1的Tris水溶液25.00 mL和0.1 mol·L-1的HCl溶液37.50 mL，混合后用蒸餾水定容至100 mL，稀鹽酸調(diào)節(jié)其pH≈7.3。CT-DNA的純度采用紫外光譜檢測(cè)，DNA溶液在260 nm處和280 nm處的吸光度的比值A(chǔ)260/A280=1.83，說明符合DNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)采用文獻(xiàn)方法合成[9]：將0.027 g一縮二乙醇酸(H2ODA)和0.021 g NaCO3溶解于5 mL水中，攪拌溶解，1 h 后開始緩慢滴加含有0.034 g CuCl2的5 mL甲醇溶液，約0.5 h滴加完畢，升溫，回流，繼續(xù)攪拌反應(yīng)5 h。冷卻，過濾，濃縮后即可得目標(biāo)產(chǎn)物。

1.2.1紫外光譜滴定

以Tris-HCl緩沖液為溶劑配制濃度為10-5mol·L-1的配合物溶液，取溶液3 mL置1 cm石英比色皿中，空白池以3 mL Tris-HCl緩沖溶液作參比，在220~380 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)其吸收光譜進(jìn)行掃描。用微量進(jìn)樣器向樣品池和空白池中同時(shí)加入等量的DNA緩沖溶液，充分混合并靜置10 min后再進(jìn)行波譜掃描，測(cè)定DNA與配合物相互作用的紫外吸收光譜。實(shí)驗(yàn)過程中空白池中加入等量DNA緩沖溶液的目的是為了扣除DNA濃度對(duì)其紫外吸收的影響。

1.2.2熒光光譜滴定

按一定比例將溴化乙錠(EB)和CT-DNA配制成EB-DNA復(fù)合物，避光保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至所需濃度。熒光光譜測(cè)定中，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為522 nm，記錄EB-DNA復(fù)合物在540~630 nm的熒光，后向樣品池中逐步加入等量的配合物溶液，測(cè)定不同濃度下，配合物對(duì)EB-DNA復(fù)合物熒光的猝滅情況。系列試樣中EB的濃度為2×10-6mol·L-1，DNA的濃度為1×10-4mol·L-1，配合物的濃度 0~16×10-6mol·L-1。

2結(jié)果與討論

2.1　紫外光譜

配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)與CT-DNA相互作用的紫外光譜如圖1所示。在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，配合物出現(xiàn)了兩個(gè)吸收譜帶，其中234 nm處較強(qiáng)的吸收譜帶是由于配合物中配體NBZIM的π-π*躍遷引起的，而305 nm處有較弱的紫外吸收可以歸為配合物中Cu(II)→NBZIM的電荷轉(zhuǎn)移。由圖1可知，隨著CT-DNA的不斷加入，配合物的紫外吸收呈現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)，配合物的紫外吸收隨著DNA濃度的增大而逐漸減弱。r=16時(shí)(r=[DNA]/[Complex])，配合物在234 nm紫外吸收的減色率為10.12%。同時(shí)，從圖1中可以很明顯的看出，DNA加入的過程中雖然配合物的兩個(gè)紫外吸收峰都明顯減弱，但最大吸收峰位置均未發(fā)生位移，這說明配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)與CT-DNA之間的相互作用可能是溝槽結(jié)合[10]。

圖1　配合物與DNA相互作用的紫外光譜Fig.1 Absorption spectra of Cu(ODA)(NBZIM) (H2O) in the absence and presence of CT-DNA

2.2　熒光光譜

為了進(jìn)一步探討配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)與CT-DNA相互作用，采用EB為熒光探針對(duì)其進(jìn)行了研究。EB是研究小分子化合物與DNA相互作用最常用的熒光探針[11-12]，其機(jī)理在于：DNA分子本身的熒光強(qiáng)度很弱，EB在溶液中的熒光強(qiáng)度也不高，但當(dāng)EB插入到DNA的堿基對(duì)之間后，其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)；當(dāng)EB從DNA雙螺旋堿基對(duì)間出來時(shí)，熒光強(qiáng)度則顯著降低。因此，可以根據(jù)化合物對(duì)EB-DNA復(fù)合物熒光的影響研究?jī)烧唛g的相互作用。

配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)對(duì)EB-DNA復(fù)合物熒光的影響如圖2所示，隨著配合物的加入，EB-DNA復(fù)合物的熒光逐步降低，且其降低程度與配合物濃度成正比，許多與DNA以溝槽模式相結(jié)合的配合物也表現(xiàn)出類似的性質(zhì)[13]。結(jié)合紫外光譜法的研究結(jié)果，筆者推測(cè)配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)與CT-DNA是以溝槽模式相結(jié)合的，即配合物作用在雙螺旋DNA的大溝或者小溝區(qū)，競(jìng)爭(zhēng)了EB與DNA的結(jié)合，使得部分EB從EB-DNA復(fù)合物中游離出來，從而引起其熒光強(qiáng)度的降低[14]。

圖2　配合物對(duì)EB-DNA復(fù)合物熒光的影響Fig. 2 Fluorescence change that occurs when the EB-DNA system is titrated with the complex

3結(jié)論

以NBZIM、CuCl2為原料，輔以第二配體H2ODA合成了三元銅配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)，并采用光譜法對(duì)其與CT-DNA之間的相互作用進(jìn)行了研究。紫外光譜和熒光光譜研究實(shí)驗(yàn)表明，配合物Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)與CT-DNA相互作用的主要模式為溝槽結(jié)合，即配合物作用在雙螺旋DNA的大溝或者小溝區(qū)，引起了DNA結(jié)構(gòu)微環(huán)境的變化。

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編輯王菊平

Copper complex Cu(ODA)(NBZIM)(H2O)interacts with DNA using spectrum methods

XIONG Yue, WEI Rong-fang, ZHAO Meng-juan, ZHANG Wan-ju

(College of Chemical Engineering, Huanggang Normal University, Huangzhou 438000, Hubei, China)

AbstractThe ternary copper complex Cu(ODA)(NBZIM)(H2O) (ODA=oxydiacetate dianion, NBZIM=6-nitro-1H-benzimidazole) interacts with calf thymus DNA(CT-DNA) has been studied by electronic absorption titration and fluorescence methods. The absorption spectrum of the complex shows obvious hypochromism while no red-shift when titrated with CT-DNA. The emission intensity of EB-DNA system is reduced by the complex in the fluorescence experiment. The results indicate that Cu(ODA)(NBZIM)(H2O) interacts with CT-DNA in a groove mode.

Key wordscopper complex; DNA-binding; groove mode; fluorescence spectrum methods

基金項(xiàng)目黃岡師范學(xué)院轉(zhuǎn)型發(fā)展項(xiàng)目(xfg2015B17)；黃岡師范學(xué)院科研項(xiàng)目(2015014003)；黃岡師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201549).

作者簡(jiǎn)介熊悅，女，湖北黃岡人，黃岡師范學(xué)院制藥工程專業(yè)2013級(jí)學(xué)生。

收稿日期2015-05-28

doi10.3969/j.issn.1003-8078.2015.06.10

中圖分類號(hào)O632

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1003-8078(2015)06-0037-03