趙曉琴，孫君志，白勝超，李俊平，周 越，王瑞元

●成果報告 Original Articles

離心運動誘導大鼠骨骼肌損傷中絲氨酸蛋白酶Omi的表達升高

趙曉琴1，孫君志2，白勝超3，李俊平3，周 越3，王瑞元3

目的：旨在觀察離心運動致骨骼肌損傷后絲氨酸蛋白酶（Omi）在骨骼肌組織中的表達變化。方法：8周齡雄性SD大鼠36只，隨機分為安靜對照（n=6）、離心運動2大組（n=30），離心運動組大鼠在跑臺上進行一次性離心運動，分別于運動后即刻（E0組，n=6）、運動后12 h（E12組，n=6）、運動后24 h（E24組，n=6）、運動后48 h（E48組，n=6）和運動后72 h（E72組，n=6）麻醉大鼠，腹主動脈取血，取比目魚肌待測；使用熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Caspase-3）的活性；Western Blot和Realtime-PCR法分別檢測Omi、凋亡抑制蛋白（XIAP）的蛋白表達和基因水平；Co-IP法檢測XIAP和Omi的相互結合作用。結果：與對照組相比，離心運動后Caspase-3、Caspase-9活性均明顯升高；離心運動后Omi、XIAP的蛋白表達和mRNA水平均明顯升高；離心運動能明顯增加XIAP和Omi的結合量。結論：離心運動能夠激活骨骼肌組織Caspase-9和Caspase-3的活性，誘導Omi和XIAP的表達上調(diào)，促進XIAP與Omi相互結合，Omi可能在促使凋亡過程中發(fā)揮重要介導作用。

離心運動；骨骼?。患毎蛲?；Omi；XIAP

運動性骨骼肌損傷一直以來都是運動醫(yī)學和運動生理學研究的重點課題。在運動性骨骼肌損傷中，離心收縮較等長收縮引起的損傷更為嚴重。前期研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，離心運動可以導致骨骼肌線粒體形態(tài)結構異常，細胞色素c和Smac蛋白表達顯著上調(diào)，Caspase-3活性顯著升高，同時啟動線粒體凋亡程序。線粒體途徑導致細胞凋亡的關鍵所在是由于其各種促凋亡蛋白的釋放[3]。絲氨酸蛋白酶Omi是新發(fā)現(xiàn)的一種線粒體促凋亡蛋白，在組織器官中普遍表達[4]。正常生理情況下，Omi存在于線粒體膜間隙中，只有應激刺激使線粒體膜通透性增加時，Omi才會被釋放入胞漿并發(fā)揮其包括促凋亡在內(nèi)的生物介導作用。

運動性骨骼肌損傷時，會伴有大量線粒體促凋亡蛋白釋放入胞漿，與細胞色素c和Smac類似，推測Omi作為作用較強的線粒體促凋亡蛋白，可能參與了運動性骨骼肌損傷的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究通過建立大鼠運動性骨骼肌損傷模型，探討運動對骨骼肌細胞凋亡程度及凋亡途徑的影響，并以線粒體促凋亡蛋白Omi為切入點，觀察運動后骨骼肌組織中Omi的表達變化，并對Omi-XIAP-Caspases通路進行分析，同時探究其在運動性骨骼肌損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Ac-DEVD-AFC底物（#ALX-260-032）、Ac-LEHD-AFC底物（#ALX-260-116）和AFC標準品（#BΜL-K108-0001）均購自BIOΜOL公司；小鼠抗Omi抗體（#sc-271528）購自Santa Cruz公司；兔抗XIAP抗體（#2042）購自Cell Signaling公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG（#ZB-2305）和HRP標記山羊抗兔IgG（#ZB-2301）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RNAisoTΜPlus（#D9108A）、SYBR Premix Ex TaqTΜII（#DRR081A）、PrimeScriptTΜRT reagent Kit（#RR037A）、Omi引物和XIAP引物均購自TaKaRa公司。

EnSpireII2 300 Μultilabel酶標儀，Reader Perkin Elmer公司；BIO-RAD電泳儀和ChemiDocTΜXRS凝膠成像，美國BIO-RAD公司；7 500 Real Time PCR儀，美國Life Technologies公司。

1.2 實驗動物

8 周齡健康雄性SD大鼠36只，體重為（199.27±6.85）g，SPF/ VAF級，許可證編號：SCXK（京）2009-0007，由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所動物中心提供。6只/籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，室溫（22±2）℃，相對濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗模擬晝夜交替。大鼠適應性飼養(yǎng)3天后，進行后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組及運動方案

大鼠隨機分為2大組：對照組（C組，n=6）和離心運動組（E組，n=30）。離心運動組大鼠按照運動后的不同時間，又被隨機分為運動后即刻組（E0組，n=6）、運動后12 h組（E12組，n=6）、運動后24 h組（E24組，n=6）、運動后48 h組（E48組，n=6）和運動后72 h組（E72組，n=6）。

在正式實驗前，運動組大鼠進行3天速度為16 m/min的適應性跑臺運動。第1天進行5 min的跑臺運動，坡度0°；第2天進行10 min的跑臺運動，坡度0°；第3天休息；第4天進行90 min的正式實驗，坡度-16°。

1.4 標本收集

于上述不同時間點分批麻醉大鼠，腹主動脈取血，迅速分離比目魚肌，去除兩側肌腱和結締組織。取材過程中，盡量避免牽拉肌肉。將分離好的比目魚肌小心裝入凍存管后，立即投入液氮速凍，之后再移至-80℃冰箱待測。

1.5 大鼠骨骼肌Caspase-3和Caspase-9的檢測

測定Caspase-3和Caspase-9活性可以反應骨骼肌細胞凋亡發(fā)生的程度以及線粒體凋亡途徑[5]?；静襟E如下：將骨骼肌按1∶10加入裂解液，于冰上剪碎，勻漿，14 000 rpm，4oC離心后取上清液。在黑色避光酶標板中分別加入上清30 μL，2×Reaction buffer 50 μL，雙蒸水10 μL，底物，混勻。置于熒光酶標儀中連續(xù)檢測其光密度值，參數(shù)為405 nm，37oC，1.5 h。Caspases活性結果用單位時間內(nèi)骨骼肌組織蛋白分解底物產(chǎn)生AFC的速度表示，計算公式為[AFC（1.5 h）-AFC（0 h）]/蛋白濃度/1.5 h，單位為nmol/h/mg。其中，Caspase-3和Caspase-9的底物分別是Ac-DEVD-AFC和Ac-LEHD-AFC。

1.6 大鼠骨骼肌Omi和XIAP蛋白表達檢測

常規(guī)提取并測定骨骼肌組織蛋白濃度后，調(diào)整樣品體積為20 μL/孔，蛋白濃度為3 μg/μL。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白（10%分離膠和4%濃縮膠），將蛋白采用濕轉法轉至PVDF膜上（恒流300 mA，90 min），常規(guī)經(jīng)封閉、一抗（Omi：1∶100；XIAP：1∶1 000）、二抗孵育后，加化學發(fā)光液，之后通過凝膠成像系統(tǒng)顯像，采用Gel-pro軟件分析條帶密度。

1.7 大鼠骨骼肌Omi和XIAP mRNA水平檢測[6]

將骨骼肌組織加入RNAisoTΜPlus裂解液提取RNA，合成cDNA使用PrimeScriptTΜRT reagent試劑盒，參數(shù)為37oC15 min，85oC5 s。SYBR Premix Ex TaqTΜⅡ試劑檢測Real-time PCR，在7 500 Real Time PCR儀上進行逆轉錄，參數(shù)如下。預變性：95oC30 s；PCR反應：95oC5 s，60oC32 s，30 cycle；熔解曲線參數(shù)：95oC15s，60oC1min，95oC15s，60oC15s（Omi：NΜ_001106599.2，GAPDH：NΜ_017008.3），2-△△Ct法進行相對定量分析。

1.8 大鼠骨骼肌XIAP和Omi相互結合量檢測

將裂解的骨骼肌組織以14 000 rpm離心15 min，提取上清，以一個樣本為例，在500 μg蛋白樣品中，加入1 μg的mouse IgG及20 μL的Agarose A/G，4oC搖轉儀上反應30 min去除非特異性結合。1 000 rpm 4oC離心5 min，取上清，加入Omi抗體2 μg/ 500 μg蛋白，于4oC搖轉儀孵育過夜。1 000 rpm 4oC離心5 min，棄上清，再用裂解液洗滌beads，4oC離心棄上清，重復3次。洗滌后，再次加入2×loading buffer 15 μL，95℃5 min。12 000 rpm離心5 min，取上清進行Western Blot實驗。本研究用免疫共沉淀方法檢測XIAP與Omi的相互結合。

1.9 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS18.0軟件，結果以平均值±標準差表示，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析實驗數(shù)據(jù)，結果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨骼肌細胞凋亡情況

Caspases活化是普遍公認的細胞凋亡的生化學特征之一。實驗結果顯示，大鼠骨骼肌組織Caspase-3活性與C組相比，在運動后即刻、12 h、24 h、48 h顯著升高，且運動后12 h達到最高峰，驗證了離心運動可以誘發(fā)骨骼肌細胞凋亡（見圖1）。

圖1 大鼠骨骼肌組織Caspase-3活性變化Figure1 Changes of Caspase-3 activity in skeletal tissue

2.2 骨骼肌線粒體凋亡途徑

Caspase-9的活性結果顯示，大鼠骨骼肌組織Caspase-9活性與C組相比，在運動后即刻即有升高趨勢但無顯著差異，運動后12 h、24 h、48 h顯著升高，72 h已恢復至C組水平，且在運動后12 h達到最高峰（見圖2）。提示，線粒體凋亡途經(jīng)參與了骨骼肌的細胞凋亡。

圖2 大鼠骨骼肌Caspase-9活性變化Figure2 Changes of Caspase-9 activity in skeletal tissue

2.3 骨骼肌組織Omi的蛋白表達和mRNA水平變化

用Western blot和Realtime-PCR方法分別檢測正常和運動組大鼠骨骼肌組織Omi的蛋白表達和mRNA水平。結果顯示，與C組相比，Omi的蛋白表達和mRNA水平運動后即刻至48 h顯著升高，且均在12 h達到最高峰（見圖3、圖4）。提示，離心運動可以誘導骨骼肌組織Omi蛋白表達和基因水平上調(diào)。

圖3 大鼠骨骼肌組織Omi蛋白表達變化Figure3 Changes of Omi protein in skeletal tissue

圖4 大鼠骨骼肌組織Omi mRNA水平變化Figure4 Changes of Omi mRNA in skeletal tissue

2.4 骨骼肌組織XIAP的蛋白表達和mRNA水平變化

大鼠骨骼肌組織XIAP的檢測結果顯示，與C組相比，運動后即刻至72 h全程XIAP的蛋白表達顯著升高，并在48 h達到最高峰（見圖5）。提示，離心運動可以誘導骨骼肌組織XIAP蛋白表達上調(diào)。與C組相比，運動后12 h、24 h和48 h，XIAP的mRNA水平顯著升高，也在24 h到達最高峰（見圖6）。提示，離心運動可以誘導骨骼肌組織XIAP基因水平上調(diào)。

圖5 大鼠骨骼肌組織XIAP蛋白表達變化Figure5 Changes of XIAP protein in skeletal tissue

圖6 大鼠骨骼肌組織XIAP mRNA水平變化Figure6 Changes of XIAP mRNA in skeletal tissue

2.5 骨骼肌組織XIAP和Omi結合量變化

用免疫共沉淀方法檢測大鼠骨骼肌組織XIAP和Omi的結合量變化。結果顯示，離心運動后各個時間點XIAP和Omi結合量均明顯高于C組，在運動后24 h達到最高峰（見圖7）。提示，離心運動可以使骨骼肌組織XIAP和Omi相互結合程度增加。

圖7 大鼠骨骼肌組織XIAP/Omi結合量變化Figure7 Changes of XIAP/Omi complex in skeletal tissue

3 討論

3.1 一次性離心運動后骨骼肌細胞凋亡的變化

在運動性骨骼肌損傷過程中，運動強度、運動形式及運動時間直接影響骨骼肌細胞凋亡的發(fā)生程度[7-9]，提示細胞凋亡可能在運動性骨骼肌損傷中起重要作用。盡管本文缺少肌肉凋亡的直接證據(jù)，但研究證實，離心運動可以導致骨骼肌凋亡[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，一次性離心運動可以導致骨骼肌組織細胞色素c和Smac蛋白表達顯著上調(diào)，提示有細胞凋亡的發(fā)生。因此認為，本研究的一次性離心運動誘導的骨骼肌損傷模型中，Caspase-3活化可以反映細胞凋亡發(fā)生的程度，Caspase-9活性反映骨骼肌線粒體凋亡途徑。本實驗中，選擇離心運動最容易損傷的慢?。ū饶眶~?。┳鳛橛^察對象。結果顯示，大鼠一次性離心運動后骨骼肌組織Caspase-3活性在運動后即刻明顯升高，運動后12 h升至最高，此時Caspase-3活性高于安靜對照組68.7%，直至運動后72 h才趨于正常。提示，一次性離心運動后即刻可誘發(fā)骨骼肌細胞凋亡，且凋亡發(fā)生的程度具有時間依賴性，離心運動后12 h細胞凋亡的程度最為明顯，之后至運動后72 h凋亡的程度逐漸恢復。運動性骨骼肌損傷的又一誘因可能是細胞凋亡。

細胞凋亡的調(diào)控器是線粒體，其功能的正常發(fā)揮依賴于其膜結構的穩(wěn)定。前期研究顯示[1]，一次離心運動可以導致骨骼肌線粒體結構發(fā)生病理性變化，顯著上調(diào)VDAC（線粒體通透性轉換孔的組成蛋白之一）的蛋白表達，同時能使Cyt c蛋白表達一過性升高。提示，離心運動可能通過線粒體途徑引起骨骼肌細胞凋亡。反應線粒體凋亡途徑的結果顯示，Caspase-9在離心運動后也明顯升高，在運動后即刻即有升高趨勢，12 h明顯升至最高，之后呈進行性下降。該結果提示，離心運動引起骨骼肌細胞凋亡可能有線粒體凋亡途徑的參與。

3.2 一次性離心運動對骨骼肌Omi表達的影響

絲氨酸蛋白酶Omi（又稱HtrA2）主要定位于真核生物線粒體中，隸屬于HtrA（High Temperature Requirement）家族。Omi被認為是位于線粒體內(nèi)作用較強的促凋亡蛋白，在應激時Omi被釋放入胞漿，發(fā)揮其依賴Caspases的促凋亡效應[11]。但是，與其他線粒體促凋亡蛋白（如細胞色素C、Smac等）不同的是，Omi還能通過自身的絲氨酸蛋白酶活性，發(fā)揮非依賴Caspases的促凋亡效應[12]。目前，有關Omi促進細胞凋亡的研究大多在腫瘤[13-14]、心肌[5]、腦[15]組織，而在骨骼肌中鮮有報道。

本實驗顯示，Omi蛋白表達在一次性離心運動后即刻明顯升高，12 h升至最高，之后至72 h逐漸恢復到安靜對照組水平。而大鼠骨骼肌組織Omi的mRNA水平結果顯示，離心運動后骨骼肌Omi mRNA水平與其蛋白表達趨勢相近。Omi mRNA水平在運動后即刻明顯升高，24 h達到最高峰，72 h已恢復到安靜對照水平。以上結果提示，Omi在運動后大鼠骨骼肌組織中的表達，在蛋白水平和翻譯水平均明顯升高，也具有時間依賴性。鑒于Omi的促凋亡作用，推測Omi參與了離心運動致骨骼肌細胞凋亡的病理生理過程，Omi在運動后早期可能起到促進骨骼肌細胞凋亡的作用。同時發(fā)現(xiàn)，Omi的蛋白表達和mRNA水平趨勢存在一些差異，Omi的蛋白表達則在運動后12 h升至最高，而其mRNA水平在24 h達到最高峰，其原因可能是Omi受到其他抑凋亡蛋白的調(diào)節(jié)。

3.3 一次性離心運動對骨骼肌XIAP表達的影響

凋亡抑制蛋白家族是位于細胞內(nèi)的一系列獨特抗凋亡蛋白，其中X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是目前發(fā)現(xiàn)最具特征性的、作用最強的凋亡抑制蛋白，它可以通過BIR2及BIR3結構域抑制Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的活性，以及RING鋅指結構域泛素降解Caspase等多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用[16]。XIAP被認為是作用最強的內(nèi)源性Caspases抑制因子。細胞中，XIAP主要受到2種線粒體促凋亡蛋白的調(diào)節(jié)，分別是Smac和Omi。生理情況下，這2種蛋白都位于線粒體中，并且隨著凋亡的發(fā)生由線粒體轉位至胞漿，在胞漿中抑制XIAP，促進Caspases依賴的細胞凋亡[17]。

本實驗結果顯示，大鼠離心運動后即刻XIAP蛋白表達開始明顯增加，之后至48 h升至最高，72 h有所下降但仍明顯高于安靜對照組水平。同時，采用實時定量PCR的方法檢測XIAP mRNA的轉錄水平發(fā)現(xiàn)，運動后即刻骨骼肌XIAP mRNA水平開始上升，12 h明顯升高，至24 h達到最高峰，之后至72 h已基本恢復正常。XIAP蛋白表達和mRNA水平都明顯升高，二者不同是，XIAP蛋白表達在運動后48 h到達最高峰，而mRNA水平則在運動后24 h升至最高。原因可能是：（1）XIAP mRNA因其穩(wěn)定性差而降解速率快，而蛋白降解速率慢導致有累積效果；（2）基因翻譯成蛋白質存在滯后性。

3.4 一次離心運動對骨骼肌XIAP和Omi結合作用的影響

本研究已證實離心運動能明顯上調(diào)骨骼肌組織XIAP和Omi的表達，推測XIAP和Omi均在運動誘導的骨骼肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已證實了XIAP是Omi新的絲氨酸蛋白酶底物，Omi可以通過N-端的AVPI序列與XIAP的BIR2和BIR3結構域結合，釋放和活化與BIR2結合的Caspase-3，以及釋放和活化與BIR3結合的Caspase-9，進而發(fā)揮其促凋亡效應。此外，Omi對XIAP的降解是不可逆的酶促反應。湯英姿等[18]在活HeLa細胞中，利用熒光共振能量轉移技術直接證實XIAP與Omi在部分細胞中存在相互作用。

為了分析XIAP和Omi在骨骼肌細胞凋亡中的作用機制，本研究使用免疫共沉淀的方法驗證了骨骼肌中XIAP和Omi之間是否存在相互結合作用。結果顯示，與安靜對照組相比，大鼠骨骼肌組織XIAP和Omi的結合量在離心運動后各時間點分別增高了2.52倍、6.92倍、9.22倍、8.07倍和8.36倍。提示，在離心運動誘導的骨骼肌細胞凋亡過程中，XIAP與Omi存在相互結合作用。這就意味著，在離心運動誘導骨骼肌細胞凋亡過程中，Omi可能一方面通過直接結合XIAP來終止XIAP對Caspase-9或Caspase-3的抑制作用，導致凋亡的發(fā)生；另一方面，通過自身的絲氨酸蛋白酶活性直接降解XIAP，發(fā)揮非依賴于Caspase途徑的促凋亡效應。

4 結論

離心運動能夠激活骨骼肌組織Caspase-9和Caspase-3的活性，誘導Omi和XIAP的表達上調(diào)，促進XIAP與Omi相互結合，Omi可能在促使凋亡過程中發(fā)揮重要介導作用。

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MechanismofOmiinEccentricExercise-inducedSkeletalMuscleInjuryinRat

ZHAO Xiaoqin1，SUN Junzhi2，BAI Shengchao3，LI Junping3，ZHOU Yue3，WANG Ruiyuan3
（1.School of PE，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024，China；2.Dept.of Journal，Chengdu Sport University，Chengdu 610041，China；3.Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China）

Objective：The aim of the present study is to investigate the change of Omi in skeletal tissue injury after eccentric exercise and the underlying mechanism.Methods：36 Adult SD rats，8 weeks aged，were randomly divided into two groups：control group and five kinds exercise groups which included 0 h after exercise，12 h after exercise，24 h after exercise，48 h after exercise and 72 h after exercise.The exercise groups were made to run on amotor-driven for one-off eccentric exercise.The rats were sacrificed in batches at different time points after exercise，then the soleues were saved to measure.Caspase-3 and-9 were determined by flurometric immunosorbent enzyme assay method.Protein and mRNA levels of Omi，XIAP were determined by Western blot and Real time PCR，respectively.The combination of XIAP and Omi was determined by Co-IP.Results：Compared with those in control group，Caspase-3 and-9 activity were significantly increased after eccentric exercise；Protein expression and mRNA levels of Omi，XIAP were significantly increased after eccentric exercise.Eccentric exercise improved the combination of XIAP and Omi.Conclusions：Eccentric exercise can increase the expression of Omi and XIAP，improve the combination of XIAP and Omi，induce enhanced Caspase-9 and-3 activity and then induce skeletal muscle cell apoptosis.

eccentric exercise；skeletal muscle；cell apoptosis；OMI；XIAP

G 804.2

：A

：1005-0000（2015）02-110-05

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2015.02.004

2015-01-27；

2015-03-15；錄用日期：2015-03-16

國家自然科學基金項目（項目編號：31471133）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助課題（項目編號：2014SYS005）；太原理工大學人才基金資助項目（項目編號：tyut-rc201452a）

趙曉琴（1982-），女，山西古交人，博士，講師，研究方向為運動對骨骼肌損傷的影響。

1.太原理工大學體育學院，山西太原030024；2.成都體育學院期刊部，四川成都610041；3.北京體育大學運動人體科學學院，北京100084。