宋小青　安　民　陳春暉　李丹丹　魏會平

(河北北方學院基礎醫(yī)學院生物學教研室，河北　張家口　075000)

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紅花抗早孕作用及對早孕小鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子表達的影響※

宋小青安民陳春暉李丹丹魏會平

(河北北方學院基礎醫(yī)學院生物學教研室，河北張家口075000)

【摘要】目的研究紅花抗早孕作用及對早孕小鼠子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響，并觀察其毒理作用。方法將60孕鼠平均分為紅花低、中、高劑量組及空白對照組，每組15只。紅花低、中、高劑量組分別按相當于生藥量1、3、5 g/kg紅花單品水煎劑灌胃，空白對照組每日予等容積蒸餾水灌胃。另選28只未孕雌鼠，分組及灌胃方法同孕鼠組。比較各孕鼠組止孕率及子宮內(nèi)膜VEGF表達情況，并觀察各未孕組小鼠體質(zhì)量增長情況，評價紅花毒理作用。結果紅花低、中、高劑量組止孕率較空白對照組均明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨紅花劑量增加止孕效果越明顯(P<0.05)；紅花低、中、高劑量組孕鼠VEGF在子宮內(nèi)膜IOD值均低于空白對照組，但僅紅花中、高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，紅花低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；紅花低、中、高劑量組灌胃前后體質(zhì)量增長率均低于空白對照組，但僅紅花高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，紅花低、中劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論紅花能明顯降低孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達水平，影響胚胎血管的形成，從而起到抗早孕的作用，且無明顯毒副作用。

紅花為一年生草本植物，其藥用部分為干燥花。中醫(yī)學認為，紅花味辛微苦，性溫，歸心、肝經(jīng)，是活血通絡、祛瘀止痛之良藥[1]，常被用作抗早孕藥方的組份之一[2-3]。近年來對單味紅花煎劑抗早孕作用機制的研究也日益深入[4]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達對胚胎生長發(fā)育具有關鍵作用，Rabbani ML等[5]研究顯示，給交配后的大鼠注射抗VEGF抗體，其植入率及內(nèi)皮細胞增殖率均明顯降低。胡瑞華等[6]通過對比早期自然流產(chǎn)組和正常妊娠組孕婦血清VEGF的表達情況顯示，早期自然流產(chǎn)組外周血中VEGF的水平顯著低于正常早孕組(P<0.05)。本實驗擬通過研究紅花對早孕小鼠子宮內(nèi)膜VEGF表達的影響，進一步探討其抗早孕的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物昆明系成熟小鼠150只，其中雄性30只，雌性120只，清潔級，體質(zhì)量(27.6±2.2)g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SXCK-(軍)-2012-0004。

1.2主要藥品、試劑及儀器紅花(河北華佗藥房連鎖有限公司)，經(jīng)河北北方學院魏會平教授鑒定備用；VEGF兔抗小鼠一抗(北京博奧森生物技術有限公司)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；YP502N型電子天平(上海飄深機械有限公司)；SPX智能型溫箱(寧波江南儀器廠)；LEICA RMZ135型石蠟切片機(德國萊卡儀器有限公司)；OLYMPUS顯微鏡成像系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會社)。

1.3實驗方法

1.3.1抗早孕實驗取120只小鼠(雌雄比為3∶1)合籠過夜，次日晨檢，將有陰栓者取出定為妊娠第1 d，連續(xù)觀察4 d，并按妊娠日期分組飼養(yǎng)。隨機取60只孕鼠平均分為紅花低、中、高劑量組及空白對照組，每組15只。紅花低、中、高劑量組分別按相當于生藥量1、3、5 g/kg紅花單品水煎劑灌胃，于妊娠第6 d開始，早、晚各1次，連續(xù)給藥3 d；空白對照組每日予等容積蒸餾水灌胃。

1.3.2紅花毒理作用觀察通過觀察紅花對小鼠體質(zhì)量的影響，判斷紅花的毒理作用。隨機選取未作受孕處理且體態(tài)較為接近的28只雌性小鼠，連續(xù)喂養(yǎng)5 d后隨機分為4組，每組7只，并記錄各組小鼠體質(zhì)量。分組及給藥方法同1.3.1“抗早孕實驗”，10 d后分別稱質(zhì)量，比較各組小鼠體質(zhì)量增長率的差別。

1.4觀察指標及方法

1.4.1止孕情況比較給藥期間密切觀察各組孕鼠是否有陰道出血、流產(chǎn)及早產(chǎn)等止孕現(xiàn)象，均于妊娠第10 d處死，剖檢孕鼠子宮，統(tǒng)計并比較各組止孕率。

1.4.2VEGF表達分析取各組孕鼠子宮制作組織切片，將切片常規(guī)脫蠟至水，滴加雙氧水(H2O2)于37 ℃孵育15 min；加入檸檬酸鹽抗原修復液高壓修復10 min，自然冷卻；滴加非免疫山羊血清封閉液，孵育10 min，傾去封閉液，取VEGF工作液(即按1∶1 000稀釋抗體原液)滴加于相應的載玻片，4 ℃過夜孵育；滴加二抗(山羊抗兔)，孵育15 min；滴加SP溶液，孵育10 min。以上各步驟間，除“傾去封閉液”以外，其他步驟結束后均需磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，最后DAB顯色10 s，經(jīng)脫水、透明并封片后進行分析。每組隨機取3張切片，采用OLYMPUS顯微鏡成像系統(tǒng)拍攝照片，然后采用Image-Pro Plus 610圖像分析系統(tǒng)對圖片進行分析,每張切片隨機選定5個不重疊的視野，分別測量陽性染色部位的積分光密度值(IOD)，IOD值越大代表VEGF表達越強。

2結果

2.1各組孕鼠止孕情況比較連續(xù)給藥6次后，剖腹觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組孕鼠子宮壁明顯變薄，且有明顯串珠樣隆起，呈正常的肉粉色；紅花低、中、高劑量組孕鼠子宮頸有所增粗，但囊胚串珠隆起不明顯或消失，顏色偏暗紅。解剖子宮發(fā)現(xiàn)，空白對照組胚胎紅潤光滑，呈豌豆粒大??；紅花低、中、高劑量組孕鼠子宮內(nèi)則呈現(xiàn)胚胎少、死胎、淤血甚至是無胚胎等止孕現(xiàn)象，且隨劑量增加越明顯。各組孕鼠止孕情況比較見表1。

表1　各組孕鼠止孕率比較　只

與空白對照組比較，*P<0.05；與紅花低劑量組比較，△P<0.05；與紅花中劑量組比較，#P<0.05

由表1可見，紅花低、中、高劑量組止孕率較空白對照組均明顯升高，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨紅花劑量增加止孕效果越明顯(P<0.05)。

2.2各組孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF表達情況比較VEGF在子宮內(nèi)膜的表達主要定位于腺上皮細胞核及其胞質(zhì)內(nèi)，而在間質(zhì)細胞中的表達則較少，免疫組化后(DAB染色)細胞內(nèi)將出現(xiàn)棕黃色顆粒。本實驗結果顯示，空白對照組子宮內(nèi)膜細胞的細胞質(zhì)和細胞核中均可見明顯的棕黃色沉淀，呈強陽性；而在藥物作用下，紅花低、中、高劑量組孕鼠子宮蛻膜上皮細胞中棕黃色染色強度呈減弱趨勢，紅花高劑量組染色強度最弱。各組孕鼠VEGF子宮內(nèi)膜IOD值比較見表2。

表2　各組孕鼠VEGF子宮內(nèi)膜IOD值比較±s

與對照組比較，*P<0.05

由表2可見，紅花低、中、高劑量組孕鼠VEGF子宮內(nèi)膜IOD值均低于空白對照組，但僅紅花中、高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，紅花低劑量組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3紅花的毒理作用觀察見表3。

由表3可見，紅花低、中、高劑量組灌胃前后體質(zhì)量增長率均低于空白對照組，但僅紅花高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，紅花低、中劑量組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明紅花對小鼠體質(zhì)量增長影響并不明顯，僅高劑量組有一定影響。

表3　紅花的毒理作用觀察　%，±s

與空白對照組比較，*P<0.05

3討論

妊娠時期原始血管的形成主要源于VEGF通過與其特異受體結合促進絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲蛻膜及完成對血管重塑過程[7]。豐富而完善的血管網(wǎng)絡有利于母胎之間正常的物質(zhì)交換，從而促進胚胎正常發(fā)育，因此蛻膜中血管的發(fā)育和形成對正常妊娠有十分重大意義。VEGF信號轉導通路在自然流產(chǎn)的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用，研究表明，早期自然流產(chǎn)患者血清VEGF表達水平降低，而其可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1(sFlt-1)的表達水平則升高，提示VEGF和sFlt-1可能與早期自然流產(chǎn)有關[6]。本實驗研究結果顯示，紅花對各組孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達具有明顯抑制作用，且隨著劑量的增加而抑制作用增強，且其抑制作用可能與有效成分羥基紅花黃色素有關[8-9]。

現(xiàn)代研究顯示，紅花對子宮平滑肌細胞有較強的選擇性興奮作用[10]，小劑量可使離體或在體子宮發(fā)生節(jié)律性收縮，大劑量則容易導致收縮頻率加強，甚至引起痙攣，對妊娠動物的作用尤其明顯，故易引起出血和流產(chǎn)[11-12]。本實驗研究結果表明，紅花低、中、高劑量組均具有明顯的抗早孕作用，且隨著劑量的增加止孕率越高。

另外，本實驗研究結果還發(fā)現(xiàn)，紅花對小鼠體質(zhì)量增加影響不大，且先前研究也證明紅花對紅細胞無溶解作用[13]，故推測一定劑量的紅花對健康影響不大。同時，馬保華等[2]研究發(fā)現(xiàn)，紅花抗早孕治療后，停藥10 d左右實驗動物可自動恢復動情周期，交配生仔，不影響再孕。

綜上所述，紅花能明顯降低孕鼠子宮內(nèi)膜VEGF的表達水平，影響胚胎血管的形成，從而起到抗早孕的作用，且無明顯毒副作用，可考慮在適當劑量范圍內(nèi)擴大臨床計劃生育工作中的應用。

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(本文編輯：石康)

【關鍵詞】紅花；抗早孕；血管內(nèi)皮生長因子；毒理作用

※項目來源：河北省科學技術廳自籌經(jīng)費項目(編號：12272503)

Effect of anti-early pregnancy function of Honghua in early pregnant mice and its effect on vascular endothelial growth factor in endometriumSONGXiaoqing,ANMin,CHENChunhui,etal.DepartmentofNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciencesofHebeiNorthUniversityHebei,Zhangjiakou075000

【Abstract】Objective To effect the anti-early pregnancy function of Honghua in early pregnant mice and its effect on vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometrium, and to observe the toxicological effect. Methods 60 pregnant mice were averagely divided into Honghua low, middle, high dose group and blank control group, 15 mice in each group. Mice in Honghua low, middle, high dose group were received Honghua decoction which equivalent of 1, 3, 5 g/kg of cure drug respectively, via gavage. Mice in blank control group were received equivalent volume distilled water via gavage. Then took another 28 unpregnant female mice which received same grouping method and gavage method as pregnant mice group. The terminating pregnancy condition and the expression of VFGF in endometrium were observed in each pregnant mice group. The increase of body mass was observed in unpregnant group, and the toxicological effect of Honghua was evaluated. Results The terminating pregnancy rates in Honghua low, middle and high dose group was obviously increased as compared with those in blank control group, there were significant differences (P<0.05), and the terminating pregnancy effect increase with dosage of Honghua (P<0.05).The integrated optical density (IOD) of endometrium VEGF in Honghua low, middle and high dose group was lower than that in blank control group, but the statistical difference on IOD only among Honghua middle, high dose group and blank control group (P<0.05), there was no statistical difference on IOD between Honghua low dose group and blank control group (P>0.05). The growth rate of body mass before and after lavage in Honghua low, middle and high dose group was lower than that in blank control group, but the statistical difference on body mass only between Honghua high dose group and blank control group (P<0.05), there was no statistical difference on on body mass among Honghua low, middle dose group and blank control group (P>0.05). Conclusion Honghua can significantly decrease the expression of endometrium VEGF in pregnant mice, affect the formation of embryonic vascular, play a role in anti-early pregnancy and without evident toxic effects.

【Key words】Honghua; Anti-pregnancy; Vascular endothelial growth factor; Toxicological effect

(收稿日期：2014-10-23)

作者簡介：宋小青(1978—)，女，講師，碩士。從事細胞遺傳學研究及教學工作。

【中圖分類號】R715.2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)12-1836-04

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.12.023