許英櫻，段立公，徐 思

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KDR基因多態(tài)性的杰出有氧耐力表型與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的循環(huán)microRNA差異表達(dá)譜的關(guān)聯(lián)研究

許英櫻1，段立公2，徐 思3

目的：分析KDR基因SNP/rs1870377的A/A基因型的杰出有氧耐力表型與訓(xùn)練誘導(dǎo)的循環(huán)miRNA表達(dá)特征的關(guān)聯(lián)。方法：試驗(yàn)對(duì)象為33名現(xiàn)役國(guó)家級(jí)耐力項(xiàng)目男性運(yùn)動(dòng)員和58名體育教育專業(yè)男性大學(xué)生（二級(jí)運(yùn)動(dòng)員），均為漢族。遞增負(fù)荷法檢測(cè)最大攝氧量、個(gè)體乳酸閾；miRNAarray及qRT-PCR檢測(cè)訓(xùn)練誘導(dǎo)的c-miRNA表達(dá)譜，Taqman法解析KDR基因SNP/rs1870377基因型，分析優(yōu)勢(shì)基因型及其杰出耐力表型與訓(xùn)練誘導(dǎo)的c-miRNA表達(dá)特征的關(guān)聯(lián)。結(jié)果：A/A基因型的杰出耐力表型差異表達(dá)17條c-miRNA，9條上調(diào)，8條下調(diào)；miRNA同步調(diào)控AMPK、p53、PPAR、MAPK、mTOR等信號(hào)通路多個(gè)基因表達(dá)。結(jié)論：差異表達(dá)的miRNA的調(diào)控作用同步上調(diào)AMPK-PGC-1α通路和p53通路功能，促進(jìn)線粒體合成和有氧代謝能力，在A/A基因型上調(diào)VEGF通路活性增強(qiáng)心肌/骨骼肌供血條件下進(jìn)一步提高有氧代謝供能效率，對(duì)杰出耐力表型的形成具有促進(jìn)作用；miRNA的調(diào)控作用與rs1870377的A/A基因型的杰出有氧耐力表型存在關(guān)聯(lián)，二者可作為預(yù)測(cè)有氧耐力發(fā)展?jié)摿Φ谋碛^遺傳學(xué)分子標(biāo)記，聯(lián)合應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)選材。

杰出有氧耐力表型；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2；單核苷酸多態(tài)性；運(yùn)動(dòng)應(yīng)激；循環(huán)microRNA

杰出有氧耐力的遺傳優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)基因型及促進(jìn)優(yōu)勢(shì)基因型表型化的基因表達(dá)調(diào)控模式，后者主要是表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制[1]，在訓(xùn)練應(yīng)激誘導(dǎo)下條件性地影響基因型優(yōu)勢(shì)向表型優(yōu)勢(shì)的傳遞[2]。結(jié)合優(yōu)勢(shì)基因型，分析運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控模式與杰出運(yùn)動(dòng)能力表型的關(guān)聯(lián)，可以針對(duì)個(gè)體評(píng)估其是否具有發(fā)展杰出運(yùn)動(dòng)能力的遺傳潛質(zhì)。

KDR基因又稱為VEGFR2，是VEGF調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、遷移和通透性改變等的主要受體，參與調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)耐力性訓(xùn)練的適應(yīng)[3]。KDR基因SNP/rs1870377位于KDR基因第11外顯子上，該位點(diǎn)A-T堿基替換使KDR蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生Gln/His替換，KDR活性發(fā)生上調(diào)[4]，強(qiáng)化了下游通路的作用強(qiáng)度。研究表明，KDR基因SNP/rs1870377與杰出有氧耐力具有顯著關(guān)聯(lián)[4]，可能是發(fā)展有氧耐力的優(yōu)勢(shì)基因，但其有氧耐力表型差異十分顯著[5]，訓(xùn)練應(yīng)激誘導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制對(duì)SNP的作用可能是影響其表型優(yōu)勢(shì)的主要原因。

microRNA（miRNA）通過(guò)多種途徑調(diào)控應(yīng)激適應(yīng)通路中靶基因的表達(dá)，在機(jī)體對(duì)環(huán)境應(yīng)激因素的適應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。應(yīng)激因素誘導(dǎo)miRNAs獨(dú)立表達(dá)，并與靶基因mRNA上的調(diào)控位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合調(diào)節(jié)基因選擇性表達(dá)[7]。miRNAs自身表達(dá)模式具有穩(wěn)定的遺傳性個(gè)體差異，其對(duì)應(yīng)激適應(yīng)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白基因表達(dá)的調(diào)控作用改變了機(jī)體的適應(yīng)方式和敏感性，產(chǎn)生表型差別[8]。

組織內(nèi)miRNAs分泌進(jìn)入血液循環(huán)成為循環(huán)miRNA（circulating miRNA，c-miRNA），具有內(nèi)分泌樣的遠(yuǎn)距離調(diào)控作用。在運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)的不同狀態(tài)下，c-miRNA表達(dá)水平會(huì)發(fā)生特征性改變并與適應(yīng)效果相關(guān)，推測(cè)其可能是機(jī)體應(yīng)答過(guò)程中整合多系統(tǒng)適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵因子[9]。miRNA與c-miRNA在表達(dá)種類和水平上密切相關(guān)，c-miRNA可以作為反映miRNA調(diào)控作用的生物標(biāo)記[10]。

本研究比較耐力項(xiàng)目的現(xiàn)役國(guó)家級(jí)運(yùn)動(dòng)員與體育教育專業(yè)大學(xué)生（中長(zhǎng)跑項(xiàng)目二級(jí)運(yùn)動(dòng)員）的有氧耐力水平與KDR基因SNP/rs1870377基因型分布和運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA表達(dá)譜的差異，分析SNP優(yōu)勢(shì)基因型的杰出有氧耐力表型與運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA表達(dá)特征的關(guān)聯(lián)，探討c-miRNA作為預(yù)測(cè)和評(píng)估杰出有氧耐力的表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)記與SNP聯(lián)合應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)選材的可行性。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

杰出有氧耐力組入選標(biāo)準(zhǔn)參考席翼標(biāo)準(zhǔn)[11]及Μ.A.RIVERA的標(biāo)準(zhǔn)[12]：（1）耐力性項(xiàng)目國(guó)家健將級(jí)以上現(xiàn)役運(yùn)動(dòng)員；（2）未達(dá)到健將級(jí)，但相對(duì)最大攝氧量（R-O2max）＞73 mL/kg·min的現(xiàn)役運(yùn)動(dòng)員。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，杰出有氧耐力組（Elite Endμrance Athlete，EEA組）：33名男性現(xiàn)役運(yùn)動(dòng)員，運(yùn)動(dòng)專項(xiàng)為鐵人三項(xiàng)賽（成都軍區(qū)鐵人三項(xiàng)隊(duì)，17人）和公路自行車（河北省自行車隊(duì)，16人）。一般有氧耐力組入選標(biāo)準(zhǔn)為2010年度當(dāng)年獲得中長(zhǎng)跑二級(jí)運(yùn)動(dòng)員資格的體育教育專業(yè)大學(xué)生。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，一般有氧耐力組（College Student level2，CS2組）：成都體育學(xué)院本科1～3年級(jí)58名男性體育教育專業(yè)大學(xué)生（見表1）。

表1 杰出耐力水平運(yùn)動(dòng)員和普通水平運(yùn)動(dòng)員基本情況表Table1 characteristics of male participants in EEA group and CS2 group

1.2 研究方法

1.2.1 最大攝氧量和個(gè)體乳酸閾測(cè)定 逐級(jí)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)方式測(cè)定最大攝氧量（O2max），使用跑臺(tái)（RUN Μed 700，Technogym，意大利；cosmos pulsar4.0，德國(guó)）和運(yùn)動(dòng)氣體代謝分析儀（CPX，JAEGER；metalyzer，德國(guó)）。受試者測(cè)試前熱身3 min，正式試驗(yàn)采用預(yù)設(shè)的Bruce方案，即每3 min增加速度或坡度直至力竭，通氣數(shù)據(jù)由氣體代謝分析儀自動(dòng)采集。同步檢測(cè)個(gè)體乳酸閾（ILT），分別取安靜狀態(tài)下，每級(jí)負(fù)荷后即刻，恢復(fù)期第2、5、8、10、15 min血樣測(cè)定血乳酸值；取中指指尖血20 μL，采用YSI1500便攜式血乳酸自動(dòng)分析儀測(cè)定血乳酸值；采用Stegmann方法判定ILT[13]。

1.2.2 KDR基因SNP/rs1870377基因型解析 取靜脈血2 mL，EDTA抗凝，OΜEGA公司全血總DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA，要求純度為OD260/OD280=1.8～2.0。采用rs1870377 TaqΜan SNP檢測(cè)試劑盒（TaqΜan SNP Genotype Assay Cat# 4351379），按照說(shuō)明書配制反應(yīng)體系及設(shè)定參數(shù)。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2X Genotyping Μaster mix，12.5 μL；20X SNP kit（Probe/Primer mix）5 μL；DNA（20 ng/μL）；ddH2O。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃10 min，（95℃15 s，60℃1 min）×40個(gè)循環(huán)。7900HT型高通量（ABI公司）實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，SDS2.2.1軟件分析基因分型結(jié)果。

1.2.3 運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA及其相對(duì)表達(dá)量測(cè)定O2max測(cè)試前及測(cè)試后1 h內(nèi)分別取靜脈血5 mL（EDTA抗凝）測(cè)定c-miRNA相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算表達(dá)量變化倍率（fold change），參照Davidsen運(yùn)動(dòng)應(yīng)激調(diào)控的c-miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)[15]：fold change＞1.5或＜0.67的c-miRNA即為運(yùn)動(dòng)應(yīng)激調(diào)控的c-miRNA。

（1）血漿總RNA提取。TRIZOL法提取血漿總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度和濃度，OD260/280＞1.9說(shuō)明提取的總RNA純度較好，甲醛變性瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的RNA完整性較好，沒(méi)有發(fā)生降解。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證差異表達(dá)c-miRNA相對(duì)表達(dá)量。c-miRNA莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物由北京六合華大基因公司合成，20 μL反應(yīng)體系（5×First Strand synthesis Buffer，4 μL；dNTPmix1μl；RNase Inhibitor，40 units；ReverseTranscriptase（Μ-ΜLV），1 μL；Stem-loop RTPrimer，1 μL；Total RNA500 ng；RNase-free ddH2O）。65℃加熱5 min，放入冰中2 min，放置PCR儀16℃熱激30 min，42℃60 min，85℃5 min，停止反轉(zhuǎn)錄。

qRT-PCR檢測(cè)c-miRNA表達(dá)水平，miRNA定量引物由北京六合華大基因公司合成，反應(yīng)體系按照SYBR?Premix Ex TaqTΜⅡ（Perfect Real Time）說(shuō)明書進(jìn)行配置。使用Bio-Rad iCycler PCR System進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，程序：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，40cycle，以上循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行65℃～95℃的融解曲線分析。每個(gè)樣品平行3次，溶解曲線為單一峰（見圖1），按照2-ΔΔCt計(jì)算樣品的相對(duì)表達(dá)豐度。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)c-miRNA的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。Figure1 Kinetic curves of c-miRNA Gene qRT-PCR amplification.

1.2.4 差異表達(dá)的c-miRNA的篩選和生物信息學(xué)分析 比較EEA組和CS2組的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA表達(dá)變化率，以組間差異在1.5倍以上的c-miRNA作為差異表達(dá)的c-miRNA。利用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)、miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因，取交集作為靶基因集合。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和IPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因集合進(jìn)行GO分析和pathway分析（見圖1）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測(cè)和各基因型組間分布采用R*C列聯(lián)表X2檢驗(yàn)。各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)均采用M±SD表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析采用Bivariate過(guò)程，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)并用r表示。

2 結(jié)果

EEA組和CS2組受試者群體rs1870377基因型分布頻率卡方檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05），該群體具有代表性。

2.1 KDR基因SNP/rs1870377基因型在EEA組和CS2組的分布頻率比較

KDR基因SNP/rs1870377基因型的分布頻率在EEA組和CS2組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且A/A基因型與杰出有氧耐力表型的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 KDR基因SNP/rs1870377基因型分布頻率比較/%Table2 Comparison of genotypic frequencies of rs1870377 between EEA group and CS2 group/%

2.2 EEA組和CS2組各基因型有氧耐力指標(biāo)的比較

表3 EEA組和CS2組各基因型有氧耐力指標(biāo)的比較Table3 Comparison of the aerobic capacity values by rs1870377 genotypes between EEA group and CS2 group

2.3 A/A基因型杰出耐力表型差異表達(dá)的c-miRNA及其靶基因富集通路分析

2.3.1 A/A基因型杰出耐力表型差異表達(dá)的c-miRNA 與CS2組相比，A/A基因型EEA組差異表達(dá)38條c-miRNA，其中表達(dá)水平變化率超過(guò)2.0的有17條，9條上調(diào)，8條下調(diào)（見表4）。

表4 A/A基因型杰出耐力表型差異表達(dá)的c-miRNATable4 Differential expressed c-miRNAs of A/A genotype

2.3.2 差異表達(dá)的c-miRNA的表達(dá)量變化與有氧耐力指標(biāo)的相關(guān)性分析 計(jì)算各差異表達(dá)的c-miRNA相對(duì)表達(dá)量變化倍率與O2max及ILT的Pearson系數(shù)。結(jié)果顯示，A/A基因型O2max水平與c-miRNA-34a和c-miR-146a顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是r=0.884（P＜0.01）和0.800（P＜0.01）（見圖2）。

圖2 KDR基因SNP/rs1870377的A/A基因型O2max與c-miR34a及c-miR146a的相關(guān)性分析Figure2 Alterations in c-miR34a and c-miR146a directly correlate with changes inO2maxof A/A genotype

3 討 論

本研究分析了KDR基因SNP/rs1870377的優(yōu)勢(shì)基因型，并比較了具有相同SNP優(yōu)勢(shì)基因型的杰出耐力表型與一般耐力表型的運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA的表達(dá)譜差異。結(jié)果表明：A/ A基因型可能是rs1870377的有氧耐力優(yōu)勢(shì)基因型，其杰出耐力表型差異表達(dá)17條c-miRNA，9條上調(diào)，8條下調(diào)。多數(shù)據(jù)庫(kù)交叉預(yù)測(cè)靶基因并進(jìn)行GO分析和pathway分析表明，差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控的靶基因功能富集通路以及miRNA對(duì)上述信號(hào)通路的調(diào)控作用與SNP引起的KDR基因功能改變有關(guān)，其調(diào)控作用特征支持EEA組的高水平O2max和ILT的形成。運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA差異表達(dá)譜可以作為杰出有氧耐力相關(guān)的表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)記與KDR基因SNP/rs1870377基因型分析聯(lián)合應(yīng)用于遺傳選材。

I.I.AHΜETOV等[4]將471名男性運(yùn)動(dòng)員根據(jù)所從事項(xiàng)目的有氧耐力主導(dǎo)水平分為4組，對(duì)照群體為603名健康人，比較KDR基因rs1870377各基因型在不同耐力水平項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員群體及健康人群體之間的分布差異。分析各基因型與有氧耐力水平差異的關(guān)聯(lián)性發(fā)現(xiàn)，472Gln等位基因在男性耐力運(yùn)動(dòng)員群體中的分布頻率顯著高于對(duì)照組（36.8%vs27.4%，P=0.000 6），而且Gln/Gln基因型在23名杰出有氧耐力運(yùn)動(dòng)員中分布頻率顯著高于其他耐力水平運(yùn)動(dòng)員及對(duì)照組。12名女運(yùn)動(dòng)員中，攜472Gln等位基因者的相對(duì)O2max（mL/min/kg）顯著高于His/His基因型者。對(duì)23名滑雪運(yùn)動(dòng)員及45名健康人進(jìn)行肌肉活檢發(fā)現(xiàn)，472Gln等位基因攜帶者慢肌百分比含量在運(yùn)動(dòng)員及對(duì)照組中均顯著高于His/His攜帶者，證明A基因型與較高的慢肌纖維比例表型存在關(guān)聯(lián)。聶晶等[5]分析了KDR基因rs1870377各基因型與102名中國(guó)北方漢族男子18周長(zhǎng)跑訓(xùn)練前后的O2max，以及12 km/h跑速下的RE和心室結(jié)構(gòu)功能指標(biāo)變化差異的關(guān)聯(lián)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，A/T、A/A基因型者在部分心室結(jié)構(gòu)和/或功能指標(biāo)均表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性變化，有助于增強(qiáng)心臟泵功能。上述研究結(jié)果均提示，KDR基因SNP/rs1870377的A基因型與較強(qiáng)的有氧運(yùn)動(dòng)能力存在關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示：A/A基因型在EEA組的分布頻率顯著高于CS2組；CS2組A/A基因型攜帶者的O2max顯著高于T/T基因型，與前二項(xiàng)研究的結(jié)論一致。VEGF與KDR結(jié)合，通過(guò)PI3K-Akt-eNOS途徑和花生四烯酸代謝途徑調(diào)控呼吸道和毛細(xì)血管平滑肌舒張及內(nèi)皮細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管增生[3]，促進(jìn)肺通氣和肌組織血液灌流，提高心肌/骨骼肌內(nèi)氧彌散水平，增強(qiáng)有氧能力，是運(yùn)動(dòng)性適應(yīng)的重要機(jī)制。rs1870377位點(diǎn)A-T堿基替換使KDR蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生Gln/His替換，KDR活性發(fā)生上調(diào)[4]，增強(qiáng)了VEGF與KDR結(jié)合后對(duì)下游PI3K-Akt-eNOS途徑和花生四烯酸代謝途徑的激活水平，促進(jìn)肺通氣和肌組織血液灌流，提高心肌/骨骼肌內(nèi)氧彌散水平，增加動(dòng)靜脈氧差，提高O2max水平。CS2組A/A基因型O2max水平顯著高于其他基因型，可能是Gln/Gln增強(qiáng)KDR功能的效應(yīng)。E.T.HOWLEY等[16]研究表明，O2max在初始階段與成績(jī)提高有平行關(guān)系，而在高水平運(yùn)動(dòng)群體則不存在這種平行關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，EEA組O2max水平在rs1870377各基因型間沒(méi)有顯著差異，與E.T.HOWLEY等的研究結(jié)果一致。推測(cè)其原因可能是，優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期刻苦訓(xùn)練，自身遺傳優(yōu)勢(shì)已發(fā)揮到極限，亞極限負(fù)荷下機(jī)體氧利用效率取代O2max成為影響有氧運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)鍵因素[11]。

GO分析和pathway分析結(jié)果表明，A/A基因型的杰出耐力表型差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控的靶基因主要富集于AΜPK信號(hào)通路、p53通路、p38-ΜAPK通路和mTOR通路（見表5），不同程度地增強(qiáng)以上通路對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練應(yīng)激的敏感性。miRNA調(diào)控作用特征分析表明，AΜPK-PGC-1α通路和p53通路活性同步上調(diào)，這一特征與rs1870377引起的KDR基因功能變化存在關(guān)聯(lián)，可能是促進(jìn)KDR基因SNP/rs1870377的A/A基因型的杰出耐力形成的重要調(diào)控特征。

表5 A/A基因型杰出耐力表型差異表達(dá)的miRNA調(diào)控的靶基因及其富集的信號(hào)通路Table5 The target genes and their enriched pathway of differential expressed c-miRNAs of A/A genotype in EEA group

靶基因分析顯示，A/A基因型差異表達(dá)的miRNA調(diào)控的靶基因包含幾乎全部AΜPK-p38-PGC-1α通路和p53通路的關(guān)鍵調(diào)控基因（見表5）。TAK1（AΜPKK）、STRAD、AΜPK、p38、CREB、ERR和SIRT1是AΜPK-p38-PGC-1α通路的核心功能蛋白，p53、SCO1和ATΜ是p53通路核心功能蛋白，TFAΜ、TFB1/ 2Μ、NFAT、ACO、LPL和RXR是PGC-1α調(diào)控線粒體合成與脂代謝的重要功能基因，下調(diào)miR-24、miR-141、miR-26a、miR-23、miR-214、miR-485和miR-30同時(shí)促進(jìn)以上基因的表達(dá)。PP2C/ PP2CA是AΜPK和p38的共同抑制因子，PTP抑制p38途徑活化，ΜBP是PGC-1的阻遏因子，SUΜO2/3促進(jìn)PGC-1的泛素化降解，ΜDΜ2是p53途徑的抑制因子，ACC和HDAC是AΜPK-PGC-1α通路功能抑制因子，上調(diào)miR-181、miR-34a、miR-101、miR-155、miR-144和miR-494均同步抑制上述基因表達(dá)。研究表明：miR-149抑制PARP-2，促進(jìn)SIRT1-PGC-1α通路活性和線粒體合成[17]；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)miR-181表達(dá)水平增高，與線粒體有氧代謝能力增強(qiáng)存在關(guān)聯(lián)[18]；上調(diào)miR-696表達(dá)促進(jìn)PGC-1α通路活性[19]；下調(diào)miR-378[20]和miR-23[18]，可以促進(jìn)PGC-1α通路活性及其下游ALAS1、CS、CytC等的表達(dá)；miR-144同步激活A(yù)ΜPK和TIGAR[21-22]；miR-34a是p53調(diào)控糖代謝的主要分子[23]和p53激活分子標(biāo)志[24]。綜合分析上述miRNA的調(diào)控作用提示，A/A基因型杰出耐力表型的AΜPK-PGC-1α通路和p53通路的活性同步上調(diào)。A/A基因型杰出耐力表型的調(diào)控特征與rs1870377引起的KDR基因功能改變存在關(guān)聯(lián)，并且對(duì)其杰出耐力表型的形成具有促進(jìn)作用。rs1870377使KDR活性增強(qiáng)，促進(jìn)肺通氣和肌組織血液灌流，提高心肌/骨骼肌供氧水平。在供氧充分的條件下，線粒體脂肪酸β氧化代謝能力成為發(fā)展有氧耐力水平的限制因素。

PGC-1α是運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體合成及其活性增強(qiáng)的主要調(diào)控因子[25]。AΜPK促進(jìn)NRF1/2表達(dá)，并通過(guò)p38-ΜAPK活化PGC-1α，PGC-1α協(xié)同NFR1/2共同促進(jìn)TFAΜ、TFB1Μ和TFB2Μ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[26]。TFAΜ啟動(dòng)mtDNA的復(fù)制并保護(hù)其免受ROS的損傷，PGC-1α和NRF1/2還啟動(dòng)線粒體合成與代謝相關(guān)基因的復(fù)制，使線粒體蛋白質(zhì)與脂質(zhì)比例增高，促進(jìn)線粒體生物合成與功能上調(diào)[27]。同時(shí)，PGC-1α調(diào)控PPARα/δ，促進(jìn)脂肪酸β氧化和慢肌纖維特異蛋白的表達(dá)，提高心肌骨骼肌有氧工作能力[19，28]。miRNA調(diào)控AΜPK-p38-PGC-1通路活性上調(diào)促進(jìn)心肌骨骼肌有氧代謝機(jī)能重塑，使心肌骨骼肌工作能力與A/ A基因型提高了的供氧能力匹配，最大限度發(fā)揮心肌骨骼肌的生物機(jī)械效能。

p53通路的同步激活對(duì)于提高線粒體脂肪酸β氧化代謝能力十分重要[29]，KDR-PI3K-Akt通路顯著促進(jìn)無(wú)氧酵解功能[30]。在不缺氧的條件下，糖酵解是不經(jīng)濟(jì)的供能方式，葡萄糖氧化供能不僅消耗糖原儲(chǔ)備，還抑制脂肪酸β氧化，不利于心肌/骨骼肌維持和增強(qiáng)有氧工作能力。p53通路是平衡糖代謝和脂代謝的重要調(diào)控途徑，p53誘導(dǎo)TIGAR表達(dá)[31]，抑制葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑，將糖代謝導(dǎo)向戊糖磷酸旁路。由于糖酵解是葡萄糖有氧氧化的必經(jīng)步驟，p53從底物選擇的水平促進(jìn)線粒體脂肪酸β氧化供能[32]。

c-miRNA-34a和c-miR-146a與A/A基因型的O2max水平顯著相關(guān)，說(shuō)明miR34a與miR-146a在A/A基因型的杰出有氧耐力形成中發(fā)揮重要的作用。miR34a是p53通路激活的分子標(biāo)志，miR-146a上調(diào)抑制PP2C/PP2CA、SUΜO2/3和ΜBP的基因表達(dá)，促進(jìn)AΜPK-p38-PGC-1α途徑的活性。A.L.BAGGISH等[10]發(fā)現(xiàn)，c-miR-146a表達(dá)水平與O2max正相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。這2個(gè)c-miRNA的表達(dá)特征進(jìn)一步說(shuō)明，AΜPK-p38-PGC-1α通路與p53通路的活性協(xié)同上調(diào)對(duì)A/A基因型的杰出有氧耐力表型形成的重要性。

miRNA是唯一參與應(yīng)激應(yīng)答調(diào)控的表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控機(jī)制，其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用改變了適應(yīng)性基因表達(dá)的時(shí)序特征和作用強(qiáng)度。c-miRNA整合多系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控，對(duì)機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)的系統(tǒng)協(xié)調(diào)性具有重要作用。目前對(duì)于c-miRNA的外泌組織和靶組織缺乏了解[7]，因此，本研究分析應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA表達(dá)水平變化可以了解其對(duì)應(yīng)的miRNA的綜合表達(dá)變化情況及其與杰出有氧耐力表型的關(guān)聯(lián)，但無(wú)法針對(duì)具體靶器官做進(jìn)一步深入的功能性解讀。同時(shí)，本研究在研究對(duì)象數(shù)量、性別構(gòu)成等方面存在局限性，研究結(jié)果還需要在更廣泛的樣本群體中進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

KDR基因SNP/rs1870377的A/A基因型可能是發(fā)展有氧耐力的優(yōu)勢(shì)基因型，其杰出耐力表型在訓(xùn)練應(yīng)激誘導(dǎo)下差異表達(dá)17條c-miRNA，其調(diào)控作用特征與rs1870377引起的KDR基因的功能改變有關(guān)聯(lián)，對(duì)杰出耐力表型的形成具有促進(jìn)作用。運(yùn)動(dòng)應(yīng)激誘導(dǎo)的c-miRNA差異表達(dá)譜可以作為杰出有氧耐力相關(guān)的表觀遺傳學(xué)分子標(biāo)記，與KDR基因SNP/rs1870377基因型分析聯(lián)合應(yīng)用于遺傳選材。

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Relationship of Elite Endurance Phenotype of KDR Gene Polymorphism with Exercise Induced Circulating Mi?croRNAProfile

XU Yingying1，DUAN Ligong2，XU Si3
（1.School of PE，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China；2.Sport Hospital，China Institute of Sports Medicine，Beijing 100061，China；3.Sichuan Academy of Medical Sciences and Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610031，China）

Objective：To explore the correlation between the Elite endurance phenotype of A/A genotype of KDR gene rs1870377 and the differential expression profile of c-miRNA induced by exercise.Method：33 active elite athletes（national grade）and 58 student athletes（grade 2）were engaged in this test.O2maxand ILT were measured.rs1870377 of KDR gene and differential expression profile of c-miRNAs induced by exercise were detected.Targetscan，mi-Randa，and miRBase were used to predict target genes of those miRNAs，and pathway analysis was performed for target gene by KEGG and IPA.Results：There were 17 c-miRNAs which regulated the pathway of AMPK，p53，PPAR，MAPK，mTOR，and their regulating characters were related to the functions of KDR enhanced by A/A genotype，which were validated to promote the formation of the elite endurance.Conclusions：Cooperated with rs1870377，the profile of c-miRNAs induced by exercise can be used as a biomarker on forecasting and valuing the potential of aerobic endurance.

elite endurance phenotype；KDR gene；single nucleotide polymorphism；exercise stress；circulating microRNA

G 804.2

：A

：1005-0000（2015）02-121-06

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2015.02.006

2014-12-25；

2015-02-16；錄用日期：2015-02-17

國(guó)家科技攻關(guān)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2005BA904）

許英櫻（1980-），女，河南洛陽(yáng)人，講師，研究方向?yàn)轶w育教育與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的分子生物學(xué)機(jī)制。

1.四川師范大學(xué)體育學(xué)院，四川成都610100；2.國(guó)家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所體育醫(yī)院，北京100061；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院，四川成都610031。